7.2 Arkitektur av testiklarna

Lue et al. (2005, 2010a) rapporterade att vuxna 41,XXY-möss hade små, fasta testiklar som innehöll SCO-tubuli med minskad diameter och ett ökat antal Leydig-celler i interstitium. Dessa fynd är identiska med dem för den alternativa KS-modellen, 41,XXY*-musen (Lewejohann et al., 2009a; Wistuba et al., 2010, fig. 24.2) och liknar helt och hållet den testikelfenotyp som ses hos den stora majoriteten av vuxna KS-män (fig. 24.3). Dessutom uppvisade 41,XXY-möss ett avvikande mönster för uttryck av androgenreceptor (AR), vilket hittills inte observerats hos KS (Lue et al., 2005).

Figur 24.2. Testikelfenotyp i 41,XXY*-musmodellen av KS.

(A) Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) av könskromosomer i interfaskärnor som erhållits från perifera blodprover från hanmöss av stammen B6Ei.Lt-Y*. Vänster sida: leukocytkärnor från 40,XY*, höger sida: leukocytkärnor från 41,XXY* hanmöss. (a) Y*-kromosomer (pilspetsar) som upptäcks med grön fluorescerande musspecifik sond, (b) X-kromosom (pilar) som upptäcks med röd fluorescerande musspecifik sond, (c) DAPI-kärnfärgning, (d) överlagring av a-c. Observera de två X-kromosomsignalerna i 41,XXY* leukocyter. En X-kromosom ligger alltid i nära anslutning till Y*-signalen. Partiell överlappning av dessa kromosomer kan upptäckas genom den gulaktiga färgen. (B) Jämförelse av bitestikulära vikter mellan vuxna 41,XXY*-hannar (n = 98) och deras 40,XY*-kullkompisar (n = 91). Förlusten av könsceller hos hanar med en övertalig X-kromosom resulterade i betydligt mindre testikelstorlek. Värden är medelvärde ± SEM. (C och D) Representativa mikrobilder av testikelhistologi av det seminifera epitelet. (C) 40,XY*-kontrollmus som uppvisar full spermatogenes. (D) 41,XXY*-musens testiklar. Alla könsceller har avlägsnats från det seminifera epitelet, vilket gör att endast Sertoli-celler kvarstår som syndrom. Sertolicellerna uppvisar en begynnande vakuolisering. (E och F) Representativa mikrobilder av testikelhistologi av interstitialutrymmet. (E) I 40,XY*-kontrollmössen är Leydigcellerna normalt arrangerade i de interstitiella utrymmena mellan tubulära väggarna. (F) I 41,XXY*-mössen däremot är antalet Leydigceller ökat och bildar en hyperplasi. Staplarna representerar 20 μm. Symboler: X, Sertoli-celler; *, differentierande könsceller; #, Leydig-celler. Färgning: Hematoxylin-Eosin.

Figur 24.3. Histologi av mänsklig testikelvävnad: Jämförelse av normal spermatogenes och SCO-syndrom som vanligtvis observeras hos Klinefelter-patienter.

(A, C och E) Representativa mikrografer av normal mänsklig testikelhistologi som uppvisar full spermatogenes. (B, D och F) Representativa mikrobilder av testikelhistologin hos en KS-patient med SCO-syndrom. (A och B) Översikt över tubulära tvärsnitt: medan kontrollvävnaden visar normal fördelning av interstitiella och tubulära områden, uppvisar SCO-situationen fullständig förlust av könsceller och hyaliniserade tubulära väggar. De seminifera tubuli innehåller endast Sertoli-celler. (C och D) Detalj av det seminifera epitelet: I kontrollen finns alla könscellstadier upp till mogna spermatozoer. Typiskt för vuxna KS-män är att alla könsceller saknas. Sertolicellerna uppvisar en begynnande vakuolisering. (E och F) Detalj av det interstitiella utrymmet. I kontrolltesen är Leydigcellerna normalt arrangerade i interstitialutrymmena mellan rörväggarna. I vävnaden från en KS-patient är däremot antalet Leydigceller förhöjt och visar typisk hyperplasi. Staplarna representerar 20 μm. Symboler: X: Sertoliceller, *: differentierande könsceller, #: Leydigceller. Färgning: Hematoxylin-Eosin.

