Un ecran genetic haploid pentru dependența de glucoză

Multe linii celulare imortalizate prezintă o flexibilitate nutrițională limitată și sunt foarte dependente de glucoză ca sursă primară de carbon. Am constatat că supraviețuirea liniei celulare haploide umane Hap1 necesită glucoză în mediul de cultură. Pentru a identifica factorii implicați în această „dependență de glucoză”, am efectuat un screening genetic haploid15 pentru a izola mutanți care supraviețuiesc în absența completă a glucozei. Am mutagenetizat la întâmplare 1 × 108 celule Hap1 cu multiplicitate scăzută a infecției cu un vector retroviral de captare a genelor16 și am cultivat populația mutagenetizată în mediu cu deficit de glucoză timp de 12 zile. După ce majoritatea (>99%) celulelor au murit, au fost recuperate celulele rezistente la epuizarea glucozei și au fost extinse în mediu bogat în nutrienți. Siturile de inserție de genă-capcană din populația rezistentă au fost identificate prin secvențiere Illumina bazată pe PCR inversă17. În populația selectată, genele SLC3A2/4F2hc (399 de inserții distincte) și xCT/SLC7A11 (39 de inserții) au fost întrerupte la o frecvență ridicată prin integrare retrovirală (Fig. 1a). În mod remarcabil, se știe că produsele proteice ale acestor gene interacționează fizic, cu subunitatea SLC3A2 numită lanț greu și subunitatea SLC7A11 numită lanț ușor, pentru a forma antiportorul de aminoacizi cunoscut sub numele de sistemul xc- sau antiportorul xCT18. Antiportorul xCT este un transportor de aminoacizi de pe suprafața celulară care exportă glutamat în schimbul cistinei. Acest schimb este important pentru apărarea împotriva speciilor reactive de oxigen (ROS) celulare, deoarece cistina este dimerul oxidat al cisteinei, un precursor critic pentru sinteza glutationului (GSH), un antioxidant major19. Pentru mai multă claritate, ne referim la transportatorul funcțional ca fiind „sistemul xc-” sau „antiportorul xCT”, iar la subunitatea lanțului ușor ca SLC7A11.

(a) Reprezentarea inserțiilor gene-trap găsite în genele SLC3A2 și SLC7A11, în celulele Hap1 care au supraviețuit la epuizarea glucozei. Dreptunghiurile negre reprezintă exoni, iar semnele albastre reprezintă evenimente de inserție. Numărul de inserții gene-trap din populațiile neselectate și selectate a fost analizat prin testul Fisher exact unilateral pentru a calcula valorile P. (b) Analiza Western blot a nivelurilor SLC3A2 și SLC7A11 în celulele Hap1 WT (WT), AC6 (clona SLC7A11 cu capcană genetică) și AC24 (clona SLC3A2 cu capcană genetică). (c) Cuantificarea eliberării de glutamat în mediu. Valorile au fost normalizate față de WT. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3); **P<0,01; testul t al lui Student neperecheat. (d,e) Imagini reprezentative (d) și cuantificarea (e) a viabilității celulelor la 24 h după retragerea glucozei, cu vehicul (DMSO) sau 500 μM sulfasalazină (SASP). Bară de scară, 200 μm. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3).

