Global bla KPC-E. coli törzsek változatosak, még a legelterjedtebb ST-n, az ST131-en belül is, és bizonyíték van a helyi átvitelre

45 izolátumot nyertek 11 ország 21 városából, négy kontinensről (2010-2013; a korábbi laboratóriumi tipizálási eredményeket az S1. táblázat foglalja össze.) Egy izolátum bla KPC-negatív volt a teljes genomszekvenálás (WGS; ecol_252) során, mivel az eredeti tipizálás és az azt követő DNS-kivonatolás és a WGS-hez való előkészítés közötti időszakban a tárolás vagy szubkultúra során elveszíthette a bla KPC-t. Az izolátumok közül egy izolátum bla KPC-negatív volt a teljes genomszekvenálás (WGS) során. Egy izolátum esetében a WGS-adatok nem feleltek meg a laboratóriumi tipizálási eredményeknek (ecol_451), ami valószínűleg laboratóriumi keveredést jelentett; az ecol_252 és az ecol_451 izolátumot ezért kizártuk a későbbi elemzésekből. A többi 43 izolátumot sikeresen szekvenálták (a minőségi mutatókat lásd az S1. táblázatban). E 43 izolátum között huszonegy különböző E. coli ST képviseltette magát (1. táblázat; in silico előrejelzés a WGS alapján), többek között: ST131 , ST410 , ST38 , ST10, ST69 (a fennmaradó izolátumok szingleton ST-k).

Az összes KPC-E. coli izolátumban azonosított 16 053 annotált nyitott olvasókeret (ORF) közül csak 2950 (18,4%) volt közös az összes izolátumban (“core”), és további 222 (1,4%) az izolátumok 95- < 100%-ában (“soft core “27). Nukleotidszinten 213 352 egynukleotid-variáns (SNV) volt a core genomban, ami összhangban van a korábban megfigyelt faji diverzitással28. A rezisztenciagén-profilok a törzsek között is jelentős eltéréseket mutattak: egyes törzsek több béta-laktám, aminoglikozid, tetraciklin és fluorokinolon rezisztencia-mechanizmust hordoztak (pl. ecol_224), míg mások csak bla KPC-t (pl. ecol_584; 1. ábra). A 16 KPC-ST131 törzs esetében 4 071/7 910 (51%) ORF volt a mag, és ezen izolátumok maggenomjában 6 778 SNV volt, ami ismét összhangban van az ST131 diverzitásának korábbi globális vizsgálataival23, 24 (S1 ábra). A járulékos genomok néhány (pl. ecol_356/ecol_276/ecol_875), de nem minden (pl. ecol_AZ159/ecol_244) izolátum esetében, amelyek a maggenomjukban szoros rokonságban álltak egymással, nagymértékben egyezőek voltak, ami alátámasztja a mag- és járulékos genomok közötti igen változó evolúciós dinamikát (1. ábra). A mag- és járulékos genomban szorosan rokon izolátumok földrajzi eloszlása alátámasztja egyes KPC-E. coli törzsek helyi (pl. ecol_AZ166, ecol_AZ167 ) terjedését. A bla KPC gének körüli genetikai flanking-motívumok homológiája ezekben a szorosan rokon izolátumpárokban szintén összhangban van ezzel a hipotézissel, és kevésbé áll összhangban a bla KPC többszörös megszerzési eseményével ugyanazon a genetikai háttéren belül, különösen a bla KPC flanking-szekvenciáknak az adathalmaz többi részében megfigyelt változatosságát figyelembe véve (lásd alább).

A globális karbapenem-rezisztenciafelügyeleti rendszerekből azonosított KPC-Escherichia coli filogeniája, 2008-2013. A filogeniától jobbra lévő panelek a közös rezisztenciagén-mechanizmusokat (a rezisztenciagének tipizálásának teljes részletei az S2. táblázatban), valamint a mag- és járulékos genomkomponenseket ábrázolják. A járulékos genom panel esetében a kék szín jelöli a jelenlévő, a fehér pedig a hiányzó annotált régiókat.

