A haploid genetic screen for glucose dependence

多くの不死化細胞株では栄養の柔軟性が低く、主要炭素源としてグルコースに強く依存していることが分かっている。 我々は、ヒトハプロイドHap1細胞株の生存には、培養液中のグルコースが必要であることを見出した。 このような「グルコース中毒」に関与する因子を同定するために、ハプロイド遺伝子スクリーニング15を行い、グルコースが全くない状態で生存する変異体を単離した。 レトロウイルス遺伝子トラップベクター16で1×108個のHap1細胞を低増殖率でランダムに変異誘発し、変異誘発集団をグルコース欠乏培地中で12日間培養した。 大半の細胞（>99%）を死滅させた後、グルコース枯渇に耐性のある細胞を回収し、栄養豊富な培地で増殖させた。 耐性集団からの遺伝子トラップ挿入部位は、逆PCRベースのイルミナシーケンスを用いて同定した17。 選択された集団では、SLC3A2/4F2hc（399の異なる挿入）およびxCT/SLC7A11（39の挿入）遺伝子がレトロウイルス統合によって高い頻度で破壊された（図1a）。 驚くべきことに、これらの遺伝子のタンパク質産物は、SLC3A2サブユニットを重鎖、SLC7A11サブユニットを軽鎖と呼び、システムxc-あるいはxCTアンチポーターとして知られるアミノ酸アンチポーターを形成し、物理的に相互作用することが知られている18。 xCTアンチポーターは、細胞表面でシスチンと交換にグルタミン酸を排出するアミノ酸トランスポーターである。 シスチンはシステインの酸化二量体であり、主要な抗酸化物質であるグルタチオン（GSH）の合成に重要な前駆体であるため、この交換は細胞の活性酸素種（ROS）に対する防御に重要である19。 わかりやすくするために、機能的なトランスポーターを「システムxc-」または「xCTアンチポーター」、軽鎖サブユニットをSLC7A11と呼ぶ。

(a) グルコース枯渇を生き抜いたHap1細胞で、SLC3A2およびSLC7A11遺伝子に見つかった遺伝子トラップ挿入を描いたものである。 黒い長方形はエクソン、青いマークは挿入事象を表す。 非選択集団と選択集団の遺伝子トラップ挿入数を片側フィッシャー正確検定で解析し、P値を算出した。 (b）WTのHap1（WT）、AC6（SLC7A11遺伝子トラップクローン）およびAC24（SLC3A2遺伝子トラップクローン）細胞におけるSLC3A2およびSLC7A11レベルのウェスタンブロット分析。 (c) 培地中へのグルタミン酸放出量の定量化。 値はWTに対して正規化した。 データは平均±s.d.を表す（n=3）; **P<0.01; unpaired Student’s t-test. (d,e) グルコース離脱24時間後の細胞生存率の代表画像（d）および定量化（e）、ビヒクル（DMSO）または500μMスルファサラジン（SASP）投与時。 スケールバー、200μm。 データは平均±s.d.を表す（n=3）。

これらの遺伝子破壊の細胞的影響を特徴付けるために、SLC3A2およびSLC7A11遺伝子トラップ挿入を有するHap1クローンを単離した。 SLC3A2変異体（AC24）は、SLC3A2の第2イントロンに遺伝子トラップが挿入されており、遺伝子破壊に予想される方向で、SLC3A2の発現を示さないことが判明した。 これは、SLC3A2がSLC7A11と結合して安定な複合体を形成する必要があるため、予想されたことである（図1b）。 AC6と呼ばれるSLC7A11変異体は、SLC7A11の第1エキソンの5′非翻訳領域に遺伝子トラップ挿入があり、タンパク質（図1b）およびmRNAレベルでSLC7A11の発現が大きく減少している（補足図1）。 SLC3A2レベルはAC6ではほとんど影響を受けていない。これはおそらくSLC3A2サブユニットがいくつかのアミノ酸トランスポーターに共有されているためであると考えられる18。 両クローンとも培地へのグルタミン酸放出量が低下しており（図1c）、システムxc-が機能的に破壊されていることが確認された。 重要なことは、両クローンともグルコース欠乏条件下で生存率が非常に向上していることである（図1d,e）。 24時間のグルコース欠乏の後、両クローンの細胞の>70%が生存しているのに対し、親Hap1細胞はわずか10%しか生存していない。 この結果と一致して、Hap1細胞をシステムxc-阻害剤であるスルファサラジン（SASP）20で処理すると、WT Hap1細胞のグルコース断絶後の生存率が改善した（図1d,e）。