Pentru a caracteriza consecințele celulare ale acestor întreruperi genetice, am izolat clone Hap1 cu inserții ale genelor SLC3A2 și SLC7A11. Mutantul SLC3A2, denumit AC24, are o inserție gene-trap în cel de-al doilea intron al SLC3A2 în orientarea așteptată pentru întreruperea genei și nu prezintă expresie SLC3A2. În plus, acesta are o expresie SLC7A11 substanțial mai mică, ceea ce este de așteptat deoarece SLC3A2 trebuie să se asocieze cu SLC7A11 pentru a forma un complex stabil (Fig. 1b). Mutantul SLC7A11, denumit AC6, are o inserție gene-trap în regiunea netranslatată 5′ a primului exon al SLC7A11 și prezintă o expresie SLC7A11 mult diminuată la nivel de proteină (Fig. 1b) și ARNm (Fig. Suplimentară 1). Nivelurile SLC3A2 sunt în mare parte neafectate în AC6, probabil deoarece subunitatea SLC3A2 este împărtășită de mai mulți transportatori de aminoacizi18. Ambele clone prezintă o eliberare mai mică de glutamat în mediu (Fig. 1c), confirmând că sistemul xc- este perturbat din punct de vedere funcțional. Este important faptul că ambele clone prezintă o viabilitate foarte îmbunătățită în condiții de deficit de glucoză (Fig. 1d,e). După 24 h de privare de glucoză, >70% din celulele ambelor clone rămân viabile, în timp ce doar 10% din celulele Hap1 parentale supraviețuiesc. În concordanță cu acest rezultat, tratamentul celulelor Hap1 cu sulfasalazină (SASP)20, un inhibitor al sistemului xc-, a îmbunătățit viabilitatea celulelor Hap1 WT după retragerea glucozei (Fig. 1d,e).

Sistemul xc- reglează viabilitatea celulară în timpul retragerii glucozei

Pentru a confirma în mod independent rezultatele screening-ului genetic, am folosit ARN-uri cu pini de păr scurt (ARNshc) pentru a elimina în mod stabil sistemul xc- în celulele Hap1 (Fig. 2a). Deoarece SLC3A2 are funcții pleiotropice ca lanț greu comun pentru mai mulți transportatori de aminoacizi18, ne-am concentrat eforturile de knockdown asupra subunității SLC7A11. Celulele care conțineau oricare dintre cele două ARNm-uri shRNA SLC7A11 independente au eliberat mult mai puțin glutamat în mediu (Fig. 2b). Acestea au prezentat o viabilitate mult îmbunătățită după retragerea glucozei (Fig. 2c). Cu toate acestea, nu a existat nicio modificare a ratei de proliferare în mediile care conțin glucoză (Fig. suplimentară 2a).

(a) Analiza prin Western blot a nivelurilor proteice SLC7A11 în celulele Hap1 SLC7A11 knockdown și în celulele HeLa care supraexprimă SLC7A11. (b) Cuantificarea eliberării de glutamat în mediu. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=4); **P<0,01; testul t al lui Student neperecheat; scr, ARNhc amestecat (scrambled shRNA). (c,d) Viabilitatea celulară la 24 h după retragerea glucozei. Celulele Hap1 SLC7A11 knockdown (c) și celulele HeLa cu supraexprimare SLC7A11 (d) au fost cultivate în mediu cu deficit de glucoză cu vehicul (DMSO), 500 μM SASP sau 4 mM dm-αKG timp de 24 h. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3); vector: vector gol.

În mod invers, ne-am întrebat dacă creșterea nivelului de sistem xc- într-o linie celulară cu SLC7A11 endogenă scăzută ar sensibiliza celulele la retragerea glucozei. În comparație cu celulele Hap1, celulele HeLa au exprimat niveluri aproape nedetectabile ale subunității SLC7A11 (Fig. 2a) și au prezentat o eliberare scăzută de glutamat în mediu (Fig. 2b). În mod interesant, celulele HeLa de control au prezentat o viabilitate ridicată în fața eliminării glucozei (Fig. 2d). Supraexprimarea subunității SLC7A11 a provocat o creștere mare a eliberării de glutamat (Fig. 2a,b) și a crescut considerabil moartea celulelor în timpul epuizării glucozei (Fig. 2d). Cu toate acestea, în mediile care conțin glucoză, nu a existat nicio modificare a ratei de proliferare a celulelor HeLa care supraexprimă SLC7A11 în comparație cu cele de control (Fig. suplimentară 2a). Astfel, supraexprimarea SLC7A11 este suficientă pentru a provoca dependența de glucoză. Rezultate similare au fost obținute utilizând condiții de cultură cu un nivel scăzut de glucoză (față de absența glucozei în experimentele de mai sus) (Fig. suplimentară 2b). În plus, nici knockdown-ul, nici supraexpresia SLC7A11 nu au modificat semnificativ viabilitatea celulară în cazul epuizării glutaminei (Fig. suplimentară 2c). Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că nivelul de activitate a sistemului xc- controlează sensibilitatea celulelor la retragerea glucozei.