A bla KPC gének jelenleg úgy tűnik, hogy az E. coli-ban plazmidkontextusokra korlátozódnak, de létezhetnek több példányban egyetlen plazmidszerkezeten vagy nagy példányszámú plazmidokban

Háromnegyedik izolátum (80%) tartalmazott bla KPC-2-t, kilenc izolátum (20%) pedig bla KPC-3-at. A bla KPC kromoszómális integrációját más Enterobacteriaceae, Pseudomonas és Acinetobacter spp. esetében is leírták, de továbbra is ritka5, 29, 30. A bla KPC kromoszómális integrációjára nem volt bizonyíték sem a 18 kromoszómaszerkezetben, amelyeket a hosszú olvasatú szekvenálásból rekonstruáltak, sem a többi 25 izolátum bla KPC-t tartalmazó (Illumina de novo összeállításokból származó) kontigok annotációinak áttekintése alapján. A bla KPC allélok nem szegregálódtak ST szerint.

A baktérium kromoszómánkénti bla KPC kópiaszám becsült értéke <1 (ecol_879, ecol_881) és 55 (ecol_AZ152) között változott. Kilenc esetben ez a becslés ≥10 bla KPC-kópia volt baktériumkromoszómánként (ecol_276, ecol_356, ecol_867, ecol_869, ecol_870, ecol_875, ecol_AZ150, ecol_AZ152, ecol_AZ159, S2. táblázat). Ezen izolátumok közül hat tartalmazott bla KPC-t col-szerű plazmidkontextusban, két esetben a plazmid replikon típusa ismeretlen volt, egy esetben pedig IncN replikonról volt szó. A plazmid kópiaszám magasabb szintű antibiotikum-rezisztenciával jár együtt, ha a releváns gén magas kópiaszámú egységen található. Érdekes módon a magas kópiaszámú plazmidok a feltételezések szerint nagyobb eséllyel rögzülnek a leszármazó sejtekben, mivel véletlenszerűen és a partíciós rendszerek igénye nélkül jobban eloszlanak31 , és bármely konjugációs esemény során közvetlenül vagy közvetve átkerülnek32,33,34 .

A bla KPC és a nem bla KPC plazmidpopulációk a globális KPC-E. coli törzsekben rendkívül változatosak

A plazmid Inc tipizálás izolátumonként átlagosan négy plazmid replikon típus jelenlétét mutatta ki (tartomány: 1-6; IQR: 3-5), ami széles diverzitást jelent (1. táblázat). Az IncN, col, IncFIA és IncI1 replikonok azonban aránytalanul felülreprezentáltak bizonyos ST-kben (p < 0,05; 1. táblázat). A PacBio szekvenáláson átesett 18 izolátum között 53 zárt, nem bla KPC plazmidot azonosítottunk, amelyek 1 459 bp és 289 903 bp között mozogtak (S1. táblázat; legalább négy további, részben teljes plazmidszerkezet volt jelen). Ezek közül a nem bla KPC plazmidok közül 10 (méret: 2 571-150 994 bp) <70%-os hasonlóságot mutatott a GenBankban elérhető más szekvenciákkal (a százalékos szekvenciaazonosság és a homológiát mutató keresési hossz arányának szorzata alapján), ami rávilágít arra, hogy a KPC-E. coli “plazmidom” egy része továbbra is hiányosan jellemzett. A többi 43 plazmid esetében a GenBankban a legjobb egyezés 35 esetben E. coli, 5 esetben K. pneumoniae, 1 esetben pedig Citrobacter freundii, Shigella sonnei és Salmonella enterica plazmid volt (S3. táblázat).

