A jelen tanulmányban az IRE1a-XBP1 útvonal szerepének megértéséhez alapvető stratégiánk egy in vitro Th2 differenciálódási modell használata volt (Ábra. 1b). A naiv T-helper sejteket TCR aktiválással aktiváltuk anti-CD3e/CD28 bevonatú lemezeken Th2 differenciálódási körülmények között 72 órán keresztül, majd 42 órán keresztül pihentettük, és TCR aktiválással újra stimuláltuk anti-CD3e/CD28 bevonatú lemezeken. Az IRE1a-XBP1 útvonal perturbálásához egy jól ismert 4μ8c hatóanyagot használtunk, amely az IRE1a endonukleáz aktivitás gátlásával specifikusan blokkolja az útvonalat . A hatóanyagot 15μM koncentrációban adtuk a táptalajhoz a tenyésztés kezdetén és az aktiváló lemezről a nyugalmi lemezre való átmenet során. A hatóanyag-koncentráció kiválasztását az határozta meg, hogy a legnagyobb IRE1a-gátlási hatékonysággal és a legkisebb sejttoxicitással járjon (Additional file 1: S1 ábra). RNS-szekvenálással összehasonlítottuk a naiv és restimulált Th2 (gyógyszerrel kezelt és nem kezelt) limfociták transzkriptomját, ChIP-szekvenálással (ChIP-szekvenálás) azonosítottuk az XBP1 transzkripciós faktor kötőhelyeit a reaktivált Th2-ben, és integráltuk a genom-szintű adatokat a közvetlen célpontok és szabályozó szerepük előrejelzéséhez.

A T-segítő sejtek in vitro aktiváció során bekapcsolják az IRE1a-XBP1 útvonalat

Az aktivált és differenciált T-segítő sejtek rengeteg citokint választanak ki. Ezért a jól fejlett szekréciós gépezet előfeltétele annak, hogy a sejtek alkalmazkodni tudjanak ehhez a szekréciós stresszhez. Az ER-stressz/UPR útvonal részvételének előrejelzésére a T helper sejtek aktivációja során összehasonlítottuk a naiv és differenciált Th2 sejtek (restimulált Th2) transzkriptomját. Az ebből az összehasonlításból kapott differenciálisan expresszálódó géneket a “Protein Processing in the Endoplasmic Reticulum” KEGG-útvonalba integráltuk, hogy láthatóvá tegyük a fel- vagy leregulált komponenseket. Az elemzés azt mutatja, hogy amikor a naiv T helper sejtek aktiválódnak és Th2 sejtekké differenciálódnak, akkor az ER stressz útvonalban részt vevő gének expresszióját szabályozzák fel (Additional file 1: S2 ábra). Számos olyan faktor, amelyet korábban a fehérjék hajtogatásának és szekréciójának irányítójaként jellemeztek, köztük maga az XBP1 is, felszabályozódik a T-helper sejtek differenciálódása során.

Az előrejelzés validálásához, és kifejezetten az IRE1a-XBP1 útvonal érintettségének vizsgálatához megmértük az IRE1a mRNS és fehérje expresszióját in vitro differenciált és reaktivált Th2 limfocitákban (1b. ábra). A sejteket qPCR és Western blot segítségével elemeztük az mRNS és a fehérje összehasonlítására. Azt találtuk, hogy mind az mRNS-, mind a fehérjeszint felszabályozott volt az aktivált T helper sejtekben (1c. ábra, bal és középső panel). Ismert, hogy az IRE1a foszforilációja jelzi funkcionális állapotát. Megfigyeltük, hogy a fehérje foszforilálódik az aktivált Th2 limfocitákban (1c. ábra, jobb oldali panel). Ez a megnövekedett foszfo-IRE1a a fehérje fokozott szintézisével magyarázható, bár nem zárhatjuk ki a fokozott kinázaktivitás és az autofoszforiláció lehetőségét sem. A Western blot sáv denzitometriai elemzése arra utal, hogy mindkét mechanizmus, a fehérjeszintézis felszabályozása és a fokozott foszforiláció is szerepet játszik. A fehérje upreguláció háromszorosára nőtt, de a foszfo-fehérje 4,5-szeresére emelkedett (1c ábra).

