Articles

Vad är Widefield Imaging?

by admin

Introduktion

Alla mikroskoptekniker där hela provet exponeras för ljus kallas widefield imaging. Motsvarigheten till widefield är konfokal, där stifthål används för att blockera det mesta av ljuset till och från provet. Den här artikeln kommer att diskutera widefield-avbildning och de mest använda widefield-teknikerna inom mikroskopi.

Widefield-mikroskop

I widefield belyses hela provet av en lampljuskälla antingen underifrån (ett stående mikroskop) eller ovanifrån (ett inverterat mikroskop). Upprättstående mikroskop används ofta med fixerade prover, t.ex. celler eller vävnader som har behandlats och monterats på objektglas, medan inverterade mikroskop ofta är bättre för att avbilda ett prov som är nedsänkt i en vätska, eftersom det vanligtvis sjunker till botten och är lättare att se underifrån med deras mikroskopobjektiv. Detta gör det möjligt att avbilda suspensionsceller, eftersom celler som studeras inom biovetenskaperna vanligtvis antingen är adherenta (växer fast på en yta) eller växer i suspension (celler som är suspenderade i en vätska). Exempel på ett upprätt och ett inverterat mikroskop kan ses i figur 1.

Figur 1: Upprätt respektive inverterat mikroskop. Vänster) Upprätt mikroskop: bilden observeras uppifrån och belyses underifrån. Höger) Inverterat mikroskop: bilden observeras underifrån och belyses uppifrån. Båda mikroskopen kan också använda epifluorescerande belysning där ljuskällan och bilden går genom samma objektiv. Transbelysning omfattar tekniker som faskontrast och DIC, som diskuteras nedan. Bild från Molecular Probes.

Vidfältsmikroskop använder vanligtvis en vit ljuskälla (t.ex. en lampa) räcker med vissa filter för fluorescensarbete. Detta gör också avbildningen enklare och bildfilstorlekarna mindre, vilket gör det lättare att arbeta med widefield för tillämpningar som celldokumentation.

Widefield Techniques

Exempel på widefield-mikroskopitekniker är ljusfält, differentiell interferenskontrast (DIC), faskontrast och widefield-fluorescens.

Högfältigfältmikroskopi är en lättillgänglig form av mikroskopi, där hela provet belyses av ett starkt ljus. Detta tillvägagångssätt kräver lite provberedning och kan användas för att snabbt och enkelt kontrollera levande celler eller för att producera kompletterande data. Användning av ett kontrastmedel rekommenderas dock starkt eftersom de flesta cellprover är genomskinliga och kommer att vara svåra att lösa upp utan färgämne eller färgämne. Celler består mestadels av vatten och när de avbildas på klart glas eller plast kan det vara svårt att urskilja mindre strukturer utan ytterligare kontrast.

För differentiell interferenskontrast (DIC) belyses provet med ljus som delas upp i två polariserade ljusstrålar, när dessa strålar återkombineras syns skillnaderna i fasförskjutning som kontrast i den slutliga bilden. I likhet med faskontrast lämpar sig denna teknik inte för tjockare prover och kräver mer av en teknisk uppsättning än andra tekniker.

Fasekontrastmikroskopi ger bättre kontrast än brightfield genom att använda spridt ljus från provet. Genom att belysa provet med en ring av ljus och ha en annan ring framför mikroskopets sökare visas delar av provet som sprider ljuset på olika sätt som mörkare eller ljusare på bilden, vilket ger mer kontrast än vanlig ljusfältsmikroskopi. Denna förbättrade kontrast syns inte på tjockare prover eftersom det ger upphov till artefakter, men fungerar bra med cellkulturer. Ett exempel på dessa ringar kan ses i figur 2.

Figur 2: Den översta bilden visar ett mikroskop med skjutreglage för ljusfält och faskontrast, där den högra cirkeln används för ljusfält och de andra två för faskontrast, beroende på förstoringsgrad (4x och 10/20/40x som visas). Den nedre bilden visar prover som avbildats med DIC eller faskontrast och skillnaderna mellan dessa tekniker. Bilderna är anpassade från Eurotek, Olympus.

Widefield fluorescensmikroskopi liknar brightfield men specifika våglängder av ljus används för att excitera fluorescerande molekyler som provet har förbehandlats med (även om vissa prover är naturligt autofluorescerande). Proverna kan färgas med fluorescerande markörer för specifika proteiner eller cellkomponenter, och sedan bildas en bild av det fluorescerande emissionsljuset från dessa markörer. Fluorescenssignalen innebär bättre kontrast jämfört med andra tekniker, eftersom det är endast de fluorescerande molekylerna som avger ljus genom att använda specifika våglängder av ljuset, i motsats till att hela bilden lyser upp. Eftersom hela provet belyses med detta ljus kan dock fluorescenssignalerna utanför betraktningsområdet orsaka bakgrundsfluorescens och suddiga bilder.

Figur 3: DIC vs fas-kontrast vs fluorescensmikroskopi för samma neuronprov. Vänster) DIC, celler kan identifieras men inte axoner, kontrasten är dålig. Mitt) Fasskontrast, större kontrast än DIC med celler och axoner lätt identifierade. Höger) Widefield-fluorescens, celler och axoner identifieras lätt, med utvalda proteiner ytterligare markerade i färg av fluorescerande markörer (grönt för β-tubulin, en neuronal markör, blått för DAPI, en kärnmarkör). Bild från Leica Microsystems: Den största nackdelen är att när hela provet belyses, medan fokalplanet tar emot ljus och kan generera en bild, tar även planen ovanför och under fokalplanet emot ljus, vilket resulterar i ljus som inte är i fokus och som orsakar bildförstöring. Särskilt när det gäller fluorescens excitation är upplösningen hos ett system med brett fält begränsad på grund av att bakgrundsfluorescensen också fångas av kameran och minskar förhållandet mellan signal och brus.

Vissa bredfältstekniker undviker detta problem, t.ex. strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), som använder ljusmönster för att generera ett komplext mönster, där avbildning baserad på mönsterinterferens möjliggör superupplösningsnivåer av detaljrikedom, med en upplösning av objekt som är så små som 200 nm. Mer om SIM kan läsas i SIM-appnoten på vår webbplats.

Sammanfattning

Widefield imaging är grunden för de flesta cellstudier, vilket gör det möjligt för forskare att snabbt och enkelt avbilda prover med låga nivåer av provpreparering eller teknisk expertis som krävs. Från brightfield till fluorescensavbildning är widefield en kraftfull och varierad teknik som många forskare är bekanta med. Även om tekniken kan sakna upplösning jämfört med konfokal eller andra avancerade mikroskopitillämpningar, har widefield imaging en fast plats inom forskningen och kommer att fortsätta att utvecklas med tiden.