B Photoreceptors

Photoreceptor degeneraties zijn de meest voorkomende vorm van blindheid in de Westerse wereld en betreffen het verlies van gezichtsvermogen door dystrofie en/of afsterven van retinale fotoreceptoren. Deze ziekten kunnen grofweg worden onderverdeeld in aandoeningen die in eerste instantie de staaffotoreceptoren aantasten, zoals retinitis pigmentosa (RP), en aandoeningen die in eerste instantie de kegelfotoreceptoren aantasten, zoals maculadegeneratie.141 Hoewel fotoreceptordegeneratie ook indirect kan worden veroorzaakt door primaire defecten in de RPE, die een belangrijke functie heeft in de gezondheid en homeostase van de fotoreceptoren, wordt dit onderwerp later besproken (zie hoofdstuk II.C).

Photoreceptoren zijn sterk gepolariseerde zintuigcellen die bestaan uit een binnenste segment (IS) dat met een buitenste segment (OS) is verbonden door een sterk gemodificeerd cilium (fig. 5).189 In volgroeide fotoreceptoren worden eiwitten die nodig zijn voor de groei en het onderhoud van de fotoreceptor OS en voor de fototransductie, langs gepolariseerde microtubuli van de basale IS naar de apicale OS getransporteerd. Fotoreceptoren zijn vergelijkbaar met epitheelcellen: hun oppervlak is door celjuncties verdeeld in apicale en basolaterale gebieden. Hun centrosomen bevinden zich aan de apicale oppervlakte, terwijl hun kernen zich aan de basale zijde bevinden.190 De goede ontwikkeling en het daaropvolgende onderhoud van vertebraten fotoreceptoren is afhankelijk van de totstandkoming van de juiste apicaal-basale polariteit, en van de werking van de transportmachine. Het is daarom niet verwonderlijk dat van de meer dan 100 genetische loci waarvan bekend is dat ze bij vertebraten degeneratie van fotoreceptoren veroorzaken, de meeste de structuur en functie van het OS beïnvloeden.191

Fig. 5. Structuur van staaf- en kegelvormige fotoreceptoren. Fotoreceptorcellen bestaan uit een buitensegment dat met visuele pigment gebonden membraanschijven bevat. Het binnenste segment is het gepolariseerde cellichaam van de fotoreceptor, waar de kern zich basaal bevindt en het cilium apicaal ontspringt en zich uitstrekt in het OS. De synaptische terminal vormt synaptische verbindingen met de interneuronen van het netvlies, die de visuele input doorgeven.161,188

Genetische screeningen in de zebravis hebben licht geworpen op de moleculaire grondslagen van deze cellulaire functies door de isolatie van mutanten waarin de ontwikkeling en/of het onderhoud van de fotoreceptoren defect zijn.24,192,193 Eén zo’n mutant, mosaic eyes (moe), bleek uitgebreide apicale kenmerken in de fotoreceptoren te hebben.20,21 De moe locus codeert voor een FERM-domein-bevattend eiwit dat een complex vormt met Crumbs eiwitten, waarvan is aangetoond dat ze cruciaal zijn voor apicaal-basale polariteit in Drosophila en vertebraten.194-196 Interessant is dat mutaties in de humane ortholoog van Crumbs, CRB1, geassocieerd zijn met retinale fotoreceptordystrofieën zoals RP 12197 en Leber’s congenitale amaurose (LCA1; Ref. 198,199). Andere zebravismutanten, zoals nagie oko (nok) en heart and soul (has) bootsen niet alleen het moe mutant fenotype na, maar de eiwitten die ze coderen (respectievelijk Pals1 en PKCi) interageren ook biochemisch met Moe.20 Bovendien resulteert morfolino knockdown van crb2b, een zebravis Crumbs paraloog, in de vermindering van de IS grootte.14 Deze studies hebben dus een begin gemaakt met het blootleggen van de rol van het Crumbs complex in vertebraten fotoreceptor ontwikkeling en ziekte.