Az aktivált IRE1a spliceli a spliceletlen XBP1 (XBP1u) mRNS-t és egy splicelt XBP1 (XBP1s) mRNS izoformát hoz létre. Megfigyeltük az XBP1 splicelt formájának (XBP1s) növekedését, mind mRNS-, mind fehérjeszinten, a T helper sejtek aktiválásakor (1d, e ábra). Pozitív kontrollként tunikamicint használtunk. Ez egy olyan gyógyszer, amely gátolja az N-hez kötött glikozilációt, és ezáltal a fel nem hajtott fehérjék felhalmozódását okozza (azaz endoplazmatikus retikulum (ER) stressz), és az IRE1a aktivitásának fokozása révén növeli az XBP1s-t. Az IRE1a endonukleáz aktivitásának specifikus gátlása a sejtek 4μ8c-vel történő kezelésével megszüntette mind az XBP1s mRNS-, mind a fehérjeizoformákat, megerősítve, hogy a splicelt forma kialakulása az IRE1a aktivitásától függ (1d, e ábra).

Ezek az eredmények megerősítik, hogy az IRE1a-XBP1 útvonal konzervált a Th2 limfocitákban és felszabályozott az in vitro T helper sejtek aktivációja során. Ezután azt vizsgáltuk, hogy ez in vivo is igaz-e.

In vivo aktivált T helper sejtek felszabályozzák az IRE1a-XBP1 útvonalat

Az IRE1a-XBP1 útvonal in vivo működésének vizsgálatára a CD4+ T sejtekben C57BL/6 egereket fertőztünk meg a Nippostrongylus brasiliensis nevű helmintus parazitával, amely a Th2-vezérelt immunválaszok jól ismert modellje . A fertőzést követő 7 nap elteltével áramlási citometriával elemeztük az XBP1s fehérje expresszióját a T segítő sejtekben. Azt találtuk, hogy a féreggel fertőzött egerek T segítő sejtjei szignifikánsan több XBP1s-t expresszálnak a nem fertőzött kontroll egerekhez képest, ami az útvonal felszabályozására utal (2. ábra).

A T segítő sejtek felszabályozzák az IRE1a-XBP1 útvonalat in vivo fertőzés során. Nematódával (Nippostrongylus brasiliensis) fertőzött egérből származó lépsejteket (7 nappal a fertőzés után) PE-konjugált anti-XBP1s antitesttel festettük és áramlási citometriával elemeztük (gating stratégia: singlet > élő sejtek > CD4+CD3e+ > XBP1s+). Egy reprezentatív FACS-profil látható (bal oldali panel), az összes eredményt (n = 4) tartalmazó grafikon pedig a “jobb oldali panel”

Az eredmények megerősítik, hogy az útvonal in vivo aktív. Ezért nekiláttunk az útvonal feltárásának genom-szintű megközelítésekkel Th2 limfocitákban.

A differenciális génexpresszió genom-szintű transzkriptomikai elemzése IRE1a-XBP1-szabályozott géneket tár fel