System xc- regulates cell viability during glucose withdrawal

遺伝子スクリーニングの結果を独立して確認するために、ショートヘアピンRNA（shRNA）を用いてHap1細胞のsystem xc-を安定的にノックダウンした（図2a）。 SLC3A2はいくつかのアミノ酸トランスポーターの共通重鎖として多面的な機能を持つため18、我々はSLC7A11サブユニットに焦点を絞ってノックダウンを試みた。 2種類の独立したSLC7A11 shRNAのいずれかを導入した細胞は、培地中に放出するグルタミン酸が大幅に減少した（Fig. 2b）。 また、グルコース除去後の生存率が大幅に向上した（Fig. 2c）。 しかし、グルコース含有培地では増殖率に変化は見られなかった (補足図 2a)。

(a) SLC7A11ノックダウンHap1およびSLC7A11過剰発現HeLa細胞におけるSLC7A11タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。 (b)培地中へのグルタミン酸放出量の定量化。 データは平均±s.d.を表す（n=4）; **P<0.01; unpaired Student’s t-test; scr, scrambled shRNA.データは平均±s.d.を表す（n=4）。 (c,d)グルコース離脱後24時間での細胞生存率。 SLC7A11ノックダウンHap1細胞（c）およびSLC7A11過剰発現HeLa細胞（d）は、グルコース欠乏培地にビヒクル（DMSO）、500μM SASPまたは4mM dm-αKGを入れて24時間培養し、データは平均値±s.dを表す。 (n=3); vector: empty vector.

逆に、内因性SLC7A11が少ない細胞株でsystem xc-レベルを上げると、グルコース離脱に対して細胞が感作されるのかどうか考えてみた。 Hap1細胞と比較して、HeLa細胞はSLC7A11サブユニットをほとんど検出できないレベルで発現しており（図2a）、培地へのグルタミン酸放出量も少なかった（図2b）。 興味深いことに、対照のHeLa細胞は、グルコースの除去に直面しても高い生存率を示した（Fig.2d）。 SLC7A11サブユニットを過剰発現させると、グルタミン酸放出量が大きく増加し（図2a,b）、グルコース枯渇時の細胞死が大きく増加した（図2d）。 しかし、グルコース含有培地では、SLC7A11を過剰発現させたHeLa細胞の増殖率はコントロールと比較して変化が見られなかった（補足図2a）。 このように、SLC7A11の過剰発現はグルコース中毒を引き起こすのに十分である。 低グルコース（上記実験ではグルコースなしに対して）の培養条件を用いても同様の結果が得られた（補足図2b）。 さらに、SLC7A11のノックダウンおよび過剰発現のいずれも、グルタミン枯渇時の細胞生存率を有意に変化させなかった（補足図2c）。 486>

xCT depletionの利点はグルタミン代謝を必要とする

グルコース離脱に伴い、グルタミンは主要な炭素源となり、その代謝は細胞の生存に不可欠である6，7，8． 細胞内のグルタミンは輸入されると、グルタミン酸に変換され、さらにTCAサイクルの中間体であるα-ケトグルタル酸に変換される。 したがって、システムxc-活性が低い細胞は、細胞内のグルタミン酸レベルを維持し、TCAサイクルに代謝される能力が高いのではないかと推測された。 この考えを検証するために、グルコース離脱1時間後の細胞内グルタミン酸濃度を直接測定した。 SLC7A11ノックダウン細胞（図3a）およびSLC3A2またはSLC7A11遺伝子トラップ変異体（補足図3a）は、グルコース枯渇後の細胞内グルタミン酸濃度を対照細胞よりはるかに良好に維持した。 逆に、SLC7A11を過剰発現したHeLa細胞は、細胞内グルタミン酸レベルがコントロール細胞よりも低かった（図3b）。 GSH合成に対するシステムxc-の既知の役割と一致して、SLC7A11ノックダウンによりHap1細胞の細胞内GSHレベルは低下したが、SLC7A11過剰発現HeLa細胞はコントロール細胞よりも高いGSHレベルを示した（補足図3b）。

