av Sara Ryding, B.Sc.Granskad av Deepthi Sathyajith, M.Pharm.

Whole genome bisulfite sequencing, eller WGBS, är en nästa generations sekvenseringsteknik för att analysera DNA-metylering.

Image Credit: Egorov Artem /

DNA-metylering är en epigenetisk mekanism för att reglera genuttryck och innebär att en metylgrupp läggs till en cytosinbas. Onormala metyleringsmönster har förknippats med flera tillstånd och sjukdomar, till exempel cancer. Sedan utvecklingen av WGBS har den tillämpats för att studera epigenetisk omprogrammering, epigenetiska signaturer och annat.

Grundläggande metodik

WGBS kombinerar användningen av natriumbisulfatbehandling och DNA-sekvensering med hög kapacitet. Natriumbisulfit skyddar metylerade cytosiner, eller metylcytosiner, från omvandling, medan ometylerade cytosiner omvandlas till uracil.

De ometylerade cytosinerna omvandlas sedan vidare till tymin efter PCR, vilket innebär att sekvenseringsresultaten visar övervägande adenin-, guanin- och tyminbaser, med eventuella cytosinbaser som indikerar metylerade cytosinställen.

Metoden försökte man inledningsvis med på Aradopsis thaliana, en växt, på grund av dess relativt lilla genom. Den har sedan dess visat sig kunna analysera omkring 90 % av alla cytosiner som har försökts. WGBS-tekniken har tillämpats på genomet hos människor, möss, majs och sojabönor.

Stemcellstillämpningar

Stemceller är odifferentierade celler som behåller förmågan att bli vilken typ av cell som helst, till exempel neuroner eller muskelceller. Detta gör dem av stort intresse för utvecklingsbiologer och eventuella tillämpningar inom medicinen, för att förstå vad som skiljer dem från mogna celler.

De första kartorna över hela genomet, med upplösning på en enda bas, av metylerade cytosiner i mänskliga embryonala stamceller och fibroblaster från foster, visade stora skillnader mellan de två. I embryonala celler var nästan en fjärdedel av all identifierad metylering i en icke-cytosin-guanin (CG)-kontext, medan 99,98 % av metylcytosinerna i fostercellerna var i GC-kontext.

Non-CG-kontext innebär att det var i CHG eller CHH, där H representerar adenin, tymin eller cytosin. Tidigare trodde man främst att nästan all metylering av däggdjurs-DNA skedde i CG-kontexten, medan denna studie visade att det kan vara ett allmänt kännetecken i mänskliga embryonala stamceller.

Non-CG-metylering tycktes försvinna vid differentiering. Icke-CG-metyleringen återställdes när fosterceller manipulerades till inducerade pluripotenta stamceller. Detta visar också att CHG- och CHH-metylering inte beror på genetiska skillnader, utan istället är en egenskap hos embryonala stamceller.

Den tidigare studien visade att stamceller, vare sig inducerade pluripotenta stamceller eller embryonala stamceller, delade epigenetiska egenskaper genom metylering. Stamceller är oerhört viktiga för terapeutiska ändamål och för studier av sjukdomar. De skiljer sig från somatiska celler genom epigenomiska omvandlingar, snarare än genetiska, vilket gör det mycket intressant att studera deras metyleringsmönster.

En uppföljande studie fokuserade på skillnaderna mellan embryonala stamceller och inducerade pluripotenta stamceller och fann att även om deras metyleringsmönster är mycket likartat på global nivå, uppvisar de inducerade pluripotenta stamcellerna en avsevärd variation i omprogrammering jämfört med embryonala stamceller. Även om WGBS har bidragit till att klarlägga mycket om stamceller återstår alltså fortfarande vissa frågor.

WGBS i utvecklingsbiologi

DNA-metylering är viktigt under normal utveckling hos däggdjur. I synnerhet är icke-CG-metylering utbredd i pluripotenta stamceller och oocyter.

Forskare har använt WGBS för att utforska detta koncept ytterligare och har funnit att nästan två tredjedelar av all metylering i oocyter med groddblåsor från musen sker i ett icke-CG-sammanhang. De fann också att metyleringen av icke-CG-platser ackumulerades under oocytens tillväxt.

Non-CG-metylering tycktes vara beroende av ett fåtal metyltransferaser i synnerhet, nämligen DNA-metyltransferaskomplexet, det vill säga Dnmt3s-Dnmt3L-komplexet. Dnmt1 tycktes däremot upprätthålla CG-metylering.

Arv av epigenetisk programmering är vanligare hos växter än hos däggdjur. I en studie med fokus på metylering fann man att genom att använda WGBS bevarade växternas könsceller CG- och CHG-metylering. Detta står i kontrast till däggdjur där CHH-metylering går förlorad i mikrosporer och spermier. Den återställs dock av de novo DNA-metyltransferas styrt av små RNA efter befruktning.

WGBS för tidig diagnos av sjukdomar

Studier har visat att WGBS kan användas för att upptäcka onormal metylering genom att screena efter specifika hypermetylerade suppressorgener som ses i cancerformer som akut promyelocytär leukemi, magsäckscancer och så vidare.

Användningar av WGBS inom rättsmedicin

Forensiska studier har utförts på torkade blodprov med hjälp av WGBS efter DNA-extraktion. Användningen av WGBS ger högkvalitativa prover som förbättrar analysen av DNA-metylering på rättsmedicinska fläckar.

Sammanfattningsvis blir WGBS alltmer populärt i studiet av DNA-metylering på grund av denna tekniks förmåga att skatta DNA-metylering av bisulfitkonverterat genomiskt DNA med en upplösning på en enskild nukleotid.

Och även om WGBS är ett mycket effektivt verktyg för att förstå epigenetisk omprogrammering är det lika viktigt att utveckla och upprätthålla en kostnadseffektiv högsekvenseringsteknik som kan användas inom olika områden av vetenskaplig forskning.

Fortsatt läsning

• Allt innehåll om DNA-sekvensering
• DNA-sekvensering
• DNA-sekvensmontering
• DNA-mikroarray
• Hög-throughput DNA Sequencing Techniques

Skrivet av

Sara Ryding

Sara är en passionerad skribent inom biovetenskap som specialiserat sig på zoologi och ornitologi. Hon håller för närvarande på att slutföra en doktorsexamen vid Deakin University i Australien som fokuserar på hur fåglarnas näbbar förändras med den globala uppvärmningen.

Citat

.