Vitröta svampar omvandlar herbicider

Det är väldokumenterat att ett brett spektrum av föroreningar, inklusive bekämpningsmedel, omvandlas och bryts ned av vitröta svampar: Pentaklorfenoler, isoproturon, derivat av isoxaflutol, atrazin, simazin, propazin, lindan, atrazin, diuron, terbuthylazin, metalaxyl, DDT, dieldrin, aldrin, heptaklor, klordan osv. . Denna förteckning kan komma att utökas med tanke på de starka bevisen för WRF:s nedbrytningspotential för olika klasser av föroreningar. Uppgifterna om nedbrytning av herbicider med WRF sammanfattas delvis i tabell 2. Det bör nämnas att ett stort antal arbeten har utförts under stationära förhållanden på flytande medier och fermenteringsförhållanden i fasta system. Det finns dock motstridiga uppgifter om nivån på herbicidnedbrytningen, de ligninolytiska enzymernas roll i detta förfarande och nedbrytningsmekanismen.

Vissa svampar, såsom Agrocybe semiorbicularis, Auricularia auricula, Coriolus versicolor, Dichomitus squalens, Flammulina velupites, Hypholoma fasciculare, Pleurotus ostreatus, Phanerochaete velutina och Stereum hirsutum har visat sig ha förmågan att bryta ned olika herbicider som atrazin, diuron och terbuthylazin med olika effektivitet. Coriolus versicolor, Hypholoma fasciculare och Stereum hirsutum bryter ned mer än 86 % av diuron, atrazin och terbuthylazin på sex veckor. De var också de mest aktiva när det gäller produktion av ligninolytiska enzymer. WRF:s förmåga att bryta ned aromatiska herbicider, diuron, atrazin och terbutylazin, korrelerade dock inte med deras ligninolytiska aktivitet som bestämdes i Poly R-478-avfärgningstestet (som används som en indikator på ligninolytisk aktivitet). Den möjliga förklaringen till dessa resultat var skillnaden i LME-mönster som produceras av svampar i flytande kulturer. Det är intressant att den mest effektiva stammen S. hirsutum i fältförsök var inaktiv när det gäller nedbrytning av herbicider, medan de andra stammarna C. versicolor och H. fasciculare uppvisade 30 % nedbrytning av kloropyriphos på 6 veckor.

Vitrotsvamparna Phanerochaete chrysosporium och Trametes versicolor omvandlade upp till 35-40 % diketonitril (en jordtransformationsprodukt av herbiciden isoxaflutol) till en inaktiv bensoesyraanalog efter 15 dagar under stationära förhållanden på flytande medier . Nivån av ligninolytiska enzymer, t.ex. laccaser, som produceras under jäsningen tycktes korrelera med nedbrytningen av herbiciden, vilket bekräftar att dessa enzymer spelar en viktig roll i nedbrytningsprocesserna. Författarna underströk dock att induktion av laccasproduktion sex gånger genom tillsats av 2,5-xylidin inte ledde till någon signifikant ökning av diketonitrilklyvningen.

Det visades att Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea och samodlade Coriolus hirsutus/Cerrena maxima kan bryta ned atrazin under submergerad odling; herbicidborttagningen var 77-91 % efter 40 dagars odling. Det är intressant att nämna att försumbara mängder atrazin absorberades av mycelet. Aktiviteten hos laccas var ganska hög, vilket gör det möjligt att föreslå att laccas deltar i atrazinnedbrytningen hos dessa svampar. Denna hypotes stöddes av studien av atrazinnedbrytning i närvaro av laccasinducerare (guayacol och syringaldezin) vid odling under vatten. Effekten av herbicidnedbrytningen var högre i inducerade kulturer med 78-98 % och den högsta nivån av atrazinborttagning uppnåddes för Coriolopsis fulvocinerea med guaiacol som inducerare.