(a,b) SLC7A11ノックダウンHap1細胞（a）およびSLC7A11過剰発現HeLa細胞（b）におけるブドウ糖除去前および1時間後のセルラート定量化． データは平均値±s.d. (n=3); **P<0.01; unpaired Student’s t-test を表す。 (c) グルタミン/グルタミン酸代謝に関与する酵素と阻害剤。 (d,e) グルコース離脱後24時間のHap1細胞の生存率。 以下の薬剤を指示通りに添加した。 0.5 mM AOA、50 μM EGCG、10 μM BPTES、または4 mM dm-αKG。 データは平均±s.d.を表す（n=3）。 (f) グルコース枯渇条件下での酸素消費量。 細胞をグルコース欠乏培地（1mMグルタミン）中で3時間インキュベートし、OCRを測定した。 データは平均±s.d.を表す（n＝4）；*P<0.05。 **P<0.01; unpaired Student’s t-test. (g)TCA中間体の同位体標識パターン。 細胞はU-13C5-グルタミンを含むグルコースフリー培地中で8時間インキュベートした後、代謝物を抽出した。 データは平均±s.d.（n=3）を表す。

次に、グルコース離脱時のシステムxc–欠損細胞の細胞生存率の向上にグルタミン／グルタミン酸代謝が重要であるかどうかを検討した。 我々は、グルタミンからグルタミン酸、そしてα-ケトグルタル酸への変換に関わる酵素を阻害する3つの化合物、アミノオキシ酢酸（AOA、アミノトランスフェラーゼ阻害剤）およびエピガロカテキンガレート（EGCG、グルタミン酸脱水素酵素阻害剤）21を試験しました（図3c）。 EGCGで処理すると、SLC7A11（図3d；補足図3c）またはSLC3A2（補足図3c）を破壊したHap1細胞は、グルコース欠乏下で生存率の増加を示さなくなったことから、グルタミン酸脱水素酵素（GDH）がこの効果に不可欠であると示唆された。 GDHはグルタミン酸をα-ケトグルタル酸に変換することから、α-ケトグルタル酸がEGCGの抑制効果を逆転させるかどうかを検討した。 実際、α-ケトグルタレートの細胞透過性形態であるα-ケトグルタレートジメチル（dm-αKG）の補充により、EGCGの阻害効果は完全に回復した（図3e；補足図3d）。 さらに、グルコース離脱時にdm-αKGを補充すると、野生型（WT）およびコントロールshRNA Hap1細胞（図3e；補足図3d）、SLC7A11過剰発現HeLa細胞（図2d）の細胞生存率が大きく向上したが、培地にグルタミンが追加補充されても細胞生存率は大きく向上しないことが分かった（補足図3e）。 したがって、これらの結果は、グルコース欠乏条件下でのシステムxc-破壊の保護効果の根底には、グルタミン酸のα-ケトグルタル酸への変換があることを示唆している。 BPTESやAOAによる効果がないことから、Hap1細胞ではGLS1が主要なグルタミナーゼではなく、アミノトランスフェラーゼではなくGDHがグルタミン酸のα-ケトグルタル酸への変換に重要であることが示唆された

グルコースがない場合、ミトコンドリアOXPHOS（ATP合成の主要源としての）は生存に不可欠となる。 グルコースがない場合、ミトコンドリアのOXPHOSは生存に不可欠である。アナプロシスにより、グルタミン由来のα-ケトグルタレートはTCAサイクルの中間体を補充し、OXPHOSを駆動する基質を生成する21。 そこで我々は、システムxc-のレベルがミトコンドリア呼吸を制御できるかどうかを検証した。 グルコース存在下、SLC7A11ノックダウンHap1または過剰発現HeLa細胞の酸素消費率（OCR）は、コントロール細胞と同程度であった（補足図3f）。 しかし、SLC7A11ノックダウン細胞はグルコース枯渇3時間後に高いミトコンドリア呼吸を示すが、SLC7A11過剰発現HeLa細胞のOCRはグルコース枯渇下でコントロール細胞より低い（Fig. 3f）。