Beneficiile epuizării xCT necesită metabolismul glutaminei

După retragerea glucozei, glutamina devine sursa primară de carbon, iar metabolismul acesteia este esențial pentru supraviețuirea celulelor6,7,8. Odată importată, glutamina intracelulară este transformată în glutamat și mai departe în α-cetoglutarat, un intermediar al ciclului TCA. Prin urmare, am speculat că celulele cu o activitate scăzută a sistemului xc- ar putea fi mai capabile să mențină mai bine nivelurile intracelulare de glutamat și metabolizarea acestuia în ciclul TCA. Pentru a testa această idee, am măsurat direct nivelurile de glutamat intracelular la 1 h după retragerea glucozei. Celulele SLC7A11 knockdown (Fig. 3a) și mutanții SLC3A2 sau SLC7A11 gene-trap (Fig. Suplimentară 3a) și-au menținut nivelul de glutamat intracelular după epuizarea glucozei mult mai bine decât celulele de control. În schimb, celulele HeLa care supraexprimă SLC7A11 au avut niveluri mai scăzute de glutamat intracelular decât celulele de control (Fig. 3b). În concordanță cu rolul cunoscut al sistemului xc- pentru sinteza GSH, SLC7A11 knockdown a redus nivelul de GSH intracelular în celulele Hap1, în timp ce celulele HeLa care au supraexprimat SLC7A11 au prezentat niveluri mai ridicate de GSH decât celulele de control (Fig. suplimentară 3b).

(a,b) Cuantificarea glutamatului intracelular în celulele Hap1 cu SLC7A11 knockdown (a) și în celulele HeLa cu SLC7A11 supraexprimare (b) înainte și la 1 h după eliminarea glucozei. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3); **P<0,01; testul t al lui Student neperecheat. (c) Enzime și inhibitori implicați în metabolismul glutaminei/glutamatului. (d,e) Viabilitatea celulelor Hap1 la 24 h după retragerea glucozei. Următoarele medicamente au fost adăugate după cum este indicat: 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES sau 4 mM dm-αKG. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3). (f) Consumul de oxigen în condiții de sărăcire a glucozei. Celulele au fost incubate timp de 3 h în mediu cu deficit de glucoză (1 mM glutamină) și s-a măsurat OCR. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=4); *P<0,05. **P<0,01; testul t al lui Student neegalat. (g) Modele de etichetare izotopică a intermediarilor TCA. Celulele au fost incubate timp de 8 h în medii fără glucoză care conțin U-13C5-glutamină înainte de extragerea metaboliților. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3).

Ne-am întrebat în continuare dacă metabolismul glutaminei/glutamatului este important pentru supraviețuirea celulară sporită a celulelor cu deficiență de sistem xc– în timpul retragerii glucozei. Am testat trei compuși , aminooxiacetat (AOA, inhibitor de aminotransferază) și galat de epigallocatechin (EGCG, inhibitor de glutamat dehidrogenază)21 care inhibă enzimele implicate în conversia glutaminei în glutamat și apoi în α-cetoglutarat (Fig. 3c). În urma tratamentului cu EGCG, celulele Hap1 perturbate pentru SLC7A11 (Fig. 3d; Fig. 3c suplimentară) sau SLC3A2 (Fig. 3c suplimentară) nu mai prezintă o viabilitate crescută în condiții de deprivare de glucoză, ceea ce sugerează că glutamatul dehidrogenază (GDH) este esențială pentru acest efect. Deoarece GDH transformă glutamatul în α-cetoglutarat, ne-am întrebat dacă α-cetoglutaratul ar putea inversa efectul inhibitor al EGCG. Într-adevăr, efectul inhibitor al EGCG a fost complet salvat prin suplimentarea cu α-cetoglutarat de dimetil (dm-αKG), o formă de α-cetoglutarat permeabilă la celule, (Fig. 3e; Fig. suplimentară 3d). Mai mult, suplimentarea dm-αKG în timpul retragerii glucozei a îmbunătățit considerabil viabilitatea celulară în celulele Hap1 de tip sălbatic (WT) și shRNA de control (Fig. 3e; Fig. suplimentară 3d) și în celulele HeLa cu supraexprimare SLC7A11 (Fig. 2d), în timp ce suplimentarea suplimentară de glutamină în mediu nu a îmbunătățit semnificativ viabilitatea celulară (Fig. suplimentară 3e). Prin urmare, aceste rezultate sugerează că transformarea glutamatului în α-cetoglutarat stă la baza efectului protector al întreruperii sistemului xc- în condiții de deficit de glucoză. Lipsa efectului prin BPTES sau AOA sugerează că GLS1 nu este glutaminaza primară în celulele Hap1 și că GDH, mai degrabă decât aminotransferaza, este importantă pentru conversia glutamatului în α-cetoglutarat.

