3.06.4.1.1 Saccharomyces élesztő

Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a Saccharomyces élesztő képes a xilulózt etanollá erjeszteni, bár nem hatékonyan. Így elméletileg a Saccharomyces élesztőből csak a xilóz xilulózzá történő átalakításához szükséges enzim(ek) hiányzik(ek). A fent leírtak szerint a baktériumok a xilózt egyetlen enzimmel alakítják át xilulózzá, amely nem igényel kofaktorokat (3. ábra). Ezzel szemben az élesztő xilóz-xilulóz rendszeréhez két enzimre volt szükség, amelyek a fent leírtak szerint metabolikusan nem ideálisak. Kezdetben világszerte közel 10 különböző laboratórium próbált meg egy bakteriális xilóz-izomeráz gént élesztőbe klónozni. A Purdue Egyetemen dolgozó Ho és munkatársai voltak az első csoport, akiknek sikerült klónozniuk a xilóz-izomeráz gént az Escherichia coliból. A klónozott bakteriális gén által élesztőben szintetizált fehérje azonban nem rendelkezett xilóz-izomeráz aktivitással.

A második megközelítés a P. stipitisből származó XR és XD gének Saccharomyces élesztőbe történő klónozása volt. Ezen enzimek kinetikája és a reakció termodinamikai egyensúlya azonban az etanol helyett a xilit termelésének kedvez. Az 1990-es évek elején három csoport (Kotter, Ciriacy és munkatársai a Düsseldorfi Egyetemen, Tantirungkij és munkatársai az Oszaka Egyetemen, valamint Hahn-Hägerdal és munkatársai a Lundi Egyetemen) jelentette az XR és XD gének sikeres klónozását a Saccharomyces élesztőbe, hogy az képes legyen xilóz erjesztésére. Az e csoportok által kifejlesztett rekombináns élesztő azonban rendkívül lassan erjesztette a xilózt, és kevés etanolt termelt; a fő metabolikus termék a xilit volt.

A Ho csoport feltételezte, hogy a P. stipitisből származó XR és XD mellett a natív xilulokináz (XK) túlterjesztése javítja a xilóz anyagcserén keresztül az etanollá történő átfolyását a xilulóz intracelluláris koncentrációjának csökkentésével. Mivel a xilulokináz irreverzibilis reakciót katalizál az etanoltermelés felé (3. ábra), a magas xilulokináz-aktivitás alacsony xilulózkoncentrációt eredményez. Ez azért kívánatos, mert az XD-katalizált reakció egyensúlya a xilitnek kedvez, és a xilulóz alacsony állandósult koncentrációjára van szükség ahhoz, hogy a metabolikus fluxust az etanoltermelés irányába irányítsuk. Továbbá e három gén klónozása lehetővé tette a sejtben történő kifejeződésük szabályozását. A sejt natív expresszió-szabályozó rendszere szerint expressziójukat a xilóz jelenléte indukálja, a glükóz pedig gátolja. Az így kapott rekombináns élesztő képes lehet a glükóz és a xilóz egyidejű kofermentációjára etanollá, a glükóz és a xilóz fermentációja közötti hosszú késleltetési idő nélkül, ami rendkívül kívánatos lenne az etanol ipari előállítása szempontjából.

1989-ben a Purdue-i Ho csoport számolt be először a Saccharomyces élesztőből származó xilulokináz gén klónozásáról. Ezt követően a Ho csoport az XR, XD és XK szerkezeti gének upstream DNS-szekvenciáit hatékony konstitutív promótereket tartalmazó glikolitikus gének upstream szekvenciáival helyettesítette. Az így kapott XR, XD és XK géneket egy magas példányszámú 2μ plazmidra klónozták, és az így kapott plazmidot, a pLNH32-t egy olyan vad típusú ipari Saccharomyces élesztő törzs transzformálására használták, amelyről ismert, hogy kiválóan alkalmas etanol előállítására keményítő (glükóz) felhasználásával. 1993-ban ugyanez a csoport számolt be a rekombináns Saccharomyces élesztő 1400 (pLNH32) sikeres kifejlesztéséről, amely nagy koncentrációjú xilózt szinte teljes mértékben etanollá tudott erjeszteni, melléktermékként nagyon kevés xilit mellett. Ezenkívül az így kapott élesztő képes volt a glükóz és a xilóz együttes erjesztésére etanollá anélkül, hogy a két cukor erjedése között jelentős késleltetési idő telt volna el, bár a xilóz erjedési sebessége lassabb, mint a glükózé (4. ábra). Ezt követően az 1400 (pLNH 32) felépítésének és fejlesztésének részleteiről számoltak be. Azóta a Ho csoport különböző újszerű megközelítésekkel továbbfejlesztette az élesztőt az alábbiak szerint.