Huszonkét bla KPC plazmid szerkezetét sikerült teljesen felbontani (17 csak a Pacbio-adatokból, négy csak az Illumina-adatokból, 1 mind a PacBio-, mind az Illumina-adatokból), 14 029 bp és 287 067 bp között (medián = 55 590 bp; IQR: 23 499-82 765 bp). Ezek a bla KPC-t tartalmazó plazmidok, valamint hat további eset, amikor a bla KPC-t replikon-tartalmú kontigon azonosították, az Inc tipizálás alapján igen változatosak voltak (S1. táblázat). Az IncN volt a leggyakoribb típus (n = 8/28 tipizálható bla KPC szerkezet; 29%), amelyet a kis, col-szerű plazmidok követtek (n = 6/28 ; 21%). Egyéb, kevésbé gyakori típusok voltak: A/C2, FII(k), U (mind n = 2); valamint L/M, P, Q1 és R (mind n = 1). Négy (14%) bla KPC plazmid volt multi-replikon konstrukció, nevezetesen: col/repA, FIB/FII, FIA/FII és FIA/FII/R.

A közös IncN plazmid gerincek világszerte elterjedtek az E. coli

A GenBankból kiválasztottuk az összes egyedi, teljesen szekvenált IncN-bla KPC plazmidszekvenciát (S4. táblázat) az összehasonlításhoz, amelyek már 2005-től, a KPC-termelő E. coli legkorábbi jelentéseinek idejéből származnak. A plazmidgerincek és a bla KPC-t körülvevő flanking szekvenciák ebben a 16 plazmidreferenciában és a 12 vizsgált szekvencia egy részhalmazában (lásd “Módszerek”) összhangban voltak két ismert IncN-Tn4401-bla KPC komplex többszörös felvételeivel eltérő E. coli ST-kben: egyrészt egy Plasmid-9 (FJ223607, 2005, USA)-szerű háttéren belül, másrészt egy Tn2/3-szerű elemen belül egy Plasmid-12 (FJ223605, 2005, USA)-szerű háttéren belül.

Első esetben genetikai hasonlóságokat azonosítottunk a Plasmid-9, a pKPC-FCF/3SP, a pKPC-FCF13/05, a pCF8698, a pKP1433 (amely egy hibrid IncN-t képvisel) és az ecol_516, ecol_517, ecol_656 és ecol_736 izolátumokból származó bla KPC plazmidok között (ez a vizsgálat). A plazmid-9 duplikált Tn4401b elemeket tartalmaz fordított orientációban, négy különböző 5 bp flanking szekvenciával, atipikus elrendezésben, egy II. csoportú intrononon35 belül. Az ebbe a csoportba tartozó többi plazmid gerincszerkezete összhangban van a Tn4401b elemnek a pld és traG régiók közötti, a Plasmid-9 szerkezet egy ősi változatán belüli, a flankáló TTCAG target site duplikáció (TSD) keletkezésével járó külön megszerzési eseményével (jelölés: Plasmid 9-like plasmid (hypothetical), 2. ábra). A plazmidok közötti különbségeket – többek között – a nemzetközi elterjedés, majd a fajon belüli és a fajok közötti helyi evolúció magyarázza: (i) nukleotidszintű variáció (minden plazmidban megfigyelhető); ii) kisebb beillesztési/eltávolítási események (minden plazmidban megfigyelhető); iii) nagyobb beillesztési/eltávolítási események, amelyeket transzpozíciós elemek közvetítenek (pl. pCF8698_KPC_2); és iv) valószínű homológ rekombináció, ami hasonló plazmidgerincen belüli klaszteres variációt eredményez (pl. ecol_656/ecol_736), valamint markánsabb átrendeződéseket, beleértve a “hibrid” plazmidok kialakulását (pl. pKP1433) (2. ábra).

A FJ223607-szerű (Plasmid 9-szerű) IncN plazmidok (nyilvánosan elérhető; ez a tanulmány) összehasonlító vázlata, valamint földrajzi eredetük/izolálásuk időpontja. A pirossal jelölt plazmidszekvenciák nevei az e tanulmányban szereplő, a PacBio-adatokból származó, valamint az Illumina-adatokból származó zárt (ecol_517, ecol_656) vagy hiányos plazmidszerkezetek (ecol_516, ecol_736). A plazmidnevek melletti igazított sávok a plazmidszekvenciákat jelölik: a világosszürke a 100%-os szekvenciaazonosságú régiókat jelöli; a fekete a szekvenciák közötti nukleotiddiverzitást; a vékony vonalak pedig az indeleket. A kódoló szekvenciákat az egyes szekvencia-sávok alatti kövér nyilak jelölik, és a színkódolás a színkulcs szerint történik. A szekvenciák közötti genetikai variációt leíró mellékelt séma az azonosított evolúciós események példáit mutatja be: (a) egyetlen nukleotid szintű változás, b) kis indelek (≤100 bp), c) nagy indelek (>100 bp), d) rekombinációs események.

