Första gången publicerad den 27 augusti 2010

Winklers metod är det mest populära förfarandet för att bestämma koncentrationen av löst syre (DO) i vattenprover. Denna metod kräver dock en relativt stor provvolym på 200 mL för noggrann bestämning av DO. Många alternativa metoder har föreslagits för att mäta DO-koncentrationer i små provvolymer, men de flesta av dessa metoder har problem med antingen låg noggrannhet, hög kostnad, komplicerad instrumentering eller långa analystider. I detta dokument föreslås en enkel ändring av Winklers metod för mätning av DO-koncentrationer i prover med en volym på 1 mL. Den föreslagna metoden är exakt, billig, enkel och snabb. DO-koncentrationerna mättes i 33 prover med både den konventionella Winklermetoden (WM) och den föreslagna metoden (PM). För 23 av de 33 analyserade proverna kunde hypotesen att populationens medelvärden för mätningarna är lika (μ1 = μ2) inte förkastas med 95 procents konfidensnivå och för 19 prover kunde hypotesen att populationens varianser för mätningarna är lika (σ21 = σ22)inte förkastas med 95 procents konfidensintervall. Slutsatsen blev därför att DO-mätningar med WM och PM i de flesta fall ger jämförbara resultat både när det gäller noggrannhet och precision.

Introduktion

Winklers metod (metod nr 4500-O-C)1 har allmänt accepterats som en noggrann och tillförlitlig metod2 för att mäta koncentrationen av löst syre (DO) i en mängd olika vattenprover. Denna metod anses vara riktmärket för bestämning av DO. Den största nackdelen med denna metod är dock att den kräver en stor provvolym på 200 mL.3

En mängd alternativa metoder har också utvecklats för mätning av DO. Dessa metoder kan delas in i tre olika kategorier: (1) kolorimetriska metoder, (2) metoder som använder gaskromatografi och (3) metoder som använder elektrokemiska och optiska sensorer. De kolorimetriska metoderna kan användas för att bestämma DO i små provvolymer. De har dock nackdelar, t.ex. att de kräver dyra (t.ex. guldsol) eller giftiga (t.ex. cyanid) kemiska reagenser.4 Bristen på korrekt motivering vid valet av mätvåglängd är en annan begränsande faktor för sådana metoder.5 Det är också möjligt att bestämma DO med hjälp av gaskromatografi. Gaskromatografiska metoder är dock tidskrävande och dyra, även om de är exakta och kräver små provvolymer. Elektrokemiska sensorer har använts i stor utsträckning för DO-mätning och deras för- och nackdelar har granskats på annat håll.6 Elektrokemiska sensorer lider i allmänhet av irreversibla tryckeffekter, kontaminering med svavelväte och tvärkänslighet.7 De förbrukar också DO under mätningen och kan därför vara olämpliga för mycket små provvolymer. På senare tid har man fokuserat på utvecklingen av optiska sensorer som bygger på principen om dynamisk syre-luminescensdämpning.8 Dessa optiska sensorer är lätta att använda, har snabb svarstid och är hållbara. Alla sensorer, oavsett om de är elektrokemiska eller optiska, måste dock kalibreras enligt Winklers metod på grund av sensorernas känslighet för temperatur och tryck.9,10 De är också känsliga för biofouling och bakterietillväxt på sensorytan.8

På grund av de inneboende begränsningarna hos alternativa metoder som beskrivs ovan och deras beroende av Winklers metod för dubbelkontroll och kalibrering har flera modifieringar av Winklers metod också föreslagits för mätning av DO-koncentrationer i provvolymer på 1-10 ml.11,12,13 Sådana ”Micro-Winkler”-metoder är dock inte särskilt populära på grund av de komplexa instrumentella kraven och de omfattande försiktighetsåtgärder som krävs för att undvika att proverna kontamineras genom utbyte med atmosfäriskt syre. Dessa metoder har kritiskt granskats på annat håll.14 En gravimetrisk titreringsmetod med Micro-Winkler har nyligen föreslagits15 för DO-mätning i små prover. Detta förfarande kräver dock flera noggranna gravimetriska mätningar med hjälp av en känslig våg och verkar därför vara ganska komplicerat.

Baserat på litteraturgenomgången verkar det som om nästan alla metoder som utvecklats för DO-mätningar i små prover är bristfälliga på ett eller annat sätt. Därför finns det ett ständigt behov av att utveckla en bättre, dvs. noggrann, exakt, billig, enkel och snabb metod för DO-mätning i små provvolymer.

Övergripande beskrivning av den föreslagna metoden

Den främsta utmaningen vid mätning av DO-koncentrationer i små prover är att förhindra kontaminering av proverna genom interaktion med atmosfären. Det föreslås att ett isolerande vätskeskikt införs mellan vattenprovet och atmosfären. De egenskaper som krävs för den isolerande vätskan är följande: vattenomblandbarhet, lägre densitet än vatten och försumbar syreupplösningsförmåga. Det föreslås att den isolerande vätskan placeras i en flaska och att vattenprovet vars DO skall bestämmas (1 mL volym) placeras direkt under det isolerande vätskeskiktet. Vattenprovet är effektivt förseglat från atmosfären genom detta steg. DO i vattenprovet kan sedan fastställas och omvandlas till motsvarande mängd jod med hjälp av samma reagenser som används i Winklers metod. Jodlösningen extraheras sedan från flaskan med hjälp av en spruta och titreras med Na2S2O3 för att bestämma DO-koncentrationen i provet.