În absența glucozei, OXPHOS mitocondrială (ca sursă principală de sinteză a ATP) devine esențială pentru supraviețuire. Prin anapleroză, α-cetoglutaratul derivat din glutamină reaprovizionează intermediarii ciclului TCA, care generează substraturi pentru a conduce OXPHOS21. Prin urmare, am testat dacă nivelurile sistemului xc- pot regla respirația mitocondrială. În prezența glucozei, rata de consum de oxigen (OCR) a celulelor HeLa cu SLC7A11 knockdown Hap1 sau supraexprimare este comparabilă cu cea a celulelor de control (Fig. suplimentară 3f). Cu toate acestea, celulele SLC7A11 knockdown prezintă o respirație mitocondrială mai mare după 3 h de epuizare a glucozei, în timp ce OCR a celulelor HeLa cu SLC7A11 supraexprimare este mai mică decât cea a celulelor de control în cazul retragerii glucozei (Fig. 3f).

Lucrări recente au constatat că α-cetoglutaratul generat din glutamina consumată poate fi supus metabolismului oxidativ prin intermediul ciclului TCA „înainte”, în sensul acelor de ceasornic, sau carboxilării reductive prin intermediul unei reacții TCA „inverse”, în sens invers acelor de ceasornic22,23,24. Fluxul relativ prin ciclul TCA față de ciclul TCA invers poate fi determinat prin marcarea cu izotopi stabili 13C (C5) a glutaminei extracelulare și prin măsurarea încorporării markerului în intermediarii ciclului TCA22,23,25. Pentru a determina dacă modularea sistemului xc- modifică fluxul ciclului TCA înainte față de cel invers, celulele Hap1 SLC7A11 knockdown sau celulele HeLa supraexprimate au fost cultivate în absența glucozei și cu U-13C5-glutamină (a se vedea Metode). Expunerea la U-13C5-glutamină extracelulară a dus la marcarea aproape completă (M+5) a glutaminei și glutamatului intracelulare (Fig. suplimentară 3g). Glutamatul marcat a intrat în TCA prin reacție anaplerotică la α-cetoglutarat cu marcarea M+4 a intermediarilor TCA avansați succinat, fumarat, malat și citrat (Fig. 3g). Marcarea M+5 a citratului (produs reductiv al TCA) a fost observată într-o măsură mult mai mică (∼8:1 M+4:M+5 citrat), ceea ce indică un flux invers de TCA redus. Este important de remarcat faptul că gradul relativ al fluxului înainte față de cel invers a rămas neschimbat, fie cu knockdown, fie cu supraexprimarea SLC7A11.