Hiratsuka et al. rapporterade att Coriolus versicolor IFO 30340 bröt ned 30 % av klornitrofen (CNP) och 80 % av nitrofen (NIP) efter 12 dagars odling under stationära förhållanden på flytande medier. Herbicidnedbrytningshastigheten var beroende av kvävekoncentrationen i medierna och var högre under förhållanden med lågt kväve, vilket tyder på att det ligninnedbrytande systemet var ansvarigt för herbicidnedbrytningen. LiP, MnP och laccas samt kulturfiltrat oxiderade dock inte herbicider. Varken klonitrofen eller nitrofen oxiderades av systemet laccas – redoxmediator med HBT, som är en välkänd laccasredoxmediator. Dessa resultat leder till slutsatsen att extracellulära ligninolytiska enzymer inte var inblandade i det första steget i CNP- eller NIP-nedbrytningen av Coriolus versicolor IFO 30340. Den sekventiella identifieringen av produkter som bildas under metabolismen av CNP och dess intermediärer i C. versicolor gjorde det möjligt för författarna att föreslå fyra olika vägar för nedbrytning av CNP: aromatisk hydroxylering, oxidativ deklorering, reduktiv deklorering och reduktion av nitrogruppen till amin. Den aromatiska hydroxyleringen till 2,4,6-triklor-3-hydroxi-4′-nitrodifenyleter och den oxidativa dekloreringen till 2,4-diklor-6-hydroxi-4′-nitrodifenyleter antogs katalyseras av enzym(er) av cytokrom P450-typ, eftersom dessa vägar effektivt stängdes av genom exogen tillsats av piperonylbutoxid, en P450-hämmare. Omvandlingen av CNP till NIP av Coriolus versicolor IFO 30340 bör vara reduktiv deklorering. Reduktiva dekloreringsreaktioner var inblandade i nedbrytningen av pentaklorfenol av P. chrysosporium . CNP omvandlades också till 2,4,6-triklor-4′-aminodifenyleter av C. versicolor. De reduktiva deklorerings- och nitroreduktionsreaktionerna konstaterades också vara initiala reaktioner vid CNP-nedbrytning, vilka förstärktes vid tillsats av cytokrom P450-hämmaren. Aromatisk hydroxylering och oxidativ deklorering observerades också under svampens omvandling av NIP; De bildade produkterna identifierades dock inte – de antogs vara antingen 2,4-diklor-3-hydroxi-4′-nitrodiphenyleter eller 2,4-diklor-6-hydroxi-4′-nitrodiphenyleter och 2-chlor-4-hydroxi-4′-nitrodiphenyleter respektive 2-hydroxi-4-chlor-4′-nitrodiphenyleter. Svampens omvandling av NIP hämmades också effektivt av piperonylbutoxid.

Baserat på det erhållna resultatet antog författarna att cytokrom P450 spelade en viktig roll för att sänka joniseringspotentialen hos miljömässigt persistenta aromater och för att tillhandahålla lämpliga substrat för ligninolytiska en-elektron-oxiderande enzymer för effektiv nedbrytning. När difenyleter, 4-klordifenyleter och 4-nitrodifenyleter tillsattes till svampkulturen identifierades 4-hydroxidifenyleter, 4-chlor-4′-hydroxidifenyleter och 4-nitro-4′-hydroxidifenyleter som de viktigaste produkterna. 4-klorfenol och 4-nitrofenol påvisades i spårmängder från 4-klorodifenyleter respektive 4-nitrodifenyleter, men motsvarigheten hydrokinon observerades inte. Dessa uppgifter tyder på att bildandet av fenoliska produkter från antingen CNP:s A- eller B-ring kan härledas via en annan väg och att den direkta eterklyvningen kanske inte har ägt rum. Dessa resultat gav bevis för att svamparna bryter ned herbicider via olika vägar med hjälp av sina multipla metaboliska system.

