Abstract

Humana embryonala stamceller (hESCs) har stor potential för behandling av olika degenerativa sjukdomar. Pluripotenta hESC har en stor förmåga att genomgå obegränsad självförnyelse i kultur och att differentiera till alla celltyper i kroppen. Resan för hESC-forskningen är inte så smidig, eftersom den har stått inför flera utmaningar som inte bara är begränsade till tumörbildning och immunrejektion utan även till sociala, etiska och politiska aspekter. Isolering av hESCs från det mänskliga embryot anses vara mycket förkastligt eftersom det kräver att det mänskliga embryot förstörs. Frågan debatterades och diskuterades på både offentliga och statliga plattformar, vilket ledde till att hESC-forskning förbjöds i många länder runt om i världen. Förbudet har haft en negativ inverkan på framstegen inom hESC-forskningen eftersom många federala regeringar runt om i världen har stoppat forskningsfinansieringen. Efteråt upphävde vissa länder förbudet och tillät finansiering av hESC-forskning, men skadan har redan gjorts på forskningens framsteg. Under dessa ogynnsamma förhållanden gjordes fortfarande vissa framsteg när det gäller att isolera, odla och karakterisera hESCs med hjälp av olika strategier. I denna översikt har vi sammanfattat olika strategier som använts för att framgångsrikt isolera, odla och karakterisera hESCs. Slutligen har hESCs ett stort löfte om kliniska tillämpningar med lämpliga strategier för att minimera teratombildning och immunrejektion samt bättre celltransplantationsstrategier.

1. Embryonala stamceller: Tidig upptäckt och isoleringsförfarande

Embryonala stamceller (ESC) isolerades först från musembryon 1981, och ordet ”embryonala stamceller” myntades för första gången av Gail R. Martin. Trots detta fick världen kännedom om ESC med den banbrytande upptäckten 1998, då Thomson och hans team för första gången visade en teknik för att isolera hESC-celler från mänskliga embryon. Därefter har forskare visat att hESCs har en förmåga att differentiera sig till alla kroppsceller, inklusive betaceller i Langerhansöarna, neurala celler, kardiomyocyter och hepatocytliknande celler. HESC:s pluripotenta förmåga har gett hopp till miljontals patienter som lider av diabetes, Parkinsons sjukdom, kardiovaskulära sjukdomar och leversjukdomar. Med tanke på att hESC har stora terapeutiska möjligheter har flera hESC-linjer genererats över hela världen. En av utmaningarna med hESC var metoden för isolering av stamceller från mänskliga embryon, eftersom hESC endast kan erhållas från den inre cellmassan (ICM) i mänskliga embryon . Forskare rapporterade att ICM kan erhållas från antingen färska eller frysta mänskliga embryon. Därefter utvecklades flera metoder för att isolera ICM från ett enda mänskligt embryo, bland annat mekanisk dissektion, där ICM isoleras genom mekaniskt tryck . ICM kan också isoleras med hjälp av laserdissektion och med hjälp av immunokirurgiska förfaranden . Det finns olika fördelar med att använda ett immunokirurgiskt förfarande för att isolera ICM, men det medför också vissa nackdelar. Till exempel kräver det immunkirurgiska förfarandet kulturmedier som innehåller marsvinsserum, och användningen av djurserum gör att den immunkirurgiska tekniken inte lämpar sig för framställning av hESC-linjer av klinisk kvalitet. I en annan metod kan hESC-linjer isoleras från ICM genom mikrodissektion av mänskliga blastocyster med hjälp av fina nålar. Laserassisterad biopsi är också den mest lovande tekniken för xeno-fri isolering av ICM . Efter isolering av ICM odlas stamcellerna för att generera ESC med hjälp av feederlager, extracellulära matriser, proteiner, peptider och syntetiska polymerer . För- och nackdelar med olika metoder för ICM-isolering sammanfattas i tabell 1.