Sertolicellerna är belägna i de seminifera tubulerna där de stöder den spermatogena differentieringen genom att ge näring och förmedla endokrin signalering (Wistuba et al., 2007). Alla förändringar i dessa viktiga celler påverkar därför testikelfunktionen i hög grad. Man har funnit bevis för tidig apoptos av Sertoli-celler i KS, vilket har lett till att man har föreslagit att förlust av stöd och kommunikation mellan Sertoli-celler och könsceller kan vara relaterad till den utarmning av könsceller som ses i syndromet (Aksglaede et al., 2006; Wistuba et al., 2010). Sertoli-celler uttrycker androgenreceptorn (AR) och producerar androgenbindande protein och inhibin. Varje störning av cellerna kan därför påverka mängden ITT i de interstitiella utrymmena och följaktligen påverka den endokrina återkopplingen längs hypotalamus-hypofysen-gonadalaxeln. Inga empiriskt robusta bevis för förändrad närvaro, utveckling och/eller funktion av Sertoli-celler kunde erhållas förrän de första systematiska resultaten från de experimentella modellerna blev tillgängliga. Resultaten av de första studierna (Lue et al., 2005) var av särskilt intresse och betydelse eftersom de visade att AR uttrycktes i Sertoli-cellerna hos vuxna XY-kontrollmöss men inte hos XXY-möss. Detta trots att båda djuren hade ett liknande mönster fram till dag 20 postpartum (pp), vilket tyder på att förlusten av AR-uttryck hos XXY-mössen inträffar runt puberteten och tyder på att Sertoli-cellernas mognad kan vara förändrad hos dessa djur, vilket tyder på att de kan påverka eller påverkas av onormal könscellsutveckling. En viss trovärdighet för denna föreställning gavs av en histologisk utvärdering av testiklarna hos 41,XXY*-modellen, där man fann att antalet Sertoli-celler var minskat jämfört med kontrollerna.

De undersökningar som hittills utförts ger tillräckliga bevis för att anta att Sertoli-cellerna förändras hos hanar med en övertalig X-kromosom. För att förstå underlaget för samverkan mellan Sertoli-celler och könsceller, apoptos, mognad och differentiering av Sertoli-celler behövs mer djupgående utvärderingar; studier som kräver stora mängder material och en kronologisk uppföljning av proliferation, differentiering och mognad under en lång tidsperiod. Dessa undersökningar är omöjliga att utföra på människor. Endast med hjälp av musmodellerna kan en meningsfull undersökning av förändringarna i denna viktiga somatiska testikelcell genomföras.

Det har rapporterats att under den testikeldegeneration som observeras i KS degenererar även Sertoli-cellerna med tiden (Aksglaede och Juul, 2013; Aksglaede et al., 2006), en iakttagelse som stämmer överens med data i vår musmodell som visar att Sertoli-cellernas antal förändras under den postnatala utvecklingen (Werler et al., 2014). Sammantaget kräver den förändrade Sertoli-cellfysiologin mer detaljerade analyser av denna somatiska celltyp redan under prenatal utveckling. Könslinjens förökning och differentiering påverkas särskilt av konsekvenserna av den kromosomala aberrationen. Därför kan viktiga kontrollpunkter och följaktligen processer som sker specifikt i könscellerna förändras av den kromosomala obalansen, det vill säga utvecklingen av primordial- och spermatogonialstamcellssystemet (PGC, SSC). Som tidigare nämnts har in vitro-studier visat att aneuploida odifferentierade könsceller dog när de isolerades från embryonala gonader och att endast de med en slumpmässigt korrigerad karyotyp överlevde i kultur (Hunt et al., 1998; Mroz et al., 1999). Således måste SSC med en avvikande karyotyp ha gått in i en standardväg under den intrauterina fasen men senast under den perinatala perioden. När endast könsceller med en korrigerad karyotyp överlever in vitro efter att de isolerats från den embryonala gonadan, medan avvikande könsceller dör med tiden, uppstår frågan varför – in vivo – könscellförlusten fortskrider postnatalt, vilket nyligen visats (Werler et al., 2014). Även om några få avvikande könsceller fortfarande finns kvar i den perinatala testikeln bör en viss andel av dem som finns vid tidpunkten för födseln ha rätt karyotyp och populationen av spermatogoniala celler bör åtminstone förbli stabil om inte föröka sig. Utifrån denna delvis motsägelsefulla observation och om man accepterar det mest rimliga antagandet att korrigering genom slumpmässig framdrivning förklarar överlevnaden av en minskad population av primordiala könsceller (PGC; Mroz et al., 1999; Sciurano et al., 2009) och därefter gonocyter in i den postnatala perioden, kan en del av de överlevande förlora sina stamcellsegenskaper redan före födseln. Uppenbarligen går de förlorade under den peripubertala differentieringen medan mycket få kan överleva ibland, uttrycka alla relevanta markörer korrekt och driva foci av spermatogenes. Systematisk utvärdering av de fenotypiska förändringarna under utvecklingen in utero är i sig endast möjlig i en musmodell.