Ganoderma lucidum visade sig vara resistent mot herbiciderna diuron och bentazon : de övre gränserna var 80 µM respektive 20 mM. Detta resultat kan förklaras av högre toxicitet hos de metaboliter som bildas vid omvandling av diuron. Det har tidigare rapporterats att vissa av de metaboliter som uppstår vid svamptransformation av diuron kan vara ännu giftigare än moderföreningen. G. lucidum kunde effektivt avlägsna 55 % av diuron och 88 % av bentazon efter 10 dagars odling i flytande kulturer. Både bentazon och diuron förbättrade kraftigt svampens produktion av laccas genom att inducera en av de två isoformerna av laccas. Native PAGE-analys av de extracellulära enzymerna visade att förbättringen av laccasaktiviteten som svar på herbiciderna inte berodde på att ett nytt laccas uttrycktes, utan att den berodde på överproduktion av en redan existerande isoform i de icke-inducerade kulturerna. Liknande resultat erhölls med Trametes versicolor och Abortiporus biennis , där deras konstitutiva laccaser överproducerades i närvaro av paraquat, en kvaternär kväveherbicid. Den elektroforetiska analysen av extracellulära enzymer från G. lucidum visade att laccas1 var det dominerande enzymet under icke-inducerade förhållanden. Intressant nog inducerade herbiciderna endast isoformen laccas2 medan laccas1 undertrycktes i dessa kulturer. Sådana resultat tyder på att laccas2 troligen är den isoform som är mer intensivt involverad i svampens försvarssystem, med tanke på att båda herbiciderna kraftigt hämmade svampens tillväxt. Dessa observationer visar att dessa typer av enzymer har, åtminstone delvis, en viktig roll i nedbrytningen av föroreningar under in vivo förhållanden.

Den jämförande studien av herbiciden bentazons nedbrytning av Ganoderma lucidum i flytande och fasta kulturer med majskolvar som substrat har utförts . Svampen var mer motståndskraftig mot herbiciden och effektivare i nedbrytningen i fasta kulturer jämfört med flytande kulturer: 50 mM mot 20 mM och 90 % mot 55 %. Författarna föreslog två möjliga förklaringar som inte utesluter varandra: en lägre tillgänglighet till herbiciden på grund av dess adsorption till det olösliga substratet majskolv för denna observation och den högre aktiviteten hos både laccas och Mn-peroxidas i fasta kulturer jämfört med flytande kulturer, där den höga laccasaktiviteten upptäcktes. Inga metabolitprodukter hittades dock i de kombinerade vatten- och metanoliska extrakten. G. lucidum råfiltrat som innehåller laccas och Mn-peroxidas har visat sig bryta ned bentazon in vitro. Försöken med tillsats av Mn2+, ABTS, Tween 80 och H2O2 till råfiltraten visade på synergier i nedbrytningen av bentazon, vilket tyder på att både laccas och Mn-peroxidas var inblandade i nedbrytningen. Det är välkänt att ABTS förmedlar oxidationen av icke-fenoliska ligninföreningar och att närvaron av omättade fettsyror (Tween 80) förbättrar den oxidationsprocess som katalyseras av Mn-peroxidas och laccas på grund av produktionen av lipidperoxyl- eller alkoxylradikaler. Den hypotetiska mekanismen för nedbrytning av bentazon kan vara följande Mn-peroxidas och laccas genererade lipidperoxyl- eller alkoxylradikaler; i närvaro av dessa radikaler oxiderar Mn-peroxidas Mn2+ till Mn3+, som i sin tur oxiderar bentazon, medan laccas använder ABTS som redoxmediator för oxidation av bentazon. Ingen nedbrytning av picloram G. lucidum och Trametes sp. observerades dock i vätskekulturer, kanske på grund av att den aromatiska ringen i hög grad är substituerad. Denna herbicid ökade Trametes sp:s produktion av laccas, medan G. lucidums enzymproduktion undertrycktes. Författarna antog att hämning av enzymproduktionen kan ske på mRNA-nivå efter det att picloram har trängt in i cellen eller genom enzymmodifiering före eller efter sekretion . Exponeringen av G. lucidum och Trametes sp. för picloram avslöjade en speciell mekanism för övergående bioackumulering av herbiciden hos båda svamparna.