xCT reglează dependența celulelor canceroase mamare de glucoză

Pentru a extinde observațiile noastre privind efectul negativ al sistemului xc- asupra metabolismului glutaminei și respirației, am analizat datele de expresie genetică pentru 947 de linii celulare canceroase din proiectul Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)26. Pentru fiecare tip de cancer, am clasificat 15-20 de linii celulare canceroase ca având o expresie SLC7A11 ridicată și scăzută și am efectuat o analiză de îmbogățire a setului de gene între aceste două grupuri. Am constatat că genele legate de OXPHOS au fost îmbogățite în grupurile cu expresie scăzută a SLC7A11, în special în liniile celulare de cancer pulmonar (valoare P = 0,018) și de cancer de sân (valoare P = 0,039). Mai mult, analiza a 59 de celule de cancer mamar a arătat o corelație negativă marcată și selectivă între expresia SLC7A11 și genele OXPHOS mitocondriale (Fig. suplimentară 4a,b). Această observație sugerează că majoritatea celulelor de cancer mamar cu o expresie scăzută a SLC7A11 au un profil de expresie în concordanță cu reglarea în sus a mașinăriei OXPHOS, și invers.

Am ales două linii celulare de cancer mamar, Hs578T și SK-BR-3, ca fiind reprezentative pentru liniile celulare cu expresie ridicată și, respectiv, scăzută a SLC7A11 (Fig. suplimentară 4a). În concordanță cu datele de expresie ale CCLE, celulele Hs578T au prezentat un nivel ridicat de expresie a SLC7A11 și o eliberare activă de glutamat în mediu, în timp ce celulele SK-BR-3 au prezentat o expresie scăzută a SLC7A11 și nicio eliberare detectabilă de glutamat (Fig. 4a; Fig. Suplimentară 5a). Am determinat, de asemenea, starea metabolică a celulelor Hs578T și SK-BR-3 prin măsurarea activităților de OCR și glicoliză (rata de acidificare extracelulară (ECAR)). Celulele Hs578T au prezentat un OCR mai mic și un raport OCR/ECAR mai mic decât SK-BR-3 (Fig. 4b,c), sugerând că celulele Hs578T sunt mai dependente de glicoliză decât SK-BR-3. Majoritatea celulelor Hs578T, ca și celulele Hap1, au murit la retragerea glucozei (Fig. 4d), în timp ce celulele SK-BR-3 au fost rezistente (Fig. 4e). Celulele Hs578T sărăcite pentru SLC7A11 au prezentat o scădere a eliberării de glutamat în mediu (Fig. suplimentară 5a) și au menținut mai eficient nivelurile intracelulare de glutamat în cazul epuizării glucozei (Fig. suplimentară 5b). Este important faptul că SLC7A11 knockdown a îmbunătățit considerabil viabilitatea celulelor Hs578T în timpul retragerii glucozei (Fig. 4d). Cu toate acestea, celulele Hs578T lipsite de SLC7A11 au avut niveluri de ROS celulare mai ridicate decât celulele de control, în concordanță cu rolul său în apărarea antioxidantă (Fig. Suplimentară 5c). În schimb, celulele care supraexprimă SLC7A11 au avut niveluri mai scăzute de ROS (Fig. suplimentară 5c). Supraviețuirea celulelor Hs578T SLC7A11 knockdown în timpul retragerii glucozei a fost abolită de EGCG și BPTES, implicând din nou faptul că producția de α-cetoglutarat din glutamat este critică (Fig. 4d). După cum era de așteptat, efectele dăunătoare ale tratamentului cu EGCG sau BPTES au fost complet inversate de suplimentarea cu dm-αKG (Fig. 4d). Efectul diferențial al BPTES (comparați Fig. 4d cu Fig. 3d) implică faptul că GLS1 este glutaminaza primară în celulele Hs578T, dar nu și în celulele Hap1.

(a) Nivelurile proteinei SLC7A11 în celulele Hs578T SLC7A11-knockdown și SK-BR-3 SLC7A11-overexpressing. (b,c) Starea metabolică în condiții de suplețe de glucoză. Raportul OCR (b) și raportul OCR/ECAR (c) au fost măsurate în prezența a 10 mM glucoză+2 mM glutamină. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3). (d,e) Viabilitatea celulară la 24 h după retragerea glucozei. Celulele Hs578T SLC7A11 knockdown (d) și celulele SK-BR-3 cu supraexprimare SLC7A11 (e) au fost cultivate în mediu cu deficit de glucoză timp de 24 h. Următoarele medicamente au fost adăugate după cum este indicat: 500 μM SASP, 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES sau 4 mM dm-αKG. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3).