A plazmid-12-ben (FJ223605) a Tn4401b egy hibrid Tn2-Tn3-szerű elembe illeszkedett be (a kapcsolódó gyógyszerrezisztencia génekkel, beleértve a bla TEM-1, bla OXA-9 és több aminoglikozid rezisztencia gént), bár célszekvencia-duplikáció nélkül, valószínűleg egy molekulán belüli, replikatív transzpozíciós esemény eredményeként, amely nem illeszkedő célhely szekvenciákat hoz létre (L TSS = TATTA; R TSS = GTTCT). Ez a komplex viszont két IS15DIV (IS15Δ)/IS26-szerű elem között helyezkedik el, amelyeket 8 bp invertált ismétlődések szegélyeznek, és a traI (891 bp a 3′ végétől) és a pld lokuszok között található (~28 Kb; 3A ábra). Az IncN 12-es plazmid gerincének összetevői megegyeznek az NIH kitörésében5 és a Virginiai Egyetem kitörésében (CAV1043; 2008)6 észleltekkel. E vizsgálat alapján az ecol_224, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_422 plazmidok, valamint az ecol_AZ151, ecol_744 és ecol_AZ150 plazmidok állványai közel azonos szerkezetűek a Plasmid-12-vel, a traJ-traI génekben klaszteres nukleotidszintű variációval, ami összhangban van az ezt a régiót érintő homológ rekombinációs eseménnyel, valamint szórványos beillesztési/eltávolítási eseményekre utaló bizonyítékokkal (3A ábra). A bla KPC-Tn4401 struktúrákat azonban ezekben az izolátumokban szinte teljesen lebontja más mobilis genetikai elemek (MGE-k), köztük a Tn2/Tn3-szerű elemek, az ISKpn8/27 és a Tn1721 jelenléte. Az ecol_224-ben a bla KPC-2 két ismétlődő, invertált Tn3-szerű struktúra részeként épült be az IncN gerinccsontba, amelyet TTGCT TSD flankál, és közelebb van a traI-hoz (136 bp a 3′ végétől), mint a fent említett IS15DIV (IS15Δ)/IS26-szerű komplex a Plazmid-12-ben (3B ábra). Bár a rendelkezésre álló adatok alapján nem lehet pontosan nyomon követni ennek a genomi régiónak az evolúciós történetét, e szerkezet közös szignatúráinak jelenléte az ecol_422, ecol_744, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_AZ150 és ecol_AZ151 mintákban közös megszerzésre, és a bla KPC-2-t flankáló nagyszámú MGE jelenléte által közvetített többszörös későbbi átrendeződésre utal.

A jelen vizsgálatból származó FJ223605-szerű (Plazmid-12-szerű) IncN KPC plazmidok összehasonlító vázlata. 3A panel. Földrajzi eredet, az izolálás dátuma és a plazmid/kontigon szerkezetek általános összehangolása. A pirossal jelölt plazmidszekvenciák nevei az e tanulmányból származó, a PacBio-adatokból és az Illumina-adatokból származó zárt (ecol_224, ecol_422, ecol_881, ecol_AZ159) vagy hiányos plazmidszerkezetek (ecol_744, ecol_AZ151, ecol_AZ150). A plazmidnevek melletti igazított sávok a plazmidszekvenciákat jelölik: a világosszürke a 100%-os szekvencia-homológiájú régiókat jelöli; a fekete a szekvenciák közötti nukleotiddiverzitást; a vékony vonalak pedig az indeleket. A kódoló szekvenciákat az egyes szekvencia-sávok alatti kövér nyilak jelölik, és a színkódolás a színkulcs szerint történik. A szekvenciák közötti genetikai variációt leíró mellékelt séma az azonosított evolúciós eseményekre mutat példákat: (a) egyetlen nukleotid szintű változás, b) kis indelek (≤100 bp), c) nagy indelek (>100 bp), d) rekombinációs események. 3B panel. Közelkép a traI és a pld közötti régióról, amely csak a vizsgált izolátumok bla KPC-2-t tartalmaz. A kódoló szekvenciák színkódolva vannak, mint a 3A. ábrán; a szövegben hivatkozott szekvencia-régiókat megjegyzésekkel láttuk el.