Isoleringen av ICM kräver att mänskliga embryon förstörs, vilket har gett upphov till allvarliga etiska problem . För att lösa den etiska frågan har forskarna visat ett alternativt tillvägagångssätt för att isolera hESCs från en enda blastomera utan att döda eller förstöra det mänskliga embryot. Under preimplantatorisk genetisk testning kan till exempel en embryobiopsi med en enda blastomera tas från patienter (; Klimanskaya et al., 2009). Det har rapporterats att 5 hESC-linjer framgångsrikt har erhållits från en enda blastomerbiopsi . Hur väl man lyckas få fram hESC-linjer av god kvalitet beror på blastocysternas kvalitet, isoleringsmetoderna och odlingsförhållandena. Det rapporterades att 2 hESC-linjer erhölls från 4 blastocyster, medan endast 3 hESC-linjer kunde isoleras från 13 blastocyster och, i vissa fall, endast 3 hESC-linjer kunde isoleras från 58 blastocyster . Dessa skillnader i isoleringen av hESC-linjer från olika blastocyster beror huvudsakligen på embryonens kvalitet och beror också på metoden för isolering av embryon och odlingsprotokoll . Om ett embryo till exempel erhålls genom en in vitro-befruktningsmetod finns det en stor möjlighet att embryona kommer att ha en hög förekomst av postzygotiska kromosomavvikelser, vilket i slutändan kan ge en dålig kvalitet på hESC:er .

I möss kan pluripotenta stamceller också härledas från epiblasten av embryon i postimplantationsstadiet, allmänt kända som epiblaststamceller. Dessa pluripotenta stamceller uppvisar primära egenskaper och är i hög grad beroende av aktivering av FGF- och activin-signalvägarna för sin självförnyelse . Följaktligen har tre distinkta pluripotenta tillstånd, nämligen naiva, primade och grundpluripotenta tillstånd, definierats hos möss.

2. Odling av hESCs med eller utan matarceller

När blastomeren har samlats in odlas den normalt tillsammans med föräldrarnas biopsiembryo i ett medium som innehåller fibronectin och laminin. Tillsatsen av laminin i odlingsmediet är viktig för bildandet av embryonala stamcells- (ESC-) liknande aggregat. Dessutom finns det rapporter som tyder på att tillsats av serumfria medier och fibroblasttillväxtfaktorer ökar stamcellsspridningen och förhindrar att embryonala stamceller genomgår differentiering . Vi har kortfattat beskrivit olika odlingsförhållanden som har använts för att förbättra både kvalitet och kvantitet vid generering av hESCs.

2.1. Musmatningsceller för att odla hESCs

Musembryonala fibroblastceller (MEF) eller musmatningsceller anses vara de viktigaste elementen för hESCs eftersom MEF ger gynnsamma förhållanden för tillväxt och expansion av hESCs (figur 1). Det har rapporterats att MEF är mycket viktiga för en framgångsrik generering av hESC-linjer . Dessutom har alla tidiga hESC-linjer odlats i medier som innehåller tillväxtfaktorer och cytokiner som utsöndras av MEF-celler, och dessa tillväxtfaktorer och cytokiner är nödvändiga för att bibehålla stamcellernas pluripotens. Eftersom MEF härstammar från en mus har det inneburit allvarliga etiska och hälsomässiga problem för hESC-celler. Dessutom kan användningen av djurbaserade celler överföra infektiösa patogener från djur till hESC-celler och göra dem olämpliga för användning hos människor. Det har rapporterats att MEF-celler innehåller viruspartiklar som kan infektera hESC:er under odling . Vissa forskare har dessutom använt serum från nötkreatur för att odla hESC:er, men användningen av serum från djur kan överföra prion- och djurvirus till odling av embryonala stamceller . Det har rapporterats att djurbaserade celler och serum kan överföra virus och andra patogener till embryonala stamceller genom cellcellsinteraktion under in vitro-odling . Dessutom kan dessa patogena molekyler kontaminera hela hESC-kulturen. Om hESC:er kontamineras med sådana patogener kan kontamineringsproblemet kvarstå även om hESC:er senare överförs till odlingsförhållanden som inte är fria från djur. Ett annat problem med matarceller från mus och serum/proteiner från djur är att de också innehåller icke-mänsklig sialinsyra (Neu5GC) som också kan utgöra ett allvarligt kontamineringsproblem för hESC:er . Det har till exempel rapporterats att sialinsyra från djur metaboliskt tränger in på cellytan hos hESC och kontaminerar embryonala stamceller .