Den mest studerade WRF är P. chrysosporium, som visat sig kunna bryta ned ett brett spektrum av herbicider under olika förhållanden. MCPA och bentazon bröts ned av P. chrysosporium till 65 % respektive 75 % på 20 dagar. P. chysosporium bryter ned isoproturon som tillhör fenylureagrupperna , atrazin och även diuron . Enligt , observerades dock ingen nedbrytning av atrazin av denna svamp i flytande kulturer. P. chrysosporiums nedbrytningseffektivitet var högre i fasta kulturer jämfört med flytande kulturer . Två mekanismer för nedbrytning av herbicider föreslogs: verkan av ligninolytiska enzymer och verkan av intracellulära enzymer, särskilt cytokrom P450. I , studerades P. chrysosporiums nedbrytning av diuron med hjälp av P. chrysosporium, inklusive identifiering av de produkter som bildas och utvärdering av cytokrom P450:s roll. Två resultat var av stor betydelse: de betydande mängder diuron, DCPMU och DCPU som hittades i färska mycel och inhiberingen av diuronnedbrytningen med ABT (1-aminobenzotriazol), en cytokrom P450-hämmare. Dessa resultat bekräftade den intracellulära mekanismen för nedbrytning av denna herbicid som resulterar i N-demetylering. Efter fem dagar var dock koncentrationerna av DCPMU och DCPU högre i kulturfiltraten än i myceliaextrakt, vilket tyder på att lignolytiska enzymer kan vara inblandade i nedbrytningen av dessa metaboliter. Enligt da Silva Coelho-Moreira et al. bröt enzymatiska råextrakt som tillfördes kombinationer av veratrylalkohol H2O2 och Mn2+ inte nedbrytningen av herbiciden, det är möjligt att DCPMU och DCPU kan omvandlas ytterligare av MnP.

P. chrysosporium kan också omvandla atrazin, dess omvandlingsprodukt och andra s-triazinherbicider. Det första och viktigaste steget i svampens nedbrytningsväg för klorerade s-triazin var mono-N-dealkylering. Hydroxyatrazin var den viktigaste nedbrytningsprodukten som hittades i jordar som behandlats med atrazin och i flytande kulturer. P. chrysosporium omvandlade aktivt hydroxyatrazin till en okänd förening som ackumulerades i kulturmediet. Det fastställdes att närvaron av både alkylgrupper och klor i 2-positionen är nödvändig för att P. chrysosporium ska kunna mono-N-dealkylera atrazin. Följaktligen bör bildandet av desetylhydroxyatrazin i flytande kulturer vara ett resultat av hydrolys av deetylatrazin. Försök med terbutylazin, atrazin och simazin visar också att avlägsnandet av etylsidekedjan är den föredragna reaktionen och kan bero på massan av den andra alkylgruppen. Med andra ord förväntas föreningar med en grupp med hög massa kopplad till en aminosubstituent genomgå en högre N-dealkylering som påverkar den andra kedjan. De symmetriska föreningarna propazin och simazin bröts också ned i långsammare takt än atrazin. Varken LiPs eller MnPs omvandlade atrazin och dess N-dealkylerade metaboliter. Det visades att atrazinets N-dealkylering minskade i närvaro av cytokrom P450-hämmare. Dessutom stöddes herbicidnedbrytningen av mycelium. Man antog därför att cytokrom P450 är inblandat i nedbrytningen av atrazin. Dessa uppgifter är i linje med tidigare publicerade studier av atrazinnedbrytning av Pleurotus pulmonarius, där enzymer som lipoxygenas, peroxidas och cytokrom P-450 var inblandade. Mn2+, som aktiverar dessa enzymer, stimulerade omvandlingen av atrazin till N-dealkylerade och propylhydroxylerade metaboliter, medan antioxidanter och hämmare av lipoxygenas och peroxidas (nordihydroguaiaretiksyra) samt cytokrom P-450 (piperonylbutoxid) undertryckte nedbrytningen.

