Articles

Mi az a szélesmezős képalkotás?

by admin

Bevezetés

Minden olyan mikroszkópos technikát, ahol a teljes minta fénynek van kitéve, “szélesmezős” képalkotásnak nevezünk. A szélesmezős képalkotás ellentéte a konfokális, ahol tűlyukakat használnak a mintába érkező és onnan érkező fény nagy részének blokkolására. Ez a cikk a szélesmezős képalkotást és a mikroszkópiában leggyakrabban használt szélesmezős technikákat tárgyalja.

Szélesmezős mikroszkópok

A szélesmezőben a teljes mintát egy lámpás fényforrás világítja meg alulról (függőleges mikroszkóp) vagy felülről (fordított mikroszkóp). A függőleges mikroszkópokat gyakran használják rögzített minták, például kezelt és mikroszkópos tárgylemezre rögzített sejtek vagy szövetek esetében, míg a fordított mikroszkópok gyakran jobbak folyadékba merített minta leképezésére, mivel az általában az aljára süllyed, és a mikroszkóp objektívjeivel alulról könnyebben látható. Ez lehetővé teszi a szuszpenziós sejtek leképezését, mivel az élettudományokban vizsgált sejtek jellemzően vagy adherensek (felülethez tapadva nőnek), vagy szuszpenzióban nőnek (folyadékban szuszpendált sejtek). A függőleges és a fordított mikroszkóp példái az 1. ábrán láthatók.

1. ábra: Függőleges vs. fordított mikroszkópok. Balra) Függőleges mikroszkóp: felülről megfigyelt és alulról megvilágított kép. Jobbra) Fordított mikroszkóp: alulról megfigyelt és felülről megvilágított kép. Mindkét mikroszkóp használhat epifluoreszcens megvilágítást is, amikor a fényforrás és a kép ugyanazon az objektíven halad át. A transzvilágítás olyan technikákat foglal magában, mint a fáziskontraszt és a DIC, amelyeket alább tárgyalunk. A kép a Molecular Probes-tól származik.

A szélesmezős mikroszkópok általában fehér fényforrást (például lámpát) használnak, ami néhány szűrővel kiegészítve elegendő a fluoreszcens munkához. Ez egyszerűbbé teszi a képalkotást és kisebbé a képfájlok méretét is, ami megkönnyíti a szélesmezős munkát olyan alkalmazásokban, mint például a sejtdokumentáció.

Szélesmezős technikák

A szélesmezős mikroszkópia technikáira példa a fénytér, a differenciális interferencia kontraszt (DIC), a fáziskontraszt és a szélesmezős fluoreszcencia.

A fénytéri mikroszkópia a mikroszkópia hozzáférhető formája, ahol a teljes mintát erős fény világítja meg. Ez a megközelítés kevés mintaelőkészítést igényel, és gyorsan és egyszerűen használható élő sejtek ellenőrzésére vagy kiegészítő adatok előállítására. A kontrasztanyag használata azonban erősen ajánlott, mivel a legtöbb sejtminta átlátszó, és festék vagy festék nélkül nehéz lesz felbontani. A sejtek többnyire vízből állnak, és átlátszó üvegen vagy műanyagon történő képalkotás esetén nehéz lehet a kisebb struktúrák kiemelése kiegészítő kontraszt nélkül.

A differenciális interferencia kontraszt (DIC) esetében a mintát két polarizált fénysugárra osztott fénnyel világítják meg, amikor ezek a sugarak újra egyesülnek, a fáziseltolódásbeli különbségek kontrasztként jelennek meg a végső képen. A fáziskontraszthoz hasonlóan ez a technika sem alkalmas vastagabb mintákhoz, és több technikai beállítást igényel, mint más technikák.

A fáziskontrasztos mikroszkópia a fénymezőnél jobb kontrasztot biztosít a mintából szórt fény felhasználásával. Azáltal, hogy a mintát egy fénygyűrűvel világítják meg, és a mikroszkóp keresője előtt egy másik gyűrű van, a minta azon részei, amelyek eltérő módon szórják a fényt, sötétebbnek vagy világosabbnak tűnnek a képen, így nagyobb kontrasztot adnak, mint a hagyományos fénymezős mikroszkópia. Ez a jobb kontraszt nem látható vastagabb mintákon, mivel műtermékeket eredményez, de sejtkultúráknál jól működik. Egy példa ezekre a gyűrűkre a 2. ábrán látható.