Figur 1

Kultur av humana embryonala stamceller: humana embryonala stamceller kan odlas på matarceller från mus (MEF).

2.2. Nonanimal Feeder Cells to Grow hESCs

För att undvika djurbaserade produkter och kontaminering över artgränserna har forskare utvecklat odlingsmedier som inte innehåller animaliska komponenter och som samtidigt stödjer tillväxt och expansion av embryonala stamceller. Det har rapporterats att mänskliga celler kan användas för hESC-odling; till exempel har mänskliga äggledarceller , fetal förhud , fetal muskel och hud , transgena stromaceller från fosterlever , benmärg , navelsträng , placentaceller och endometrieceller rapporterats stödja stamcellsodling och -expansion. Bland dessa mänskliga celler erbjuder mänskliga navelstromaceller en bättre källa till matarceller som också kan samlas in med en icke-invasiv metod, medan användningen av matarlager från förhud, foster eller benmärg ger upphov till vissa etiska betänkligheter.

Förutom matarceller erbjuder mänskliga cellinjer också ett alternativ till matarceller från mus. Nyligen har flera hESC-linjer tagits fram och förökats med hjälp av en kommersiellt tillgänglig mänsklig förhudsfibroblastlinje . Endometrialceller har också visat sig vara effektiva för in vitro-odling av stamceller . Ett annat sätt att eliminera risken för kontaminering med animaliska patogener är att använda feederlager som härrör från den mänskliga stamcellslinjen . Basic fibroblast growth factor (bFGF) har visats produceras endogent av mänskliga feederceller som används i hESC-kultur (; Liu et al., 2014). Dessa feederceller utsöndrar också TGFβ och activin A som är involverade i att upprätthålla pluripotensen hos ICM . Trots att den har olika fördelar har feedercellsberoende hESC-kultur många begränsningar; till exempel är underhållet av feederlagren arbetskrävande med alltför stor variation mellan feedercellspopulationer. Denna skillnad kan ha en negativ inverkan på hESC-anspråket för användning på människor.

2.3. Feederfri odling för att odla hESCs

Eftersom både animaliska och mänskliga feederceller har begränsningar har forskare utforskat och framgångsrikt utformat kemiskt definierade odlingsmedier för att odla hESCs, och det bästa med de definierade medierna är att de inte innehåller några feederceller. Ett av de första tillvägagångssätten som prövades för feederfria tillväxtmedier var användningen av extracellulära matrisproteiner tillsammans med tillväxtfaktorer för att skapa en in vitro-kulturbetingelse för stamcellernas proliferation och förnyelse (figur 2). Bland dessa proteiner användes Matrigel oftast i kombination med tillväxtfaktorer eller konditionerat medium för att odla hESC-celler. Trots olika fördelar visade sig Matrigel ha för många variationer i sin sammansättning, vilket innebar problem för odling av hESC. Användningen av Matrigel ger också upphov till kliniska problem eftersom några partier Matrigel har rapporterats vara kontaminerade med det enkelsträngade mus-RNA-viruset – laktatdehydrogenasehöjande viruset . Förutom Matrigel har även fibronectin, laminin och kollagen typ IV varit bra kandidater för xeno-fri hESC-odling, och cellerna kan växa upp till 20 passager . En referens rapporterade att ICM från mänsklig placenta användes för att odla hESC-celler, och de fann en stark genetisk stabilitet i 40 passager. Dessutom odlades hESC i xeno-fria kulturmedier upp till 80 passager.

Figur 2

Kultur av humana embryonala stamceller: humana embryonala stamceller kan odlas på den extracellulära matrisen, till exempel Matrigel.