Störningen av HPG-axeln, som orsakar den hypergonadotropa hypogonadism som vanligen ses hos KS-patienter, tillsammans med det föreslagna ökade antalet Leydig-celler i testikelbiopsier har lett till hypotesen att Leydig-cellernas funktion och/eller mognad skulle kunna påverkas av den könskromosomala obalansen. Leydigcellerna är steroidogena och är källan till testosteron som är viktigt för utvecklingen av den friska manliga fenotypen och avgörande för att den normala spermatogenesen skall fortsätta och slutföras.

Som för de andra aspekterna av KS är den begränsande faktorn för en djupgående undersökning den begränsade tillgången till testikelvävnad. I och med att manliga 41,XXY*-möss blev det möjligt att undersöka Leydigceller från hanar med en övertalig X-kromosom. Med hjälp av denna modell bekräftade vi förekomsten av Leydigcellshyperplasi som bestämdes med stereologisk mikroskopi och fann också att ITT-nivåerna liknade dem hos kontrollmössen (Wistuba et al., 2010). Detta var förvånande med tanke på de låga T-nivåer i serum som ses hos både KS-patienter och 41,XXY*-möss (Lanfranco et al., 2004; Smyth och Bremner, 1998; Wistuba, 2010). I linje med de låga cirkulerande T-nivåerna var resultatet att när Leydigcellerna från KS-modellen togs ut ur testikelmiljön, odlades in vitro och normaliserades med avseende på cellantal, var deras funktion faktiskt förändrad. Den var dock inte försämrad, som man först skulle tro, utan hyperaktiverad. När mRNA-uttrycksprofilerna för markörgenerna Tsp2 (trombospondin 2: ett matricellulärt protein av fetalt ursprung som främst uttrycks i juvenila Leydigceller), Rlf (relaxin-like factor: markör för mogna Leydigceller), Est (östrogen-sulfotransferas: markör för mogna Leydigceller) och LHR (LH-receptor: undersöktes för korrelation med experiment för stimulering av Leydigceller, se senare) bestämdes. De isolerade XXY* Leydigcellerna uppvisade en mogen mRNA-uttrycksprofil och en signifikant högre transkriptionell aktivitet jämfört med kontrollerna (Wistuba et al., 2010; O’Shaughnessy et al., 2002). Genuttrycksanalysen visade en övergripande ökning av uttrycket av XXY* Leydigcellsspecifika gener med Est uttryckt ungefär 20 gånger, Rlf 8 gånger, Tsp2 5 gånger och LHR 3 gånger högre än vildtyp Leydigceller. Stimulering av XXY*-leydigcellerna in vitro visade på en mogen LH-receptor som reagerade ännu starkare på stimulering med humant koriongonadotropin (hCG, ett surrogat för LH) än celler från kontroller. Dessutom var den steroidogena aktiviteten hos XXY*-leydigcellerna förhöjd, i och med att mer T per cell producerades som svar på hCG.

Dessa spännande resultat leder inte bara till ett nytt koncept om ursprunget till hypergonadotropisk hypogonadism, utan visar också på giltigheten hos KS-musmodellen, med dess direkta translationella konsekvenser för vår förståelse av KS-patienter. Resultaten från musmodellen tyder på att Leydigcellfunktionen inte är nedsatt i sig, vilket tyder på att andra faktorer i testikelmiljön är ansvariga för den störda androgenendokrinologi som ses hos KS-patienter. I synnerhet eftersom vi även hos patienterna kunde bekräfta att ITT-värdena inte skiljde sig från kontrollerna (Tüttelmann et al., 2014). Möjligen kan den förändrade testikelarkitekturen i samband med sjukdomen försvåra den endokrina transporten till cirkulationen, ett förslag som stöddes av fynden att KS-patienter också har minskad blodkärlsdiameter (Foresta et al., 2012). Med hänsyn till detta försökte vi hitta en möjlig ”vaskulär” förklaring till bristen på T-frisättning i det testikulära blodomloppet. I testikelbiopsier från patienter är en tillförlitlig analys av kärlen dock inte möjlig på grund av den bias som följer av dissektionstekniken som kräver att man undviker större blodkärl för att förhindra blödning. Följaktligen utvärderades blodkärlssammansättningen i hela testissektioner från vuxna 41,XXY*- och 40,XY*-möss av hankön. Förhållandet mellan blodkärl och testikelyta, med korrigering för XXY*-musens mindre testiklar, var faktiskt betydligt lägre hos dessa möss jämfört med XY*-kontrollerna. Sammanfattningsvis verkar testikelns T-produktion inte vara nedsatt hos män med KS. Uppgifterna från musmodellen låter oss spekulera i att en minskad kärltillförsel kan vara inblandad i en lägre frisättning av T i blodomloppet.