最近の研究により、消費されたグルタミンから生成したα-ケトグルタル酸は、「順方向」の時計回りTCAサイクルによる酸化的代謝と「逆方向」の反時計回りTCA反応による還元的カルボキシル化を経ることが判明した22,23,24。 順方向と逆方向のTCAサイクルを介した相対的なフラックスは、細胞外のグルタミンを安定な13C-同位体標識（C5）し、TCAサイクル中間体へのラベルの取り込みを測定することで決定できる22,23,25。 xc-システムの調節によってTCAサイクルの順方向と逆方向のフラックスが変わるかどうかを調べるために、SLC7A11ノックダウンHap1または過剰発現HeLa細胞をグルコース非存在下、U-13C5-グルタミンとともに培養した（方法参照）。 細胞外のU-13C5-グルタミンに暴露したところ、細胞内のグルタミンとグルタミン酸がほぼ完全に標識(M+5)された(補足図3g)。 標識されたグルタミン酸は、α-ケトグルタル酸へのアナプロティック反応を経てTCAに入り、TCA前方中間体のコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸がM+4標識された（Fig.3g）。 クエン酸（還元的TCA生成物）のM+5ラベルは、逆方向のTCAフラックスが低いことを示すように、はるかに少ない程度（約8：1 M+4：M+5 citrate）しか観察されなかった。 486>

xCT regulates of breast cancer cells dependence on glucose

xc- システムがグルタミン代謝と呼吸に及ぼす負の効果に関する我々の観察を拡張するために、我々はCancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) プロジェクト26から947のがん細胞株の遺伝子発現データを分析した。 各がん種について、15-20個のがん細胞株をSLC7A11の高発現群と低発現群に分類し、この2群間で遺伝子セットの濃縮解析を行った。 その結果、SLC7A11低発現群ではOXPHOSに関連する遺伝子が濃縮されており、特に肺がん細胞株（P値=0.018）、乳がん細胞株（P値=0.039）において顕著であることがわかりました。 さらに、59個の乳癌細胞を解析した結果、SLC7A11の発現とミトコンドリアOXPHOS遺伝子との間に顕著かつ選択的な負の相関が見られた（補足図4a,b）。 このことから、SLC7A11の発現が低い乳がん細胞の多くは、OXPHOS装置のアップレギュレーションと一致する発現プロファイルを持ち、逆にSLC7A11の発現が低い乳がん細胞は、OXPHOS装置のアップレギュレーションと一致することが示唆された

我々は、Hs578TとSK-BR-3の二つの乳がん細胞をそれぞれ高および低いSLC7A11発現細胞系の代表として選んだ（補足図4a）。 CCLEの発現データと一致して、Hs578T細胞はSLC7A11の発現量が高く、グルタミン酸を活発に培地に放出していたが、SK-BR-3細胞はSLC7A11の発現量が低く、グルタミン酸の放出が検出できなかった（図4a；補足図5a）。 また、Hs578TとSK-BR-3細胞の代謝状態を、OCRと解糖の活性（細胞外酸 化速度（ECAR））を測定することにより明らかにした。 Hs578T細胞はSK-BR-3よりも低いOCRと低いOCR/ECAR比を示した（図4b,c）ことから、Hs578T細胞はSK-BR-3よりも解糖に依存していることが示唆された。 Hs578T細胞は、Hap1細胞と同様に、グルコース離脱によりほとんどが死滅したが（図4d）、SK-BR-3細胞は抵抗性であった（図4e）。 SLC7A11を欠損させたHs578T細胞は、培地へのグルタミン酸放出が減少し（補足図5a）、グルコース枯渇下で細胞内のグルタミン酸レベルをより効果的に維持することができた（補足図5b）。 重要なことは、SLC7A11のノックダウンにより、グルコース枯渇時のHs578T細胞の生存率が大きく改善されたことである（図4d）。 しかし、SLC7A11を欠損したHs578T細胞は、対照細胞よりも細胞内の活性酸素レベルが高く、抗酸化防御におけるその役割と一致していた（補足図5c）。 逆に、SLC7A11を過剰発現している細胞は、活性酸素レベルが低かった（補足図5c）。 SLC7A11ノックダウンHs578T細胞のグルコース離脱時の生存率は、EGCGとBPTESによって消失し、やはりグルタミン酸からのα-ケトグルタル酸の生産が重要であることが示唆された（Fig.4d)。 予想通り、EGCGまたはBPTES処理の有害な効果は、dm-αKGの補充によって完全に逆転した（図4d）。 BPTESの差動効果（図4dと図3dの比較）は、GLS1がHs578T細胞ではなく、Hap1細胞における主要なグルタミナーゼであることを示唆している。