2. ábra: A felső képen egy fénytér- és fáziskontrasztos mikroszkóp csúszka látható, a jobb szélső kör a fénytérhez, a másik kettő pedig a fáziskontraszthoz használatos, a nagyítástól függően (4x és 10/20/40x a képen). Az alsó képen a DIC vagy fáziskontraszt segítségével felvett minták és az e technikák közötti különbségek láthatók. A képek az Eurotek, Olympus által adaptáltak.

A szélesmezős fluoreszcencia-mikroszkópia hasonló a fénymezőhöz, de meghatározott hullámhosszúságú fényt használnak a fluoreszcens molekulák gerjesztésére, amelyekkel a mintát előkezelték (bár egyes minták természetesen önfluoreszkálóak). A mintákat meg lehet festeni specifikus fehérjék vagy sejtkomponensek fluoreszcens markereivel, majd e markerek fluoreszcens emissziós fénye képet alkot. A fluoreszcens jel azt jelenti, hogy más technikákhoz képest jobb a kontraszt, mivel a meghatározott hullámhosszúságú fény használatával csak a fluoreszcens molekulák bocsátanak ki fényt, szemben a teljes kép megvilágításával. Mivel azonban az egész mintát megvilágítják ezzel a fénnyel, a látóterületen kívülről érkező fluoreszcens jelek háttér-fluoreszcenciát és elmosódott képet okozhatnak.

3. ábra: DIC vs. fáziskontraszt vs. fluoreszcens mikroszkópia ugyanazon neuronminta esetében. Balra) DIC, a sejtek azonosíthatók, de az axonok nem, a kontraszt gyenge. Középen) Fáziskontraszt, nagyobb kontraszt, mint a DIC, a sejtek és az axonok könnyen azonosíthatók. Jobbra) Szélesmezős fluoreszcencia, a sejtek és axonok könnyen azonosíthatók, a kiválasztott fehérjéket a fluoreszcens markerek tovább színezik (zöld a β-tubulin, egy neuronális marker, kék a DAPI, egy sejtmag marker). A kép a Leica Microsystems-től származik: Introduction to Widefield Microscopy.

Out-Of-Focus Light

A fő hátránya, hogy mivel az egész mintát megvilágítják, miközben a fókuszsík fényt kap és képet tud generálni, a fókuszsík feletti és alatti síkok is kapnak fényt, ami fókuszon kívüli fényt eredményez, ami képromlást okoz. Különösen fluoreszcencia gerjesztés esetén a széles mezőjű rendszer felbontása korlátozott, mivel a háttérben lévő fluoreszcenciát is rögzíti a kamera, ami csökkenti a jel/zaj arányt.

Egyes szélesmezős technikák kikerülik ezt a problémát, mint például a strukturált megvilágítású mikroszkópia (SIM), amely fénymintákat használ egy összetett minta létrehozásához, a mintainterferencián alapuló képalkotás szuperfelbontási szintű részletességet tesz lehetővé, akár 200 nm-es objektumok felbontásával. A SIM-ről bővebben a honlapunkon található SIM alkalmazásjegyzetben olvashat.

Összefoglaló

A szélessávú képalkotás a legtöbb sejtes vizsgálat alapja, lehetővé téve a kutatók számára, hogy gyorsan és egyszerűen képet készítsenek a mintákról, kevés mintaelőkészítéssel vagy technikai szakértelemmel. A fénymezőtől a fluoreszcenciás képalkotásig a szélesmezős képalkotás egy hatékony és változatos technika, amelyet sok kutató ismer. Bár a technika a konfokális vagy más fejlett mikroszkópiai alkalmazásokhoz képest nem rendelkezik megfelelő felbontással, a szélesmezős képalkotásnak szilárd helye van a kutatásban, és az idő múlásával tovább fog fejlődni.