O tveklöst har användningen av kemiskt definierade medier tillsammans med proteiner avsevärt förbättrat odlingen av hESCs. Dessutom användes också olika proteiner och rekombinanta proteiner för att förbättra hESC-kulturen under xeno-fria förhållanden. Bland dessa fanns E-cadherin, E-cadherin/laminin 521 och kinashämmare tillsammans med bFGF som är kända för att orsaka en robust proliferation av stamceller under xenofria förhållanden . Syntetiskt utformade bäddytor användes också för att stimulera stamcellskultur (Melkoumian et al., 2010); till exempel har Corning Synthemax Surface, en syntetisk akrylatyta som är konjugerad med vitronectin, visat sig förbättra inte bara hESC-kolonier utan även expansion av stamceller (Kawase et al., 2014). Wu et al. beskrev nyligen användningen av ett nytt syntetiskt material isolerat från spindelsilkesproteiner som ett lämpligt substrat för att stimulera hESC-kultur (Wu et al., 2014). Många polymerbaserade syntetiska ytor har också rapporterats stödja tillväxt och expansion av hESC-linjer (Melkoumian et al., 2010; Brafman et al., 2010; Villa-Diazet al., 2013). Förteckningen över olika kemikalier som används för att förbättra odlingen av hESCs visas i tabell 2.

3. Multilineage potential hos hESCs

En av de främsta egenskaperna hos hESCs är att de kan differentiera sig till alla tre linjerna ektoderm, mesoderm och endoderm (figur 3). Eftersom hESC är pluripotenta stamceller har de unika möjligheter att differentieras till alla typer av kroppsceller, till exempel kan hESC differentieras till neuroner, hjärtceller, hepatocyter och muskelceller. Det har rapporterats att hESC:er först bildar embryokroppar som i grunden är strukturerade med tre groddlager. Dessa embryokroppar bildas av pluripotenta hESC som odlas i tredimensionell (3D) kultur och som uttrycker genetiska markörer för alla tre könsskikten . Pluripotenta hESC har en enorm förmåga att differentiera (tabell 3) till binjureceller och keratinocyter , insulinproducerande celler , neuronala celler , hjärtceller , leverceller och ö-liknande organoid . Vissa tillväxtfaktorer som retinosyra och nervtillväxtfaktorer används för att få hESC att differentiera sig till funktionella neuroner. Dessutom används vissa linjespecifika tillväxtfaktorer för differentiering till kardiomyocyter, hepatocyter, skelettmuskler, bukspottkörtelceller och njurceller. Dessa differentierade celler testas också för att undersöka deras funktionalitet både in vitro och in vivo. Denna potential hos hESC:er att utvecklas i flera led har visat sig vara avgörande för cellbaserad terapi för att behandla olika degenerativa sjukdomar. Det är lätt att differentiera olika typer av celler från hESCs, men det är svårt att få fram ett stort antal differentierade mogna celler för terapeutiska tillämpningar . För att få stora, mogna och funktionella differentierade celler bör odlingsmedierna innehålla linjespecifika tillväxtfaktorer. Det är också viktigt att generera stora mängder celler från hESCs eftersom de behövs för celltransplantation, och detta kan uppnås genom att odla hESCs och differentierade celler i en bioreaktor under kontrollerade förhållanden .

Figur 3

Multilineage-potential hos humana embryonala stamceller: Humana embryonala stamceller kan differentieras till tre groddjurskikt såsom ektoderm, mesoderm och endoderm.

4. Testning av hESCs med hjälp av in vitro- och in vivo-modeller

Efter en framgångsrik differentiering av hESCs till olika celltyper är nästa logiska steg att undersöka om de differentierade cellerna som härrör från dem har någon funktionalitet eller inte. Funktionaliteten hos stamceller och differentierade prekursor- eller mogna celler undersöktes ingående både in vitro och in vivo. Funktionaliteten hos differentierade neuroner, kardiomyocyter, hepatocyter och andra typer av celler testades i olika djurmodeller . Det konstaterades att transplantation av neuroner i djurmodellen för Parkinsons sjukdom ledde till en partiell återhämtning av funktionen . Transplantationen av hESC och deras differentierade celler testades i djurmodeller för kardiovaskulära sjukdomar, stroke, diabetes och ryggmärgsskador . Bland djuren har smågnagare som råttor och möss varit de arter som valts ut för att studera celltransplantation. Små gnagare är dessutom lätt tillgängliga och kan lätt manipuleras både kirurgiskt och genetiskt. Trots olika fördelar med små gnagare är mus- och råttförsökens förmåga att förutsäga effekten av stamcellsbaserad terapi fortfarande omtvistad, eftersom många mus- och råttmodeller inte representerar mänskliga sjukdomsfenotyper. För att lösa detta problem har forskarna börjat arbeta med stora djur som ligger nära människans anatomi och fysiologi. Bland de stora djuren anses hundar, getter, får och icke-mänskliga primater vara bättre modeller än möss/råttor för stamcellstestning. En av de största fördelarna med att använda stora djur är deras längre livslängd, och många anatomiska och fysiologiska parametrar ligger mycket närmare människan. Även om dessa djurmodeller visar att stamcellerna effektivt levereras till värdvävnaden, har man fortfarande inte uppnått fullständig funktionell och beteendemässig återhämtning. Ytterligare forskning krävs för att utveckla djurmodeller som ligger nära människans sjukdom.