Supraexprimarea SLC7A11 în celulele SK-BR-3 a crescut eliberarea de glutamat (Fig. suplimentară 5a) și a redus concomitent capacitatea de a menține glutamatul intracelular în condiții de deficit de glucoză (Fig. suplimentară 5b). Supraexprimarea SLC7A11 a provocat o moarte substanțială a celulelor SK-BR-3 după retragerea glucozei. Moartea celulelor a fost salvată prin adăugarea de dm-αKG, sugerând că supraexprimarea SLC7A11 duce la o deficiență de α-cetoglutarat în condiții de deficit de glucoză (Fig. 4e).

Celele Hs578T cu SLC7A11 knockdown au fost capabile să își mențină activitatea respiratorie pentru perioade prelungite după retragerea glucozei (Fig. suplimentară 5d). În schimb, celulele SK-BR-3 care supraexprimă SLC7A11 au prezentat un declin abrupt al OCR în cadrul aceluiași regim. Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că sistemul xc- în celulele cancerului de sân reglează fluxul intracelular de glutamat în ciclul TCA și crește sensibilitatea la retragerea glucozei.

Nrf2 acționează în amonte de SLC7A11

Nrf2 (factor nuclear eritroid 2-like 2, NFE2L2) este un factor de transcripție cheie care reglează în sus multe gene citoprotectoare implicate în stresul oxidativ27. Deoarece SLC7A11 este o genă țintă cunoscută a Nrf2 (ref. 27), am examinat corelația dintre expresia Nrf2 și SLC7A11 în celulele canceroase. Expresia Nrf2 este corelată pozitiv cu expresia SLC7A11 în 59 de linii celulare de cancer de sân (R = 0,5688), precum și în toate cele 947 de linii celulare de cancer (R = 0,4306) din datele de expresie ale CCLE. Mai mult, expresia genei țintă Nrf2 prezintă o corelație ridicată cu expresia SLC7A11 în cele 947 de linii celulare de cancer. Coeficientul de corelație (R) între SLC7A11 și genele țintă NRF2 sunt: NQO1 (+0,4179), GCLC (+0,3283), GCLM (+0,3944) și TXNRD1 (+0,4321).

Aceste corelații sugerează că Nrf2 susține expresia SLC7A11 într-un subset de celule canceroase. Pentru a testa această idee, am eliminat Nrf2 în celulele de cancer de sân Hs578T și MDA-MB-231, două expresoare ridicate ale SLC7A11. Eliminarea Nrf2 a provocat o scădere semnificativă a expresiei SLC7A11 (Fig. 5a,b,e) și a redus eliberarea de glutamat (Fig. 5c,f). Este important de remarcat faptul că celulele cu Nrf2 eliminat au prezentat o viabilitate mult îmbunătățită în timpul retragerii glucozei (Fig. 5d,g). Din nou, această modificare a viabilității depinde de metabolismul glutamatului, deoarece tratamentul cu EGCG a abolit efectul pro-supraviețuire al eliminării Nrf2 (Fig. 5d). În plus, suplimentarea cu α-cetoglutarat a fost suficientă pentru a promova supraviețuirea celulelor, chiar și în prezența EGCG.

