8 Polymyxiner

Polymyxiner är en klass av katjoniska cykliska dekapeptider som kännetecknas av förekomsten av fem positivt laddade aminrester från diaminobutyrsyra (Dab) och en lipofil svans, vilket visas i strukturen för polymyxin B1 (50). De uppvisar stark aktivitet mot gramnegativa bakterier och användes först kliniskt på 1950-talet, men användningen begränsades av rapporter om toxicitet, särskilt nefrotoxicitet. Under det senaste decenniet, med den ökande förekomsten av multiresistenta gramnegativa bakterier, har det dock skett en återkomst i användningen av polymyxiner som läkemedel i sista hand.

Det finns många nackdelar med den nuvarande polymyxinbehandlingen. Det vanligaste preparatet i klinisk användning är prodrug av polymyxin E (colistin) (51) känt som CMS (colistinmetansulfonat), som utvecklades på 1960-talet som en mindre toxisk doseringsform. Eftersom det rör sig om en prodrug med fem sulfonylerade aminogrupper är farmakokinetiken dock komplicerad och inte särskilt väl känd. Polymyxin B doseras som sulfatsalt genom långsam infusion för att övervinna de akuta toxikologiska effekterna, men farhågor om nefrotoxicitet leder till suboptimal dosering. Ett ”andra generationens” polymyxin med ett förbättrat terapeutiskt index och en doseringsregim som utvecklats med modern PK-PD-metodik skulle vara ett fördelaktigt tillägg till arsenalen mot multiresistenta gramnegativa infektioner.

Polymyxinernas verkningsmekanism är inte helt klarlagd. Polymyxiner binder till och bryter den negativt laddade lipopolysackariden (LPS) i det yttre membranet hos gramnegativa bakterier, vilket gör det möjligt för polymyxinet (och andra läkemedel) att passera in i det periplasmatiska utrymmet. Även om polymyxinerna är katjoniska amfifila molekyler är bindningen till och erkännandet av det yttre membranet specifik. Utplåning av fett-acylkedjan och aminosyra 1 leder till polymyxin B nonapeptid (PMBN, (52)), som visserligen är betydligt mindre aktiv än polymyxin B, men som behåller förmågan att permeabilisera det yttre membranet hos gramnegativa bakterier. Enantiomeren av PMBN är dock inte permeabiliserande. En modell för polymyxinbindning till den mycket bevarade hydrofoba lipiden A i LPS har utarbetats på grundval av NMR-studier av polymyxin i komplex med LPS. I denna modell interagerar de positivt laddade aminerna med LPS:s fosfater, medan den lipofila svansen och den lipofila aminosyra 6-7-regionen i kärnan interagerar med LPS:s lipidhals. Vissa polymyxinderivat utan betydande antibakteriell aktivitet har visat sig binda till LPS och permeabilisera bakterierna för verkan av andra antibiotika.

Struktur-aktivitetsförhållandena för polymyxinerna granskades grundligt 2010 och sedan dess har det skett ytterligare utveckling inom läkemedelskemi och prekliniska undersökningar som syftar till att både minska toxiciteten och öka aktivitetsnivån, särskilt mot nya multiresistenta stammar.

Polymyxiner uppvisar nefrotoxicitet vid nivåer nära den terapeutiska dosen, samt ett antal dåligt karakteriserade akuta toxikologiska effekter. Mekanismen för nefrotoxicitet undersöks för närvarande, men den tros vara relaterad till molekylens katjoniska natur och ackumulering i de proximala tubulära epitelcellerna i njurarna, med ett upptag som förmedlas av megalin, som är en multiligandreceptor. Cytotoxicitet har fastställts i de celltyper där läkemedlet ackumuleras, t.ex. mänskliga proximala tubulära njurceller (HK-2) eller proximala tubulära epitelceller (PTEC), och kan inbegripa mitokondriell skada eller inblandning av reaktiva syrearter.

Under de senaste åren har ett antal tillvägagångssätt vidtagits för att minska toxiciteten och förbättra det terapeutiska indexet för polymyxiner. Totalsyntesen av nya polymyxinderivat via peptidsyntes i fast fas har varit den viktigaste vägen, vilket gör det möjligt att manipulera polymyxinstrukturen i vilken punkt som helst. Halvsyntes med utgångspunkt i själva polymyxin har också utnyttjats i stor utsträckning, med hjälp av olika enzymers förmåga att selektivt klyva den lipofila svansen och tripeptidkedjan i specifika positioner. Selektivt skydd av de terminala aminogrupperna i Dab-resterna har också uppnåtts, vilket möjliggör semisyntes av en mängd olika derivat av nonapeptiden.

Det har rapporterats att avlägsnande av den lipofila svansen och aminosyra 1 för att lämna polymyxin B nonapeptid (PMBN) (52) leder till en signifikant minskning av nefrotoxiciteten och den antibakteriella aktiviteten, samtidigt som molekylen bibehåller förmågan att genomtränga bakterier för verkan av andra antibiotika. Denna minskning av toxiciteten har nyligen bekräftats genom in vivo-studier vid AstraZeneca , där histopatologin avslöjade anmärkningsvärda förändringar i njurarna hos råttor som behandlats med colistin jämfört med dem som behandlats med PMBN eller kontroll med vehikel.

I en serie derivat som saknar fettacylkedjan har Katsuma och medarbetare undersökt Pseudomonas-specifika polymyxin-analoger . Ersättning av fett-acylkedjan och aminosyra 1 i polymyxin med alla basiska rester, såsom Dab-Dab-Dab-kedjan (53a), resulterade i potent och selektiv Pseudomonas-aktivitet in vitro, men med ökad akut toxicitet hos musen. En liten hydrofil aminosyra vid N-terminalen (diaminopropionsyra (Dap) eller serin) (53b,c) resulterade i Pseudomonas-aktivitet in vitro som var jämförbar med polymyxin B. Dap-analogen (53b) uppvisade 4,9 gånger mindre akut toxicitet än polymyxin B hos musen. Effekten på njurtoxicitet har inte rapporterats i denna serie.