Trots dessa framsteg inom hESC-forskningen är en viktig utmaning för hESC-baserad cellterapi den allogena immunavstötningen av hESC-avledda celler från mottagare . Det visade sig att inom en vecka dog alla transplanterade stamceller på grund av det starka immunsvaret från värden som genererades hos djuren. För att stoppa de transplanterade stamcellernas död injicerades djuren med immunosuppressorer för att undertrycka den immunitet som utlösts av stamcellstransplantationen. När djuren fick immunosuppressorer eller läkemedel som tacrolimus och sirolimus kunde hESC-cellerna överleva endast i 28 dagar och började därefter dö. Vi känner inte till orsaken till detta, men en bristande förståelse av cellcellsinteraktionen kan vara en av orsakerna. Det är viktigt att testa hESC:er eller differentierade celler under in vitro-förhållanden före djurförsök. In vitro-modeller ger bättre möjligheter att studera cell-cellinteraktion, cellmigration eller cellintegration på ett mycket detaljerat sätt, vilket kanske är mycket svårt att studera på djur. Detta problem skulle kunna mildras genom ett nyligen genomfört genombrott inom tekniken för inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) genom nukleär omprogrammering av patientspecifika somatiska celler med definierade faktorer, som skulle kunna bli en förnybar källa till autologa celler för cellterapi. En viktig fördel med iPSC för cellterapi hos människor är att patientspecifika iPSC är autologa, och därför har man antagit att de celler som härstammar från dem kan transplanteras till samma patient utan att man behöver oroa sig för immunavstötning . Nya studier som avslöjar onormal epigenetik, genomisk stabilitet och immunogenicitet hos iPSC:er har dock gett upphov till säkerhetsproblem när det gäller iPSC-baserad terapi .

5. Terapeutiska tillämpningar av hESCs

Eftersom hESCs är mycket lovande för patienter som lider av degenerativa sjukdomar har olika försök gjorts för att utforska den terapeutiska potentialen hos människor. Huvudsyftet med stamcellsbaserad terapi är att återställa eller reparera förlorade eller skadade kroppsceller eller vävnader. För att hESC:er ska vara lämpliga för kliniska tillämpningar måste de härledda stamcellerna tillverkas i enlighet med United States Food Drug Administration (USFDA), Current Good Manufacturing Practices (cGMP) respektive Guidelines for the Clinical Transplantation of Stem Cells (riktlinjer för klinisk transplantation av stamceller). Kemikalier, reagenser, celler, maskiner och instrument som används i stamcellsodlingen bör genomgå säkerhets- och hälsokontroller, och alla tillverkningsprocesser måste övervakas och dokumenteras i enlighet med cGMP-riktlinjerna. Om vi analyserar hur många av de för närvarande använda hESC-linjerna uppfyller cGMP-riktlinjerna, kommer man att finna att många av hESC-linjerna inte uppfyller cGMP-riktlinjerna, eftersom många hESC-linjer exponeras för immunogena eller patogena animaliska komponenter under sina isolerings- och förökningsstadier. En annan orsak till att riktlinjerna för cGMP inte uppfylls är att de flesta hESC-odlingar har utförts i universitetslaboratorier, där många av dessa forskningslaboratorier inte uppfyller riktlinjerna för cGMP. Fram till i dag är det endast ett fåtal forskare som kan producera hESC-linjer enligt cGMP-riktlinjerna.