(a) Western blot al nivelului proteinei SLC7A11 în celulele Hs578T Nrf2 și SLC7A11 knockdown. (b) Analiza RT-PCR în timp real a nivelurilor de ARNm Nrf2 și SLC7A11 în celulele MDA-MB-231 Nrf2 și SLC7A11 knockdown. Măsurătorile au fost normalizate la nivelurile de ARNr 18 s. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3); **P<0,01, testul t al lui Student neperecheat. (c,d) Analiza celulelor Hs578T cu Nrf2 și SLC7A11 knockdown. (c) Eliberarea de glutamat în mediu. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3); **P<0,01; testul t al lui Student nepotrivit. (d) Viabilitatea celulelor la 24 h după retragerea glucozei. EGCG (50 μM) și dm-αKG (4 mM) au fost adăugate după cum este indicat. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=4). (e-g) Celulele MDA-MB-231 au fost tratate cu vehicul (DMSO) sau 15 μM DMF timp de 24 h în mediu bogat în glucoză. Manipulările suplimentare au inclus knockdown al SLC7A11 sau Nrf2 și supraexprimarea SLC7A11. (e) Western blot al nivelurilor SLC7A11 la tratamentul cu DMF. (f) Eliberarea de glutamat în mediu. După pretratarea cu DMF, celulele au fost incubate în mediu proaspăt cu deficit de glucoză fără DMF, iar glutamatul eliberat în mediu a fost măsurat la 2 h. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=4). (g) Viabilitatea celulelor la 24 h după epuizarea glucozei. După pretratarea cu DMF, celulele au fost incubate în mediu proaspăt cu deficit de glucoză fără DMF timp de încă 24 h înainte de măsurarea viabilității celulare. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=4); NT, fără tratament.

Pentru a examina efectul suprareglementării Nrf2, am tratat celulele cu fumarat de dimetil (DMF), un activator Nrf2 permeabil la celule28. Tratamentul cu DMF a determinat ca celulele MDA-MB-231 să inducă puternic expresia SLC7A11 și eliberarea de glutamat (Fig. 5e,f). Mai mult, celulele pretratate cu DMF au prezentat o viabilitate substanțial redusă în timpul epuizării glucozei în comparație cu celulele de control (Fig. 5g). Am exclus efectele off-target, demonstrând că aceste rezultate ale tratamentului cu DMF au fost dependente atât de SLC7A11, cât și de Nrf2 (Fig. 5f,g). Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că axa Nrf2-SLC7A11 reglează metabolismul glutamatului, dependența celulelor canceroase de glucoză și capacitatea lor de a utiliza glutamina ca sursă alternativă de carbon. În mod important, aceasta sugerează că adaptarea la stresul oxidativ în celulele canceroase poate compromite flexibilitatea nutrienților, în special prin consolidarea unui fenotip de dependență de glucoză.

xCT reglează funcția mitocondrială în celulele cu ADNmt mutant

Constatările noastre de mai sus indică faptul că celulele cu o suprareglare a sistemului xc- din cauza stresului oxidativ pot avea o flexibilitate nutritivă restricționată din cauza metabolismului afectat al glutaminei. Inhibarea lanțului respirator mitocondrial poate crește speciile reactive de oxigen29,30. Am constatat că expresia SLC7A11 a fost indusă de medicamente care blochează funcția mitocondrială, în special rotenona și oligomicina, care inhibă complexul I (NADH dehidrogenază) și, respectiv, V (ATP sintetază) al mașinăriei OXPHOS (Fig. suplimentară 6a). În concordanță cu aceste rezultate farmacologice, SLC7A11 a fost crescută în celulele hibride care conțin mutații homoplasmice ale ADNmt în subunitatea ND1 a complexului I sau în subunitatea ATP6 a complexului V (NARP) (Fig. 6a)30,31. Inducția SLC7A11 a fost deosebit de accentuată în linia celulară NARP, care a fost raportată ca având niveluri ridicate de ROS și inducție a enzimei mitocondriale MnSOD30 de salvare a ROS. Inducția SLC7A11 în celulele cibernetice NARP a fost foarte dependentă de factorii de transcripție Nrf2 și Atf4 (Fig. suplimentară 6b) și a putut fi suprimată prin tratamentul cu antioxidantul N-acetilcisteină (Fig. suplimentară 6c).