(a) SLC7A11ノックダウンHs578T細胞とSLC7A11過剰発現SK-BR-3細胞のSLC7A11タンパク質レベル． (b,c)グルコース完全摂取条件下での代謝状態。 OCR (b) および OCR/ECAR 比 (c) は、10 mM グルコース+2 mM グルタミン存在下で測定した。 データは平均±s.d.を表す（n=3）。 (d,e)グルコース離脱24時間後の細胞生存率。 SLC7A11ノックダウンHs578T細胞（d）およびSLC7A11過剰発現SK-BR-3細胞（e）をグルコース欠乏培地で24時間培養し、以下の薬剤を表示通りに添加した。 500 μM SASP、0.5 mM AOA、50 μM EGCG、10 μM BPTES または 4 mM dm-αKG. データは平均±s.d.を表す（n=3）。

SK-BR-3細胞におけるSLC7A11の過剰発現は、グルタミン酸放出を増大し（補足図5a）、同時にグルコース欠乏条件下での細胞内のグルタミン酸維持能を低下させた（補足図5b）。 SLC7A11の過剰発現は、グルコース離脱後にSK-BR-3細胞の実質的な細胞死を引き起こした。 SLC7A11を過剰発現させたSK-BR-3細胞は、グルコース欠乏下でα-ケトグルタル酸が欠乏することが示唆された（図4e）。SLC7A11をノックダウンしたHs578T細胞は、グルコース欠乏後も長時間にわたり呼吸活性を維持できた（補足図5d）。 逆に、SLC7A11を過剰発現させたSK-BR-3細胞は、同じレジーム下でOCRが急減した。 SLC7A11の上流にはNrf2が存在する

Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-like 2, NFE2L2) は、酸化ストレスに関わる多くの細胞保護遺伝子をアップレギュレートする重要な転写因子である27. SLC7A11はNrf2の標的遺伝子として知られているため（参考文献27）、がん細胞におけるNrf2とSLC7A11の発現の相関を調べたところ、SLC7A11の発現は、Nrf2によって抑制されていることがわかった。 Nrf2の発現は、乳がん細胞株59株（R=0.5688）、CCLEの発現データ中のがん細胞株947株すべて（R=0.4306）においてSLC7A11発現と正の相関があった。 さらに、Nrf2標的遺伝子の発現は、947のがん細胞株でSLC7A11の発現と高い相関を示しました。 SLC7A11とNRF2標的遺伝子の相関係数(R)は以下の通り。 NQO1 (+0.4179), GCLC (+0.3283), GCLM (+0.3944) and TXNRD1 (+0.4321).