För att analysera de data som presenteras i tabell 2 beräknades herbicidernas försvinnandegrad som kvoten mellan försvinnandegrad (%) och nedbrytningstid (dagar), följt av en beräkning av medelvärdet för varje herbicid (fig. 1). Med hänsyn till effekten av odlingsförhållandena på herbicidnedbrytning av svampar behandlades endast data om stationära förhållanden på flytande medier på detta sätt.

De erhållna resultaten stämmer väl överens med studien , där det fastställdes att närvaron av alkylgrupper är nödvändig för att P. chrysosporium skall kunna bryta ned s-triazinherbicider genom mono N-dealkylering. Dessutom verkar WRF-svamparnas förmåga att bryta ned s-triaziner öka med ökningen av mängden exakt förgrenade alkylgrupper. Detaljerade kvantitativa studier av struktur- och nedbrytningsaktivitet bör dock genomföras för att bevisa eller motbevisa denna preliminära observation. En annan viktig slutsats är att klor i herbicidmolekylen har en markant negativ inverkan på nedbrytningshastigheten, vilket framgår av jämförelsen mellan nedbrytningshastigheten för nitrofen (en atom klor) och klornitrofen (tre atomer klor) och den högsta nedbrytningshastigheten för bentazon, som är det enda klorfria herbicidet i det presenterade intervallet (fig. 1). De uppgifter som presenteras i figur 1 visar därför tydligt att det är absolut nödvändigt med ytterligare QSAR-studier. Tillsammans med kunskap om de viktigaste enzymatiska vägarna för herbicidnedbrytning kommer dessa att avsevärt förbättra den preliminära bedömningen av WRF:s nedbrytningsförmåga i förhållande till herbicider med känd struktur.

De motsägelsefulla uppgifterna om ligninolytiska enzymers medverkan i herbicidnedbrytning och -omvandling har inte gjort det möjligt att fastställa deras exakta roll i dessa processer. Vi har sammanfattat uppgifterna om effektiviteten hos enskilda ligninolytiska enzymer, deras blandningar och system av enzymer och redoxmediatorer vid nedbrytning av herbicider i tabell 3. Som framgår observerades ingen nedbrytning av diketonitril, diuron, atrazin, klornitrofen, nitrofen och glyfosat för råextrakt av MnP och LiP och renade enzymer från P. chrysosporium, Trametes versicolor och Coriolus versicolor, inte ens i närvaro av redoxmediatorer . MnP från P. chrysosporium bröt dock ner Irgarol 1081 till 37 % efter 24 timmar och LiP från P. chrysosporium bröt ner bentazon till 100 % efter 4 timmar . Dessutom omvandlades bentazon effektivt av laccas med katekol, laccas och MnP-råextrakt med redoxmediatorn ABTS, rekombinant MnP . Analysen av de data som sammanfattas i tabell 3 leder till slutsatsen att MnP, laccas och laccas – redoxmediatorsystem är de mest effektiva verktygen för nedbrytning av ett brett spektrum av herbicider – diketonitril, glyfosat, Pesticide Mix 34, kloroxuron, atrazin och dymron , dock med några få undantag, nämligen choronitrofen och nitrofen . Det bör understrykas att effektiviteten hos laccas – redoxmediatorsystem mot olika herbicider är starkt beroende av vilken redoxmediator som används, vilket i sin tur beror på mekanismerna för oxidation av mediatorerna genom enzymet och reaktiviteten hos mediatorernas intermediärer.