(a) Western blot al nivelurilor SLC7A11 în 143B și în celulele ND1 și NARP izogene cu mutații ale ADNmt. (b-e) Analiza SLC7A11 knockdown sau a celulelor ND1 și NARP tratate cu erastină (Era) (5 μM) cultivate în prezența a 10 mM galactoză și 2 mM glutamină. (b) Cuantificarea glutamatului intracelular la 24 h după cultivarea galactozei. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=4); ** P<0,01; testul t al lui Student neperecheat. (c) Viabilitatea celulelor în mediul de galactoză timp de 3 zile. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=4). (d) Imagini reprezentative și cuantificarea morfologiei mitocondriale la 24 h după cultivarea galactozei. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=3). Bară de scară, 10 μm. (e) Consumul de oxigen a fost determinat la 24 h după cultivarea galactozei. Datele reprezintă mediile±s.d. (n=5); **P<0,01; testul t al lui Student neegalat. (f) Model pentru efectele duble ale antiportorului xCT. Antiportorul xCT deviază metabolismul glutaminei din ciclul TCA în sinteza GSH, care este importantă pentru funcția antioxidantă. În anumite condiții celulare, devierea excesivă a glutaminei de la ciclul TCA este dăunătoare (panoul din mijloc) și, prin urmare, inhibarea antiportorului îmbunătățește supraviețuirea (panoul din dreapta).

Am investigat dacă aceste modificări compensatorii ale expresiei sistemului xc- afectează metabolismul celular în celulele cybrid. În concordanță cu expresia lor mai mare de SLC7A11, hibrizii ND1 și NARP au avut niveluri mai scăzute de glutamat intracelular (Fig. 6b). Inhibarea sistemului xc- prin blocarea SLC7A11 sau printr-un inhibitor puternic, erastin, a crescut glutamatul intracelular în celulele ND1 și NARP. În mod similar, α-cetoglutaratul intracelular, un produs al metabolismului glutamatului, a crescut, de asemenea, prin inhibarea SLC7A11 (Fig. suplimentară 6d). Se știe de mult timp că celulele cu defecte de OXPHOS supraviețuiesc prost în mediul care conține galactoză, ceea ce forțează o cerere mai mare pentru OXPHOS ca sursă de generare de ATP32. Cibridele ND1 și NARP-mutante, spre deosebire de celulele isogenice WT 143B, nu au fost capabile să supraviețuiască în mediul care conține galactoză (Fig. 6c; Fig. suplimentară 6e). Cu toate acestea, SLC7A11 knockdown sau tratamentul cu erastină a salvat puternic viabilitatea ciorbilor ND1 și NARP în mediul cu galactoză. Efectul a fost cel mai pronunțat în cazul ciorchinilor NARP, care au prezentat o inducție mult mai mare a SLC7A11 (Fig. 6c).

Această creștere a viabilității celulare a fost corelată cu o normalizare izbitoare a morfologiei mitocondriale. Grupul nostru a raportat anterior că celulele WT își alungesc mitocondriile în condiții de mediu care necesită o activitate OXPHOS sporită, în timp ce celulele cu mutații ale ADNmt își fragmentează în schimb mitocondriile33. În concordanță cu acest rezultat, citricele ND1 și NARP au prezentat o fragmentare mitocondrială marcată după 24 h de cultură cu galactoză. În schimb, cybridele cu SLC7A11 knockdown sau cu tratament cu erastină au prezentat o alungire substanțială a mitocondriilor atunci când sursa de carbon din mediu a fost schimbată de la glucoză la galactoză (Fig. 6d; Fig. suplimentară 6f). SLC7A11 knockdown nu a modificat nivelurile mai multor proteine de dinamică mitocondrială, inclusiv Opa1, Mfn1 și Drp1 (Fig. Suplimentară 6g). Mai mult, celulele SLC7A11 knockdown au prezentat o activitate de respirație mai mare decât celulele mutante de control (Fig. 6e). Luate împreună, aceste rezultate sugerează că inhibarea sistemului xc- în citricele cu ADNmt mutant îmbunătățește morfologia mitocondrială și respirația, ceea ce duce la o supraviețuire semnificativ îmbunătățită în mediu galactozic.

.