これらの相関は、Nrf2ががん細胞のサブセットでSLC7A11の発現をサポートしていることを示唆した。 この考えを検証するために、SLC7A11の高発現細胞であるHs578TとMDA-MB-231乳がん細胞でNrf2をノックダウンした。 Nrf2をノックダウンすると、SLC7A11の発現が著しく低下し（図5a、b、e）、グルタミン酸の放出が抑制された（図5c、f）。 重要なことは、Nrf2欠損細胞は、グルコース離脱時の生存率が大幅に改善したことである（図5d,g）。 EGCGで処理するとNrf2ノックダウンによる生存率向上効果が消失することから、ここでも、この生存率の変化はグルタミン酸代謝に依存していることがわかった（図5d）。 さらに、α-ケトグルタル酸の補給は、EGCGの存在下でも、細胞の生存を促進するのに十分であった。

(a) Nrf2およびSLC7A11ノックダウンHs578T細胞におけるSLC7A11タンパク質レベルのウェスタンブロット。 (b）Nrf2およびSLC7A11ノックダウンMDA-MB-231細胞におけるNrf2およびSLC7A11 mRNAレベルのリアルタイムRT-PCR解析。 測定値は、18 s rRNA レベルで正規化した。 データは平均±s.d.を表す（n=3）; **P<0.01、unpaired Student’s t-test. (c,d) Nrf2およびSLC7A11ノックダウンHs578T細胞の解析。 (c)培地へのグルタミン酸放出量。 データは平均値±s.d. (n=3); **P<0.01; unpaired Student’s t-test. (d)グルコース離脱24時間後の細胞生存率。 EGCG（50μM）およびdm-αKG（4mM）を指示通りに添加した。 データは平均±s.d.を表す（n=4）。 (e-g）MDA-MB-231細胞を、グルコース補充培地中で24時間、ビヒクル（DMSO）または15μM DMFで処理した。 追加の操作として、SLC7A11またはNrf2のノックダウン、およびSLC7A11の過剰発現を行った。 (e) DMF処理時のSLC7A11レベルのウェスタンブロット。 (f) 培地へのグルタミン酸放出。 DMF前処理後、細胞をDMFを含まない新鮮なグルコース欠乏培地でインキュベートし、2時間後に培地中に放出されたグルタミン酸を測定した。データは平均±s.d.を表す（n=4）。 (g) グルコース枯渇の24時間後の細胞生存率。 DMF前処理後、細胞をDMFを含まない新鮮なグルコース欠乏培地でさらに24時間インキュベートしてから、細胞生存率を測定した。 データは平均±s.d.を表す（n=4）；NT、無処理。

Nrf2アップレギュレーションの効果を調べるために、細胞を細胞透過性のNrf2活性化剤であるジメチルフマレート（DMF）28で処理した。 DMF処理によりMDA-MB-231細胞はSLC7A11の発現とグルタミン酸の放出を高度に誘導した（図5e,f）。 さらに、DMFで前処理した細胞は、グルコース枯渇時の生存率が対照細胞に比べて大幅に減少した（Fig. 5g）。 DMF処理のこれらの結果は、SLC7A11とNrf2の両方に依存していることを示すことで、オフターゲット効果を除外した（図5f,g）。 これらの結果から、Nrf2-SLC7A11軸は、グルタミン酸代謝、がん細胞のグルコース依存性、および代替炭素源としてグルタミンを利用する能力を制御していることが明らかとなった。 486>

xCT regulates mitochondrial function in mtDNA-mutant cells

Our findings above shows that cells with system xc- upregulation due to oxidative stress may have restricted nutrient flexibility due to impaired glutamine metabolism.がん細胞の酸化ストレスへの適応が、特にグルコース中毒表現型の強化を通して栄養柔軟性を損なうことが示唆される。 ミトコンドリア呼吸鎖の阻害は、活性酸素を増加させる可能性がある29,30。 我々は、ミトコンドリア機能を阻害する薬剤、特に OXPHOS 機構の complex I (NADH dehydrogenase) と V (ATP synthase) をそれぞれ阻害する rotenone と oligomycin によって、SLC7A11 の発現が誘導されることを明らかにした（補足図 6a）。 これらの薬理学的結果と一致するように、複合体IのND1サブユニットまたは複合体VのATP6サブユニット（NARP）のホモプラスミックmtDNA変異を有するサイブリッド細胞では、SLC7A11が発現上昇した（図6a）30, 31. SLC7A11の誘導は、特に活性酸素が多く、ミトコンドリアの活性酸素消去酵素であるMnSODの誘導が報告されているNARP細胞株で顕著であった30)。 NARPサイブリッド細胞におけるSLC7A11の誘導は、Nrf2およびAtf4転写因子に強く依存し（補足図6b）、抗酸化物質N-アセチルシステインによる処理で抑制することが可能であった（補足図6c）。