I studien av nedbrytning av atrazin med renat laccas från Coriolopsis fulvocinerea, observerades ingen herbicidnedbrytning (Koroleva & Gorbatova, opublicerade uppgifter). Granskningen av redoxmediatorer (syringaldezin, PF6, HBT) visade att endast HBT orsakade en minskning av atrazinkoncentrationen i systemet laccase-atrazin-redoxmediator. En mer detaljerad undersökning av komponenterna i modellsystemet ”atrazin/laccas/HBT” visade att HBT själv reagerade direkt med atrazin och andra klorinnehållande atrazinderivat, utan inblandning av laccas, och att HBT inte interagerade med atrazinhydroxiderivaten. Det är känt att HBT i vattenlösning kan övergå i jonisk form. Därför har det föreslagits att två produkter kan bildas, båda bestående av HBT och atrazin, med bildandet av (-N-O-C-) bindningar i position (2) av atrazin. Tillsats av laccas till en lösning av HBT/Atr resulterade i bildandet av flera produkter, varav en av dem hade en retentionstid som motsvarade den för HBT-Atr-föreningen. Vid enzymatiska reaktioner bildades två andra produkter med retentionstider på 15,3 min och 19,4 min, som identifierades som deetylatrazin (DEA) och den förening som bildas genom interaktion mellan DEA och HBT. Tillsatsen av enzym resulterade alltså i bildandet av nya produkter som skiljer sig från de produkter som bildas vid HBT:s reaktion med atrazin. Modellsystemet ”atrazin/laccas/HBT” studerades vid olika molförhållanden mellan atrazin och förmedlare (9:1 till 1:9) och vid två olika koncentrationer av enzym (0,02 μm och 1,0 μm). Den djupaste atrazinomvandlingen – upp till 70 % på 10 dagar – observerades vid HBT/Atr-förhållandet 9/1 och enzymkoncentrationen 0,02 μm. Med hjälp av protonkärnmagnetisk resonans (1H-NMR) och HPLC-MS/MS kunde produktidentifieringen bekräftas i modellsystemen ”Atr/HBT” och ”Atr/HBT/laccase”: bildning av Atr-HBT i ”Atr/HBT”-systemet och DEA och DEA-HBT i ”Atr/HBT/laccase”-systemet. Atr-HBT fanns i två former: protonerad (M.W. 315 g/mol) och diprotonerad (M.W. 316 g/mol). I reaktionen ”Atr/HBT/laccase” bildas DEA samt protonerade (M.W. 287 g/mol) och diprotonerade (M.W. 288 g/mol) former av produkten DEA-HBT. Baserat på de data som erhållits för de fem etablerade strukturerna av produkterna har vi föreslagit atrazinoxidationsschemat genom ”laccas/HBT”-systemet (fig. 2), som omfattar icke-enzymatiska och enzymatiska steg (fig. 3).

Under det icke-enzymatiska skedet bildas en produkt bestående av atrazin och HBT. Eftersom substraten och produkterna i ”Atr/HBT”-systemet är i jämvikt, orsakar tillsatsen av laccas till reaktionen oxidation av HBT och bildning av HBT-radikal. HBT-radikalen reagerar med Atr-HBT-föreningen och utlöser dissociation av (-NH-CH-) bindningarna, vilket resulterar i bildandet av DEA-HBT och etylalkohol. DEA-HBT sönderdelas i sin tur och bildar två produkter: DEA och HBT. HBT:s förmåga att bilda tautomera former och att reagera direkt med atrazin tyder på att HBT skulle brytas ned i reaktionsblandningen. Enligt det föreslagna schemat bildades dock DEA och HBT under hydrolysen av DEA-HBT. Detta kan vara en av orsakerna till HBT:s effektivitet som redoxmediator i laccas – redoxmediatorsystemet.

Den höga potentialen hos WRF samt deras ligninolytiska enzymer vid herbicidomvandling är väl dokumenterad. Trots detta är nedbrytningsmekanismerna och nedbrytningsvägarna för många herbicider fortfarande inte utforskade. Ytterligare studier behövs för att belysa mekanismen för herbicidnedbrytning av WRF och ligninolytiska enzymer och identifiera de metaboliter som bildas.