Az IRE1a-XBP1 útvonal globális génszabályozó szerepének megragadásához in vitro aktivált Th2 sejteket hasonlítottunk össze olyan sejtekkel, amelyeknél az IRE1a endonukleáz aktivitását 4μ8c sejttenyészetbe történő adagolásával gátoltuk. Ezután összehasonlítottuk az aktivált Th2 limfociták transzkriptomját az IRE1a-XBP1 útvonal gátlásával vagy anélkül. A 4μ8c-vel kezelt és kezeletlen Th2 sejtek transzkriptomját mRNS-szekvenálással (RNS-seq) nyertük. Az RNS-szekvenálási adatok minőségellenőrzése az 1. kiegészítő fájlban látható: S3 ábra. A naiv és aktivált Th2-limfociták transzkriptomjait összehasonlítva azt találtuk, hogy 10995 gén differenciálisan szabályozott a Th2-aktiváció során. Az IRE1a-XBP1 útvonal 4μ8c kezeléssel történő gátlása 3144 gén differenciális expresszióját eredményezte a kezeletlen Th2 kontrollhoz képest (3a. ábra, Additional file 1: S3 ábra jobb oldali panel). E gének közül kétezer-hatszázhetven részt vett a Th2-differenciálódásban (3a. ábra). A gének hierarchikus klaszterezése megmutatja a 4μ8c-kezelés hatására fel- és leszabályozott géncsoportokat (Additional file 1: S3 ábra, jobb oldali panel). Ezeknek a géneknek a részletes vizsgálata során kiderült, hogy sok közülük a kibontakozatlan fehérje válaszhoz és az ER-stresszhez kapcsolódik, ami az IRE1a-XBP1 útvonal jelentős hatását jelzi ezekre a biológiai folyamatokra (3b. ábra). A differenciálisan expresszálódó gének teljes listája a 2. kiegészítő fájlban található: S1 táblázat. A Th2-sejtek 4μ8c-kezelését követően differenciálisan expresszálódó gének (azaz az IRE1a-XBP1 útvonal által szabályozott gének) génontológiai (GO) elemzése azt mutatta, hogy a következő biológiai folyamatokban gazdagodtak: “Válasz az ER stresszre” (GO:0006950), “A jelátvitel szabályozása” (GO:0009966), “Citokintermelés” (GO:0001816), “sejtproliferáció” (GO:0008283), “sejtciklus” (GO:0007049) és immunválasz (GO:0006955) (3c. ábra). A génexpressziós mintázatok ezen változásai az IRE1a gátlására az XBP1 transzkripciós faktor kiterjedt részvételére utalnak a Th2 aktivációban és proliferációban, valamint a differenciálódásban. Ezért az XBP1 transzkripciós faktor genom-szintű kromatinfoglaltsági mintázatainak feltárását tűztük ki célul.

Differens génexpresszió a Th2-ben az IRE1a-XBP1 4μ8c általi gátlása következtében. A naiv T helper sejteket Th2 differenciálódási körülmények között aktiválták 4μ8c jelenlétében vagy hiányában. A sejteket anti-CD3e és anti-CD28 antitesttel bevont lemezeken aktiváltuk 3 napig, majd 2 napig pihentettük, és 6 órán át bevonatos lemezeken reaktiváltuk őket. Az RNSseq adatokat a differenciális génexpresszió szempontjából elemeztük. a Venn-diagram a különböző kísérleti körülmények között differenciálisan expresszálódó gének számát mutatja. A “Naïve → Th2” jelzi a naïve T-segítők és a Th2 sejtek között differenciálisan expresszálódó géneket. “Th2 → Th2+4μ8c” jelzi a kezeletlen és a 4μ8c-vel kezelt Th2 között differenciálisan expresszált géneket. b Hőtérkép mutatja a differenciálisan expresszált géneket, amelyek közismerten részt vesznek a kibontakozatlan fehérje válasz által okozott ER stressz feloldásában. A hőtérkép a sor Z-pontszámaként jelzett skálázott expressziós értékeket mutatja, piros-kék színskálán, ahol a piros a megnövekedett expressziót, a kék pedig a csökkent expressziót jelzi. c A Th2 és a 4μ8c-kezelt Th2

XBP1 ChIPmentation feltárja az XBP1 közvetlen célgénjeit a Th2 sejtekben

Az XBP1 genomszintű kromatinfoglaltságának azonosítása, ChIP-mentációt végeztünk, egy nemrégiben kifejlesztett módszert, amely gyorsabbnak, érzékenyebbnek és robusztusabbnak bizonyult, mint a hagyományos ChIP-seq megközelítések , az XBP1 elleni ChIP minőségű antitestet használva. Az XBP1 ChIP-hez in vitro differenciált és reaktivált Th2 sejteket használtunk. Két független biológiai ismétlést végeztünk. Mindkét replikátum esetében 19,3 millió, illetve 22,4 millió párvégű olvasatot kaptunk. A MACS2 alkalmazásával, 0,01-nél kisebb q-értékkel és 5-nél többszörös feldúsulással 9031, illetve 7662 csúcsot azonosítottunk a két replikátumban. A bedtools segítségével végzett átfedési elemzés szerint 5892 csúcs volt jelen mindkét replikátumban. Ezért a downstream elemzés során csak erre az 5892 csúcsra összpontosítottunk.