Med tanke på de potentiella kommersiella fördelarna med hESC:er har ett fåtal bioteknikföretag också deltagit i finansieringen av stamcellsforskningen med det enda syftet att kommersialisera stamcellsprodukter. Dessa företag har börjat tillverka hESCs under cGMP-förhållanden och börjat testa stamceller i klinisk miljö. År 2009 ansökte Geron Corporation (ett bioteknikföretag med säte i Kalifornien) hos FDA om att få inleda sin första kliniska prövning med celler från hESCceller. Den kliniska prövningen inleddes i oktober 2010, där tre patienter med ryggmärgsskador injicerades med 1,5 miljoner oligodendrocytprekursorceller från hESCs . Försöket avbröts oväntat och vi känner inte till orsaken, förmodligen för att de preliminära resultaten av försöket visade att cellerna från hESC inte ledde till någon märkbar förbättring av ryggmärgsskadan. Dessutom godkände FDA också en annan prövning för användning av hESC-celler vid makuladegeneration . Ett annat företag, Advanced Cell Technology i Marlborough, Massachusetts, har inlett kliniska försök med hESCs. Cellerna injicerades i patienter som led av Stargardts muskeldystrofi och åldersrelaterad torr makuladegeneration. De retinala pigmentepitelcellerna (RPE) som härstammar från hESCs användes . I studien administrerades RPE-cellerna till patienterna, och efter fyra månaders posttransplantation konstaterades det att patienterna uppvisade smärre förbättringar av synfunktionen utan någon indikation på immunavstötning eller något tecken på teratombildning . Stamceller testades också på patienter med typ I-diabetes, där pankreatiska prekursorceller administrerades till patienterna.

6. Sammanfattning och slutsats

Humana embryonala stamceller har stora terapeutiska möjligheter för behandling av olika sjukdomar som cancer, Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom och diabetes. Både in vitro- och in vivo-studier tyder på att det fortfarande finns hopp om att framtida embryonala stamceller kommer att ge botemedel mot olika sjukdomar. Men framgången för stamcellsbaserad terapi är beroende av att det finns tillgång till mogna och funktionella celler. För att få fram mogna och funktionella celler är det bättre om stamcellerna odlas under tredimensionella (3D) odlingsförhållanden. De flesta hESC-linjerna erhålls genom tvådimensionella (2D) odlingsförhållanden. Det finns några begränsningar med att använda 2D-odling, eftersom hESC som har odlats i 2D-betingelser inte representerar mänskliga celler i människokroppen och de flesta av de 2D-odlade hESC som odlats i 2D-betingelser rapporteras dö omedelbart efter celltransplantationen; de celler som överlevde misslyckas fortfarande med att reparera kroppens vävnader. Detta problem kan hanteras genom att odla hESCceller i 3D-förhållanden, där cellerna kan växa i tre riktningar och chanserna för cellernas överlevnadsförmåga ökar efter celltransplantationen. En annan viktig punkt att beakta för en framgångsrik stamcellsbaserad terapi är att noggrant utvärdera stamcellsbaserade celler i djurmodeller innan de testas på människor. Cell-cellintegration, cell-cellkommunikation, cellmigration och cellfunktionalitet måste utvärderas grundligt i djurmodeller med hjälp av både kort- och långtidsförsök. Frågan om traumabildning och immunrejektion måste också lösas genom att utveckla stamcellslinjer som inte orsakar immunrejektion och som inte bildar tumörer efter transplantation. Detta kan uppnås genom att man tystar de gener/molekylära vägar som utlöser tumörbildning respektive immunrejektion. Dessutom kräver cellbaserad terapi också många mogna celler, och ansträngningarna bör också inriktas på att isolera en stor mängd stamceller och deras föregångare genom ett nytt innovativt tillvägagångssätt och en ny metodik. Slutligen har mänskliga embryonala stamceller fortfarande ett stort löfte för behandling av olika degenerativa sjukdomar samt diagnostiska tillämpningar.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Författarnas bidrag

Detta manuskript är godkänt av alla författare för inlämning.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma mot hela ledningen för Institute for Research and Medical Consultations (IMRC), Imam Abdulrahman Bin Faisal University, Dammam, Konungariket Saudiarabien, för deras stöd och uppmuntran.