4. ábra. (Balra) Az 1400-as Saccharomyces élesztőtörzs transzformálva a pLNH32 szülő plazmiddal, amely vagy nem tartalmaz XR, XD vagy XK géneket, vagy csak XR-t és XD-t tartalmaz, de XK-t nem, glükóz és xilóz keverék fermentálására használták. (Jobbra) Klónozott XR, XD és XK géneket tartalmazó pLNH32 plazmiddal transzformált 1400 élesztő. Az élesztőt glükóz és xilóz fermentálására használtuk a bal oldali ábrán leírt eredményekkel azonos körülmények között. Az e plazmidokba klónozott géneket a 9. hivatkozásban leírtakkal azonos módon módosítottuk és konstruáltuk.

A klónozott XR-XD-XK gént tartalmazó pLNH32 2 μ plazmid egy olyan széles gazdaplazmid, amelyet úgy terveztek, hogy bármilyen Saccharomyces élesztőtörzset képes legyen átalakítani, beleértve az ipari vad típusú Saccharomyces élesztőt is. Egy ilyen plazmid felhasználható a cellulóz etanol előállítására alkalmas jobb gazdaszervezetek szűrésére. A Ho csoport egy egyedülálló új génintegrációs technikát is kifejlesztett, amely lehetővé teszi több gén hatékony integrálását az élesztő kromoszómába több példányban. Ez a technika könnyen kivitelezhető, és szinte garantálja, hogy az integrációs plazmidra klónozott és a gazdaszervezet élesztősejtjeibe transzformált gének annyi példányban integrálódnak a gazdaszervezet genomjába, ahány példányban a legjobb aktivitást biztosítják (5. ábra). Ezt az integrációs technikát alkalmaztuk a stabil xilóz-fermentáló 1400-as törzs, az 1400 (LNH-ST) kifejlesztéséhez úgy, hogy először az XR-XD-XK géneket együtt, kazettaként integráltuk az élesztő kromoszómába annyi példányban, hogy az így kapott élesztő a legnagyobb hatékonysággal fermentálta a xilózt (6. ábra). A Ho csoport által kifejlesztett jelenlegi legjobb törzset, a 424A (LNH-ST) törzset 10 különböző Saccharomyces élesztőtörzsből szűrték ki úgy, hogy először minden egyes törzset a pLNH32 2 μ plazmiddal transzformáltak, hogy megbizonyosodjanak arról, hogy ezek a törzsek képesek a xilóz, valamint a glükóz/xilóz kofermentálására hatékonyan a pLNH32 jelenlétében, majd a géneket a kiválasztott élesztőtörzsek kromoszómájába integrálták, hogy ezzel az új integrációs technikával kialakítsák a “stabil élesztőt”. A glükóz/xilóz 424A (LNH-ST) általi kofermentációját a 7. ábra mutatja.

5. ábra. Az XR-XD-XK gének többszörös kópiájának fokozatos integrációjának bemutatása a Saccharomyces 259-es élesztőtörzs kromoszómáiba a Ho et al. által leírt módszerrel. Az integráció különböző szakaszaiban lévő élesztőket glükóz és xilóz fermentálására használtuk azonos körülmények között, hogy demonstráljuk e gének integrációjának előrehaladását: a) az integráció kezdeti szakaszában, b) 25%-os befejezés, c) 50-75%-os befejezés, d) az integráció befejezése után. Az integráció befejezését mutatja, hogy az integrációs folyamatból származó sejtek kellően hosszú ideig ugyanazt a fermentációs eredményt produkálják.

6. ábra. Glükóz és xilóz kofermentációja 1400 (LNH-ST), amely az élesztő kromoszómákba integrált XR-XD-XK gének többszörös kópiáját tartalmazza a Ho et al. módszerével .

7. ábra. Glükóz és xilóz kofermentációja 424A (LNH-ST) rekombináns Saccharomyces törzzsel, amely a Saccharomyces 424A törzs élesztő kromoszómáiba integrált XR-XD-XK gének többszörös kópiáját tartalmazza a Ho et al. módszerével . Ez a legjobb Ho-Purdue élesztő, amelyet a Purdue Egyetemen 2007 előtt fejlesztettek ki, és amelyet jelenleg az iparnak biztosítanak cellulóz etanol előállításához.