De vorming van correcte apicaal-basale polariteit hangt niet alleen af van de juiste functie van celpolariteitsbepalende stoffen, maar ook van hun transport en lokalisatie. Fotoreceptoren in het ale oko (ako) mutant netvlies accumuleren de apicale determinanten Pals1 en PKCλ in hun cellichamen en vertonen laat in de ontwikkeling een uitgebreide fotoreceptorsterfte.19 De ako locus codeert voor de p50 subeenheid van het dynactine complex, dat een belangrijke rol speelt in het transport van lading langs microtubuli als onderdeel van het dyneïne motor complex.200 In een andere mutant, mikre oko (mok), die een mutatie in dynactine-1 bezit, is netvliesdegeneratie tenminste gedeeltelijk te wijten aan mislokalisatie van fotoreceptorkernen. Verrassend genoeg zijn, in tegenstelling tot ako mutanten, apicale determinanten zoals Crumbs en aPKCλ niet mislokaliseerd, wat suggereert dat degeneratie bij deze mutanten niet het gevolg is van verlies van celpolariteit. Experimentele mislocatie van de kern door overexpressie van de dyneïne motor resulteerde in fotoreceptor celdood, hetgeen de rol van de nucleaire positie in de overleving van de fotoreceptor ondersteunt.201 Terwijl defecten in de nucleaire positionering in mok fotoreceptoren een celautonome rol lijken te hebben, lijken andere, niet celautonome componenten een rol te spelen in mok degeneratie. Mozaïekanalyses hebben aangetoond dat mutant fotoreceptoren een meer dan 2,5-voudige overleving vertonen wanneer ze in een wild-type omgeving worden geplaatst.17 Deze bevinding suggereert dat de gezondheid en overleving van fotoreceptoren afhankelijk zijn van omgevingscues van omringende cellen. Deze bevindingen komen overeen met defecten die geassocieerd worden met sommige menselijke degeneraties, zoals RP, waarbij een initieel defect in het staafspecifieke rhodopsine uiteindelijk resulteert in het verlies van zowel staafjes als kegeltjes.202

Transport van het cellichaam naar het OS is ook belangrijk om OS-componenten te vervangen die verloren gaan door de voortdurende fagocytose van fotoreceptor OS’s door de bovenliggende RPE.203 In fotoreceptoren vindt het transport, net als in cilia, plaats via een proces dat bekend staat als Intraflagellair Transport (IFT) en mutaties in IFT-componentgenen zoals ift57, ift80, ift88 en ift172 resulteren in OS-atrofie en/of volledig verlies van OS’s bij zebravissen.24Mutaties in het elipsa-gen, dat codeert voor een eiwit dat IFT vergemakkelijkt,35 resulteren in vroegtijdig verlies van fotoreceptoren,22 terwijl morfolino knockdown van meerdere subeenheden van de retrograde IFT-motor dyneïne-2 het belang van IFT voor een goede OS-verlenging en visuele functie heeft aangetoond.204 Fotoreceptor degeneraties gerelateerd aan defecte IFT zijn enkele van de vele cilia-gerelateerde fenotypes geassocieerd met het Bardet-Biedl Syndroom (BBS),205 en de verdere studie van de functie van IFT componenten in zebravissen zou wel eens nuttig kunnen blijken voor het verkrijgen van een beter begrip van de moleculaire oorzaken die ten grondslag liggen aan BBS-gerelateerde oculaire pathologieën.