A kol-szerű plazmidok a bla KPC fontos átviteli vektorát jelenthetik az E. coli

A kis col-szerű plazmidok voltak a második leggyakoribb bla KPC-t hordozó plazmidtípus E. coli-ban (n = 5 ), de ezek közül három azonos volt (bla KPC-2, 16 559 bp), mindegyiket Pittsburghben (USA) izolálták ST131 izolátumokból két év alatt (ecol_276 , ecol_356 , ecol_875 ). Ez a három izolátum emellett FIA, FIB, FII, X3 és X4 replikonokat tartalmazott, ami egy klonális törzs + plazmidok időbeli stabil perzisztenciájára utal, ami összhangban van mind az SNV/mag és a járulékos genom elemzésekkel (1. ábra, S1 ábra).

A másik két col-szerű plazmid ténylegesen rövid, különböző mobilizációs géneket (mbeA/mbeC/mbeD) kódoló DNS-szakaszokat jelent, amelyeket a Tn4401/bla KPC modulokhoz csatoltak. A Tn4401-et flankáló 5 bp szekvenciák mindkét esetben összhangban voltak a közvetlen, intermolekuláris transzpozícióval (ecol_870: TGTTT-TGTTT; ecol_867: TGTGA-TGTGA). Egy col/repA kointegrált plazmidot is megfigyeltünk ebben az adatkészletben (ecol_AZ161), amelyben a Tn4401b a colE3 szignifikációs szekvenciák és egy Tn3 elem közé épült be (Tn4401 TSS: AGATA-GTTCT). Az ilyen kointegrált plazmidszerkezetek kialakulása az E. coli esetében is leírtak már korábban36 , beleértve egy fuzionált col/pKpQIL-szerű plazmidszerkezetet (a pKpQIL-t történelmileg a bla KPC-vel hozták összefüggésbe)37.

A col-szerű plazmidokat más kisebb, regionális vizsgálatokban21, 38 is összefüggésbe hozták a KPC-termelőkkel. Aggodalomra ad okot, hogy ezek a kis vektorok bizonyítottan felelősek a fluorokinolon-rezisztenciát közvetítő qnr-gének fajok közötti diffúziójáért, még nyilvánvaló antimikrobiális szelekciós nyomás hiányában is39. A col-szerű plazmidok jelentős társulása bizonyos E. coli ST-khez (túlnyomórészt ST131) ebben a vizsgálatban a bla KPC aránytalan képviseletének egyik magyarázata lehet ebben a vonalban.

A változatos Tn4401 5 bp célhely szekvenciák (TSS) támogatják a nagy transzpozon mobilitást

A bla KPC-2 vagy bla KPC-3-t flankáló teljes Tn4401 izoformákat csak 24/43 (56%) izolátumban figyeltük meg, beleértve a Tn4401a/a-like (n = 10; egy izolátum a bla KPC folyásiránya feletti kontigttöréssel), Tn4401b (n = 12) és Tn4401d (n = 2) változatok. Tizenegy különböző 5 bp-os célhely szekvencia (TSS) párt azonosítottunk, amelyek közül 7 (64%) nem volt megfigyelhető egyetlen GenBankból letöltött összehasonlító plazmidban sem (S5. táblázat). A Tn4401a három, a Tn4401b hét, a Tn4401d pedig egy különböző 5 bp TSS-t tartalmazott. A legtöbb TSD-t jelentett, de három esetben különböző 5 bp TSS-ek flankálták a Tn4401-et, ami összhangban van mind a közvetlen inter-, mind a replikatív, molekulán belüli transzpozíciós eseményekkel.