Efter flera försöksomgångar valdes n-hexan som isolerande vätska enligt ovan. n-hexan är lättare än vatten (specifik vikt = 0,7) och är praktiskt taget omblandbar med vatten. Syre är lösligt i n-hexan med 0,002 molfraktion,16 dvs. syre är praktiskt taget olösligt i n-hexan.

Material och metoder

Alla reagenser som användes var av analytisk reagenskvalitet (>99% renhet, Loba Chemicals, Indien). Avjoniserat vatten (Milli-Q, Millipore, USA) användes för beredning av reagenser och spädning av prover. Den n-hexan som användes var av HPLC-kvalitet (>99% renhet, Merck, Indien). Borosilikatglas användes i denna studie. MnSO4- och alkali-azid-jodidlösningar framställdes enligt standardmetoderna (metod nr 4500-O C).1

Mätningsförfarandet för DO-mätning med den föreslagna metoden (PM) var följande. Inledningsvis överfördes 0,5 mL n-hexan till en 16 mL glasflaska (Wheaton Science, USA). Därefter togs 1 mL n-hexan upp i en 2 mL-pipett och pipetten fylldes ytterligare med 1 mL av det vattenprov vars DO-koncentration skulle bestämmas. Genom ovanstående provtagningsförfarande säkerställdes att provet samlades in utan headspace. Detta provtagningssteg är det mest avgörande, eftersom förekomsten av bubblor eller luftspalt i gränssnittet mellan hexan och vatten eller någon annanstans i pipetten kan leda till fel. Pipettens mynning placerades sedan under hexanskiktet i flaskan och på så sätt fördes provet in under hexanskiktet, vilket undviker all kontakt mellan provet och atmosfären. Uppsamling av provet i pipetten och applicering av provet under hexanskiktet i flaskan måste ske så snabbt som möjligt för att minimera fel. Därefter infördes 5 μL MnSO4 i vattenprovet under hexanskiktet med hjälp av en 10 μL mikrospruta (Hamilton, USA), följt av en liknande tillsats av 5 μL alkali-azid-jodidlösning. Utfällningsbildningen började omedelbart efter tillsatserna och var fullständig inom 3 minuter. Därefter tillsattes 0,1 mL koncentrerad H2SO4 med hjälp av en mikropipett till den utfällning som bildats under hexanskiktet. Utfällningen löstes upp inom 3 minuter och gul jodlösning bildades under hexanskiktet. Exakt 1 mL av jodlösningen extraherades under hexanskiktet med hjälp av en mikrospruta och överfördes till en 25 mL bägare. Den 1 mL jodlösningen i bägaren späddes till ∼10 mL genom att tillsätta avjoniserat vatten för att underlätta titreringen. Tillsatsen av avjoniserat vatten späder bara ut jodlösningen utan att påverka mängden jod i bägaren. Innehållet i bägaren titrerades med 0,00625 M Na2S2O3-lösning. 1 mL av detta titreringsmedel motsvarar 55,5 mg L-1 DO i det ursprungliga provet. Titreringsmedlet togs i en 250 μL mikrospruta (Hamilton, USA) och tillsattes droppvis i bägaren under konstant omrörning tills jodets gula färg nästan försvann. Därefter tillsattes 1-2 droppar stärkelselösning och titreringen fortsatte tills den blå färgen från stärkelsen försvann. Baserat på den volym titreringsmedel som krävdes vid en viss titrering beräknades DO-koncentrationen i det ursprungliga provet.

DO-koncentrationen bestämdes också i olika prover med hjälp av Winklers metod (WM). Reagenskrav och andra detaljer för båda metoderna presenteras i tabell 1.

Resultat och diskussion

DO-koncentrationen mättes i 33 vattenprover (se tabell 2) som erhållits från olika platser i och runt staden Kanpur, Indien. Av de 33 proverna var 8 kranvattenprover, 16 flodvattenprover, 6 hushållsspillvattenprover utspädda med kranvatten, 2 grundvattenprover och 1 dammvattenprov. Proverna valdes så att DO-koncentrationerna kunde mätas i ett stort antal olika provmatriser. För varje prov gjordes flera upprepade DO-mätningar, både av WM och PM. De beräknade provmedlen (), provets standardavvikelser (S1, S2) och antalet upprepade mätningar (n1, n2) för WM respektive PM presenteras i tabell 2 för varje prov.

Normalplottar för uppsättningarna av replikatmätningar med båda metoderna var alla ungefär linjära, vilket tyder på att replikatmätningarna var normalfördelade och därmed lämpade sig för ytterligare statistisk analys på den grunden. För att illustrera detta visas normaldiagrammen för fem provmätningar som utförts med WM i figur 1A. Normaldiagrammen för samma fem provmätningar utförda av PM visas i figur 1B.