De mutanten die tot nu toe in dit hoofdstuk zijn beschreven, zijn geïsoleerd door middel van genetische screening, waarbij voornamelijk histologische methoden werden gebruikt om defecten in de fotoreceptor op te sporen, maar andere mutanten zijn geïsoleerd door middel van gedragsonderzoek.15,82,206,207 Eén zo’n screening maakte gebruik van het vermogen van de zebravis om al vanaf 3 dpf (dagen na de bevruchting) gezichtsvermogen-afhankelijk gedrag te vertonen. Brockerhoff et al.15 gebruikten eerst de optokinetische respons assay (OKR) op gemuteerde embryo’s om defecten in de visuele functie te detecteren. Een tweede assay omvatte het gebruik van electroretinogram (ERG) opnamen om na te gaan of geïsoleerde mutaties de buitenste retinale functie beïnvloeden. Uit deze screening werden 18 mutanten geïsoleerd waarvan werd vastgesteld dat zij een verminderde visuele functie hebben. Eén mutant, no optokinetic response a (noa), vertoonde geen grove afwijkingen aan de fotoreceptoren op 5 dpf (dagen na de bevruchting), maar bleek blind en lethargisch te zijn, en stierf voortijdig. Analyse van de noa-mutatie bracht een tekort aan het licht in een subeenheid van het pyruvate dehydrogenase (PDH)-complex, dat de energieproductie in cellen regelt. De noa-mutantlijn is gebruikt als model voor de studie van PDH-deficiëntie (OMIM 245348), een menselijke aandoening die, net als het zebravismodel, leidt tot blindheid, neurologische afwijkingen en vroegtijdige dood.16 Omdat de huidige behandelingen voor PDH-deficiëntie bij mensen weinig succes hebben gehad, gebruikten Taylor et al. noa-mutanten om een ketogeen dieet te testen, dat enig succes heeft gehad bij het verlichten van PDH-deficiëntiesymptomen bij een beperkt aantal menselijke patiënten. Toediening van dit speciale dieet herstelde het normale gedrag bij noa-mutanten, wat het potentieel onderstreept van het bestuderen van PDH-deficiëntietherapieën in de noa-mutantlijn.

Een andere mutant, no optokinetic response f (nof), bleek een mutatie te bezitten in de α-subeenheid van kegeltransducine (Tcα), een G-eiwit dat nodig is voor fototransductie. Bij menselijke patiënten die lijden aan een aandoening die bekend staat als achromatopsie (OMIM 139340), liggen mutaties in Tcα ten grondslag aan het verlies van kleurenvisie. Bij nof-mutanten verloopt de ontwikkeling van kegels normaal, maar zijn ze tot 1000x minder gevoelig voor licht, zoals blijkt uit opnamen van afzonderlijke fotoreceptoren. Uitgebreide analyse van de lichtreacties op kegels toonde aan dat de resterende fototransductie lichtafhankelijk is, maar transducine-onafhankelijk. De instroom van Ca+, die belangrijk is voor de lichtadaptatie van de fotoreceptor en waarvan eerder werd aangenomen dat deze door transducine werd gecontroleerd, was nog steeds detecteerbaar in nof-mutanten. Deze studie toonde dus aan dat een deel van de Ca+ 2 influx in kegelfotoreceptoren mogelijk transducine-onafhankelijk is.

In een aparte screen werden dominante mutaties die fotoreceptor-degeneratie veroorzaken in volwassen zebravissen uitgevoerd om genetische mutanten te isoleren die later gebruikt zouden kunnen worden om bij de mens erfelijke nachtblindheid zoals RP te bestuderen.37,38 In het geval van RP liggen veel genetische loci ten grondslag aan deze groep van aandoeningen. Slechts ongeveer de helft van de gevallen van dominante RP is echter in verband gebracht met specifieke mutaties op het moment dat de screening werd uitgevoerd.38 Li et al. onderzochten daarom gemuteerde volwassen zebravissen door gebruik te maken van een bekende ontsnappingsreactie die de vis vertoont. Het ontbreken van een dergelijke reactie op een dreigende cue werd geïnterpreteerd als een verlies van het gezichtsvermogen, wat later werd bevestigd met behulp van ERG opnamen. In totaal werden zeven heterozygote mutanten geïsoleerd (nachtblindheid a, b, c, d, e en f), waarvan er zes fotoreceptordegeneratie vertoonden.38,39,208,209 Vier van de zes bleken als homozygoot embryonaal letaal te zijn, wat suggereert dat de gemuteerde genen die aan de fotoreceptorfenomenen ten grondslag liggen, andere kritieke functies hebben tijdens de embryonale ontwikkeling. Deze bevinding onderstreept het belang van dergelijke screenings voor de identificatie van dominante mutaties die bij traditionele screening wellicht niet gemakkelijk geïsoleerd kunnen worden vanwege de vroege embryonale letaliteit.