Ha egy rekombináns mikroorganizmust nagyüzemi termelésre használnak, például etanol előállítására, akkor két fő okból szükséges a klónozandó géneket a gazdaszervezet kromoszómáiba integrálni. Az egyik az, hogy ha a klónozott géneket megbízható módszerrel integrálják a gazdakromoszómákba, akkor a klónozott gének a gazdakromoszómán speciális vegyszerek, közegek, antibiotikumok és adalékanyagok használata nélkül tarthatók fenn. A tulajdonságok fenntartásához szükséges vegyszerek vagy antibiotikumok nemcsak a vegyszerek költségeit növelik, hanem a hatósági engedélyezési folyamat és az esetleges szennyvizek tisztítása is költségekkel és nehézségekkel jár. A gének gazdasejtekbe történő klónozásához használt nagy példányszámú plazmidok, mint például a pLNH32, még szelektív szer jelenlétében sem biztos, hogy képesek fenntartani a nagyüzemi működést. A Ho csoport kimutatta, hogy az új integrációs rendszerrel kifejlesztett 1400 (LNH-ST) nevű stabil élesztő képes volt fenntartani a kukoricatábla-hidrolizátumok folyamatos erjesztését etanollá egy kísérleti üzemben, míg az 1400 (pLNH32) plazmidot tartalmazó élesztőtörzs erre nem volt képes.

A 424A (LNH-ST) törzset és más stabil törzseket, az 1400 (LNH-ST) és a 259 (LNH-ST) törzseket, amelyeket az új integrációs technikával fejlesztettek ki, mások is validálták, és fenntarthatónak és hatékonynak bizonyultak a cellulóz etanol előállítására különböző lignocellulóz alapanyagokból származó hidrolizátumokkal. A 424A (LNH-ST) törzset 2004 óta iparilag is használják cellulóz etanol előállítására mezőgazdasági maradékból egy demonstrációs üzemben.

A Hahn-Hägerdal által kifejlesztett rekombináns élesztőt különböző további gének klónozásával széles körben továbbfejlesztették, beleértve a xilulokináz gén klónozását, miután a Purdue Egyetem Ho csoportja kimutatta, hogy e natív gén fokozott expressziója javítja az etanolhozamot xilózból .

A Ho csoport által Purdue-ban kifejlesztett élesztő elérhető az ipari cellulóz etanolgyártáshoz. Valószínűleg jó esélye lesz a sikerre, mivel ez egy ipari etanoltermelő élesztő, és széles körben tesztelték. A Purdue csoport a közelmúltban továbbfejlesztette a törzset azáltal, hogy az arabinózt a másik négy cukorral (glükóz, xilóz, mannóz és galaktóz) együtt erjesztette, valamint hogy ellenállóbbá tette az etanollal és az ecetsavval szemben.

Noha a korai kísérlet egy xilóz-izomeráz alapú Saccharomyces xilóz-fermentáló élesztő kifejlesztésére nem volt sikeres, és kifejlesztettek egy hatékony XR/XD alapú mesterséges xilóz-fermentáló élesztőt, a xilóz-izomeráz alapú xilóz-fermentáló élesztő kifejlesztése iránti érdeklődés az évek során folytatódott, részben azért, mert ezen az útvonalon nincs redox egyensúlyhiány. 2009-ben Brat és munkatársai xilóz-fermentáló S. cerevisiae-t konstruáltak a Closteidium phytofermentansból származó xilóz-izomeráz felhasználásával. Szintén 2009-ben a Cargill egy olyan nem-Saccharomyces élesztőtörzs kifejlesztéséről számolt be, amely xilóz-izomerázt expresszál, és alacsony pH-n és 1%-os ecetsav jelenlétében képes hatékonyan erjeszteni glükóz és xilóz keverékét.

Noha az arabinóz csak kis mennyiségben van jelen a fűfélék biomasszájában a GAX hemicellulóz részeként, néhány speciális biomasszaforrás, például a kukoricaszál viszonylag nagy mennyiségű arabinózt tartalmaz. Mindazonáltal ideális, ha a cellulóz etanolt előállító mikrobák képesek a cellulóz biomasszában jelen lévő mind az öt különböző cukormolekula erjesztésére, mivel a folyamatfolyamatok újrahasznosítása egy ipari folyamaton belül növelheti a kisebb komponensek koncentrációját .

Az arabinóz anyagcseréjének mechanizmusa a mikroorganizmusokban ugyanolyan bonyolult, mint a xilóz anyagcsere. Az élesztőben az arabinóz anyagcsere mechanizmusa ismét különbözik a baktériumokétól . A xilóz anyagcseréhez hasonlóan az élesztő anyagcsere mechanizmusa nem kedvez az anaerob anyagcserének. Hahn-Hägerdal és munkatársai nemrégiben továbbfejlesztették a xilóz-fermentáló Saccharomyces élesztőt, hogy az arabinózt a xilózzal és más cukrokkal együtt fermentálja a gombák l-arabinóz útvonalán . Az így létrehozott mesterséges élesztő azonban továbbra sem volt képes az arabinózt jelentős mennyiségű etanollá erjeszteni, de kis mennyiségű arabinózt arabittá tudott átalakítani.