A GenBank plazmidok teljes készletéből és mások által végzett in vitro transzpozíciós kísérletekből 30 különböző típusú 5 bp TSS-párt jellemeztek, hetet csak kísérleti körülmények között40. A letöltött plazmidok különböző fajokból és időpontokból (2005-2014) származnak, bár a mintavételi torzítások miatt előfordulhat, hogy alulreprezentálják a szélesebb Tn4401 inszerciós helyek diverzitását. Adataink azonban összhangban vannak a Tn4401 E. coli-n belüli jelentős mobilitásával a különböző Tn4401 izoformák megszerzését követően és/vagy más fajokból az E. coli-ba történő többszörös importálással.

A bla KPC hagyományos társulása a Tn4401-hez az E. coli KPC plazmidjaiban jelentősen erodálódott

A többi 19/43 (44%) izolátumban a Tn4401 szerkezetét MGE-kkel való helyettesítés révén degradálták, amelyek közül csak néhányat írtak le korábban41, 42 . Két izolátumnak volt új Tn4401Δb struktúrája (IS26 vagy IS26-ΔIS5075 által végzett upstream csonkítások). Három izolátumban (ecol_227, ecol_316, ecol_583) jelen volt egy Tn4401e-szerű struktúra (255 bp deléció a bla KPC-től felfelé): ezt egy teljes PacBio plazmid-összeállításban (ecol_316) tovább jellemezték, és az ISKpn7 elem L TSS-ének helyén történő átrendeződést jelentett. Ebben a plazmidban egy második, részleges Tn4401 elem is jelen volt bla KPC nélkül, ami egy nem teljes, replikatív, molekulán belüli transzpozíciós eseménynek felel meg (GGGAA = L TSS és R TSS a két Tn4401b elemen, fordított orientációban). A bla KPC-t kísérő egyéb motívumok a következők voltak: Tn2/Tn3 hibrid elemek-ISKpn8/27-bla KPC (n = 1; ecol_224); IS26-ΔtnpR(Tn3)-ISKpn8/27- bla KPC-ΔTn1721-IS26 (n = 5; ecol_AZ153-AZ155, ecol_AZ166, ecol_AZ167); ISApu2-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-klcA-ΔTn1721-IS26 (n = 1; ecol_542); IS26-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC-korC-IS26 (n = 1; ecol_545); hibrid Tn2/Tn3 elemek + ΔblaTEM-bla KPC-ΔTn1721 (n = 2; ecol_744, ecol_422), Tn3 elemek-Δbla TEM-bla KPC- ΔTn1721 (n = 4; ecol_881, ecol_AZ151, ecol_AZ159, ecol_AZ150) és ΔTn3-Δ -ΔIS3000 (Tn3-szerű) (n = 1; ecol_AZ152). Az összeállítás korlátai miatt nem tudtuk felmérni a bla KPC flankáló kontextusát az ecol_452-ben.

A bla KPC gén körüli, egymástól függetlenül szerzett MGE-k e nyilvánvaló változatossága kiterjeszti a bla KPC mobilizálásának eszközeit. Érdekes módon, ahogyan azt korábban megfigyeltük43 , az összes lebomlott Tn4401 szekvencia ebben az adathalmazban változó hosszúságú flankáló Tn2/3-szerű szekvenciákkal társult, ami arra utal, hogy a Tn4401 Tn2/Tn3-szerű kontextusba történő beillesztése lehetővé tehette, hogy ez utóbbi hotspotként működjön más MGE-k beillesztéséhez6. Külön említést érdemel az IS26-hoz való társulás, amely számos más rezisztenciagén elterjedéséhez kapcsolódik E. coli-ban, beleértve a CTX-M ESBL-eket24, 44; képes növelni a szorosan együtt elhelyezkedő rezisztenciagének kifejeződését45; részt vesz a kointegrátumképzésben és ezáltal a plazmid átrendeződésben46; és fokozza más IS26 által közvetített transzfer események előfordulását az IS26-ot tartalmazó plazmidokba46.

.