(a) 143Bと同種のmtDNA変異ND1およびNARP細胞におけるSLC7A11レベルのウェスタンブロット． (b-e）SLC7A11ノックダウンまたはエラスチン（Era）処理（5μM）ND1およびNARP細胞を10mMガラクトースおよび2mMグルタミンの存在下で培養して分析したもの。 (b) ガラクトース培養後24時間における細胞内グルタミン酸の定量。 データは平均値±s.d.を表す（n=4）; ** P<0.01; unpaired Student’s t-test. (c)ガラクトース培地での3日間の細胞生存率。 データは平均値±s.d. (n=4)を表す。 (d) ガラクトース培養24時間後のミトコンドリア形態の代表画像と定量化。 データは平均値±s.d. (n=3)を表す。 スケールバー、10μm。 (e)ガラクトース培養後24時間における酸素消費量を測定した。 データは平均値±s.d.を表す（n=5）; **P<0.01; unpaired Student’s t-test. (f) xCTアンチポーターの二重作用のモデル。 xCTアンチポーターは、グルタミン代謝をTCAサイクルからGSH合成に迂回させ、抗酸化機能に重要な働きをする。 ある種の細胞条件下では、TCAサイクルからのグルタミンの過剰な転用は有害であり（中段）、したがってアンチポーターの阻害は生存を改善する（右段）。

我々は、システムxc-の発現におけるこれらの代償変化がサイブリッド細胞の細胞代謝に影響するかどうかを調査した。 SLC7A11の高い発現と一致して、ND1およびNARPサイブリッドは、細胞内のグルタミン酸レベルが低かった（図6b）。 SLC7A11のノックダウンや強力な阻害剤であるエラスチンによるxc-システムの阻害は、ND1とNARP細胞において細胞内グルタミン酸を増加させた。 同様に、グルタミン酸代謝の産物である細胞内α-ケトグルタル酸もSLC7A11の阻害により増加した（補足図6d）。 OXPHOSに欠陥のある細胞は、ガラクトース含有培地では生存率が低く、ATP生成源としてOXPHOSに高い要求を強いられることが以前から知られている32。 ND1 および NARP 変異体サイブリッドは、同種の WT 143B 細胞とは異なり、ガラクトース含有培地では生存できなかった (Fig. 6c; Supplementary Fig. 6e)。 しかし、SLC7A11ノックダウンまたはエラスチン処理により、ND1およびNARPサイブリッドのガラクトース培地での生存能力は強く回復した。 この効果は、SLC7A11の誘導がはるかに大きかったNARP細胞において最も顕著であった（図6c）。

この細胞生存率の増加は、ミトコンドリア形態が顕著に正常化することと相関していた。 私たちのグループは以前、WT細胞はOXPHOS活性の増強が必要な培地条件下でミトコンドリアを伸長させるが、mtDNA変異を持つ細胞はその代わりにミトコンドリアを断片化させることを報告した33。 この結果と一致するように、ND1 および NARP 細胞は、ガラクトース培養 24 時間後に顕著なミトコンドリア の断片化を示した。 一方、SLC7A11ノックダウンまたはエラスチン処理した細胞は、培地の炭素源をグルコースからガラクトースに切り替えたとき、ミトコンドリアの大幅な伸長を示した（図6d；補足図6f）。 SLC7A11のノックダウンにより、Opa1、Mfn1、Drp1などのいくつかのミトコンドリア動態タンパク質のレベルは変化しなかった（補足図6g）。 さらに、SLC7A11ノックダウン細胞は、コントロール変異細胞よりも高い呼吸活性を示した（Fig. 6e）。 これらの結果から、mtDNA変異体細胞においてシステムxc-を阻害すると、ミトコンドリアの形態と呼吸が改善され、その結果、ガラクトース培地での生存率が顕著に向上することが示唆された

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