Varianserna (S21,S22) i de upprepade mätningarna av ett prov med WM respektive PM användes för parvis jämförelse av motsvarande populationsvarianser (σ21,σ22) med hjälp av F-testet. Av de 33 prover för vilka DO mättes med de två metoderna (WM och PM) kunde hypotesen att populationsvarianserna var lika (σ21 = σ22) inte förkastas med 95 procents konfidensnivå för 19 prover. Vidare kunde hypotesen σ21 > σ22 inte förkastas för fyra prover, medan hypotesen σ21 < σ22 inte kunde förkastas för de återstående tio proverna, alla på 95 procents konfidensnivå. Dessa resultat har sammanfattats i tabell 3.

Fortsättningsvis användes provvarianserna (S21, S22) och provmedelvärdena () för varje prov, som erhållits av WM respektive PM, för parvis jämförelse av motsvarande populationsmedelvärden (μ1, μ2). För prover med lika varianser (se tabell 3) gjordes parvisa jämförelser med hjälp av Student’s t-test. För prover med ojämna varianser (se tabell 3) gjordes den parvisa jämförelsen med hjälp av t-testet för ojämna varianser.17 I 23 av de 33 prover där DO-mätningar gjordes både av WM och PM kunde hypotesen att populationsmedelvärdena var lika (μ1 = μ2) inte förkastas med 95 procents konfidensnivå.

Provtagemedelvärdena () för varje prov, som erhölls av WM respektive PM, plottades mot varandra i fig. 2. De felmarkeringar som visas i figuren motsvarar motsvarande 95-procentiga konfidensintervall. En linje med enhetlig lutning som går genom origo ritades också in i samma figur. Alla punkter låg mycket nära linjen med enhetlig lutning, vilket stämmer överens med de allmänna slutsatserna i tabell 3, dvs. för de flesta prover är den genomsnittliga DO-koncentrationen som erhålls med de två metoderna inte statistiskt olika. I de flesta fall var därför DO-mätningen med PM lika noggrann som DO-mätningen med WM.

Provens standardavvikelser (S1, S2) för varje prov, som erhållits med WM respektive PM, plottas mot varandra i figur 3. En linje med enhetlig lutning som går genom origo ritades också in i samma figur. I detta fall verkar punkterna vara ganska jämnt fördelade i förhållande till linjen med enhetlig lutning, där vissa punkter ligger nära linjen medan andra ligger längre bort. Dessa observationer stämmer också i stort sett överens med slutsatserna från tabell 3, dvs. för de flesta prover är variationen i DO-koncentrationen som mäts med de två metoderna inte statistiskt olika. I de flesta fall var alltså DO-mätningen med PM lika exakt som DO-mätningen med WM.

Det drogs slutsatsen att med noggrann provhantering och titrering kan den föreslagna metoden (PM) ge resultat som är jämförbara med Winklers metod (WM) både när det gäller noggrannhet och precision. Icke desto mindre kan noggrannheten i DO-bestämningen med PM troligen ökas genom att använda en mikrospruta med ett lägre minsta antal för den slutliga titreringen. Den mikrospruta som användes i den här studien hade ett minsta antal på 5 μL, vilket motsvarar en osäkerhet på ∼0,25 mg L-1 DO under de förhållanden som rådde i den här studien. Denna osäkerhet kan sänkas genom att använda en mikrospruta med lägre minsta antal.

Slutsatser

Syftet med denna studie var att utveckla en noggrann, billig, enkel och snabb metod för mätning av DO i små provvolymer. På grundval av de resultat och analyser som presenterats kan man dra slutsatsen att den föreslagna metoden tar itu med de flesta av ovanstående frågor. De viktigaste slutsatserna av studien var följande:

➢ Införandet av ett isolerande skikt av n-hexan för att förhindra syreöverföring mellan det vattenhaltiga provet och atmosfären resulterar i en konsekvent och exakt bestämning av DO i små provvolymer. Detta är den viktigaste nyheten i den föreslagna metoden.

➢ Det visades också att den föreslagna metoden (PM), genom att vidta lämpliga försiktighetsåtgärder, i allmänhet kan ge resultat som är statistiskt jämförbara med de resultat som erhålls med Winklers metod (WM), både när det gäller medelvärdet av DO-koncentrationen och variansen i DO-koncentrationen kring medelvärdet.

➢ Kraven på reagens och glasvaror för den föreslagna metoden är mindre än för Winklers metod, främst på grund av den mindre provvolym som används. n-hexan är det enda ytterligare reagens som används, men den lilla mängd (∼1,5 ml per prov) n-hexan som krävs har en försumbar inverkan på den totala kostnaden för analysen av proverna.

Därmed kan den föreslagna metoden (PM) användas för DO-mätningar under alla omständigheter där Winklers metod för närvarande används. Den föreslagna metoden är särskilt användbar under de omständigheter där Winklermetoden inte kan användas på grund av begränsningar i den tillgängliga provvolymen.