En metod som Northern Antibiotics använt sig av för att minska toxiciteten hos polymyxinderivat har varit att minska antalet positiva laddningar i molekylen. Även om Dab-resterna i den cykliska delen av polymyxin har visat sig vara avgörande för både LPS-bindning och för efterföljande antibakteriell aktivitet , kan bindning till LPS fortfarande ske i analoger som saknar aminrester i den linjära delen av peptiden . Sådana derivat kan fungera som permeabilisatorer för andra antibiotika och vissa har egen aktivitet mot ett smalare spektrum av organismer. Som exempel kan nämnas nonapeptiderna NAB-7061 (54a) med aminobutyrat i position 3 och NAB-739 (54b) med d-serin i position 3. Båda behåller polymyxinets förmåga att permeabilisera det yttre membranet och verkar synergistiskt med andra antibiotika. Både NAB-7061 och NAB-739 uppvisade lägre affinitet (ca en femtedel lägre) för borstgränsmembranet i njurbarken än polymyxin, vilket visades i en radioaktivt märkt gentamicinförskjutningsanalys. NAB-739 uppvisade lägre cytotoxicitet i en HK-2 cellinje med IC50-värden som var cirka 26 gånger lägre än polymyxin B. NAB-739 uppvisade också antibakteriell aktivitet både in vitro och in vivo. Medan in vitro-profilering visade god aktivitet mot E. coli och Klebsiella, var aktiviteten minskad jämfört med polymyxin mot Pseudomonas-arter. NAB-739 har visat effekt i en E. coli-infektionsmodell, men hittills finns det inga rapporter om toxicitetsstudier in vivo.

Cubist Pharmaceuticals har rapporterat om minskad toxicitet genom att ersätta polymyxinets lipofila svans med en arylurea i föreningen CB-182,804 (55). Hittills är detta det enda av den nya generationens polymyxiner som gått vidare till fas I-försök, efter att ha visat minskad nefrotoxicitet hos cynomolgösa apor .

Pfizer rapporterade nyligen om syntesen av en mängd olika polymyxin-derivat där Dab-3 i den linjära delen av aminosyrakedjan ersattes med diaminopropionsyran Dap , vilket rapporterades öka den antibakteriella aktiviteten. En rad olika biarylterminala grupper undersöktes med slutsatsen att föreningar med mer polära sidokedjor, mätt med ClogD, var mindre cytotoxiska mot hRPTEC-njurcellinjen, men hade en allmän tendens till minskad antibakteriell effekt. En särskild substans från Pfizer, 5x (56), där polymyxinets lipofila svans ersattes av en polär N-fenylpyridondel, uppvisade dock en avsevärt minskad in vitro-toxicitet jämfört med polymyxin, samtidigt som aktiviteten bibehölls. Föreningen 5x undersöktes in vivo med avseende på nefrotoxisk potential jämfört med polymyxin B hos råtta i en 7-dagarsstudie. Vid en exponeringsnivå där polymyxin B gav upphov till nekrotiska njurskador hos alla djur (om än minimala) (56) uppvisade ingen förekomst av nekrotiska njurskador. Hos hund rapporterades det dock att det inte fanns någon betydande säkerhetsmarginal för (56) jämfört med polymyxin B. Att förstå förhållandet mellan in vitro-toxicitet och in vivo-situationen för polymyxiner är fortfarande ett hinder som måste övervinnas.

Cantab anti-infectives har rapporterat att polymyxin-icke-apeptidderivat där acylkedjan innehåller en polär funktionalitet uppvisar minskad toxicitet in vitro och in vivo samtidigt som de har bibehållen in vivo-effektivitet . Till exempel jämfördes förening (57) med polymyxin B i en E. coli-infektionsmodell med musens lår. En total dos på 10 mg/kg (i.v., b.i.d.) av (57) gav en minskning av bakteriebördan med 4 log10 jämfört med obehandlad kontroll, medan samma dos polymyxin minskade bakteriebördan med 4,8 log10. Liknande resultat erhölls i en Klebsiella pneumoniae-infektionsmodell, där (57) gav en liknande minskning av bakteriebördan (2,3 log10 minskning) som colistin vid 10 mg/kg. In vitro var (57) sex gånger mindre cytotoxisk än polymyxin, mätt som IC50 mot cellinjen HK-2. In vivo, i en råttmodell av nefrotoxicitet, gav (57) signifikant lägre nivåer av urinbiomarkörer för njurskador (N-acetyl-beta-d-glukosaminidas, albumin och cystatin C) jämfört med colistin vid samma dosnivå.

En annan metod har använts av gruppen vid Monash University, som har undersökt modifieringar som visar aktivitet mot resistenta stammar. Polymyxiner med ökad lipofilitet vid aminosyrorna 6 och 7 i kärnan och en lipofil kedja, t.ex. FADDI-02 (58a) och FADD1-03 (58b), uppvisar förbättrad aktivitet mot resistenta stammar av Pseudomonas aeruginosa och Acinetobacter baumanii jämfört med polymyxin B. In vitro-toxicitet rapporteras inte, men föreningarna har utvärderats i en in vivo-modell av nefrotoxicitet. Histologisk undersökning visade inga skador hos dessa FADDI-03-behandlade råttor jämfört med positiva tecken på njurskador hos de polymyxin B-behandlade djuren. Denna lägre toxicitet har tillskrivits molekylens höga serumbindning, vilket förhindrar ackumulering i njurarna.