Amint várható volt, kötődési csúcsokat azonosítottunk az XBP1 ismert célgénjeinek promóter régiói körül, mint például a Hspa5, amely az ER-chaperon fehérjét, a BiP-t, más néven Grp78-t kódolja; kötődési eseményt figyeltünk meg magának az XBP1-nek a promótere körül is (4a. ábra), ami az XBP1 lehetséges autoregulációjára utal. Az XBP1 kötőhelyekkel kapcsolatos genomikai jellemzők kiderítése érdekében a HOMER segítségével összehasonlítottuk a csúcsok elhelyezkedését a RefSeq génekkel. Az XBP1 kötődési csúcsok többsége a promóter (amelyet az annotált transzkripciós starthelyekhez képest 1000 bp felfelé és 500 bp lefelé definiáltak) (36%) és intronikus (35%) régiókban helyezkedett el, és gyakran megfigyeltünk disztális intergenikus kötődési eseményt (25%) is (4b. ábra). Az XBP1 csúcsok genomiális eloszlása azt jelzi, hogy promóterekhez és potenciális enhancerekhez egyaránt kötődik.

Az XBP1 transzkripciós faktor genomszintű kromatinfoglaltsága Th2 limfocitában. XBP1 ChIPmentációt végeztünk in vitro differenciált Th2 sejtekben, hogy genom-szintű XBP1 kromatinfoglaltságot kapjunk. a Pillanatkép a jelzett reprezentatív gének körüli XBP1 kötődési csúcsokról a UCSC genom böngészőjéből. b Az XBP1 kötődési csúcsok genomiális eloszlása. A promóterhez tartozó szektor a TSS-től felfelé 1 kb-ig és lefelé 100 bp-ig terjedő szekvenciákat foglalja magában. c Az XBP1 motívumok összehasonlítása a JASPAR adatbázisból (fent), a humán emlőrákos sejtvonalak (középen) és az egér Th2 limfociták (lent) ChIP-seq-je alapján. d Az XPB1 és NF-Y motívumfrekvenciái az XBP1 kötődési csúcsai körül. e GREAT

Az XBP1 kötőcsúcsokon belül feldúsult biológiai folyamatok GO-terminusai GREAT

Az XBP1 regulom további jellemzése érdekében de novo motívumfelfedezést végeztünk a HOMER segítségével, hogy azonosítsuk az XBP1 kötési régiókon belül feldúsult DNS-motívumokat. Az azonosított top motívum a GCCACGT konszenzus szekvencia, amely majdnem azonos az emlőrákos sejtvonalakban meghatározott humán XBP1 kötő motívummal (4c. ábra) . Ez azt jelzi, hogy az XBP1 kötési specifitása nagymértékben konzerválódott az ember és az egér között, valamint a különböző sejttípusok között. Az egéradatainkban feldúsult top motívum szintén hasonlít a JASPAR adatbázisból származó XBP1 motívumra , ami ismét alátámasztja a ChIPmentációs adataink magas minőségét. A második leggazdagabb motívum az NF-Y kötő motívum (Additional file 1: Figure S4C). Érdekes módon az NF-Y motívumot gyakran találták sejtciklus gének, különösen a G2/M sejtciklus szabályozásában részt vevő gének promóter régiói körül. Mind az XBP1-motívum, mind az NF-Y-motívum együtt fordul elő a 258 XBP1-kötési csúcsok egy részhalmaza körül (4d. ábra), ami az XBP1 és az NF-Y transzkripciós faktorok közötti lehetséges együttműködésre utal a célgének egy részhalmazának szabályozásában. Az XBP1 és az NF-Y által potenciálisan együttesen szabályozott célgének listáját a 3. kiegészítő fájl: S2. táblázat tartalmazza, az XBP1 célgének teljes listáját pedig a 3. kiegészítő fájl: S2. táblázat tartalmazza. Az öt legjobban feldúsult motívum az 1. kiegészítő fájlban látható: S4C ábra. Az XBP1-hez kötött gének funkcióinak vizsgálatához GREAT segítségével jellemeztük az XBP1-hez kötődő csúcsokat. A legtöbb szignifikáns GO-terminus a fehérje-összehajtással és az ER-stresszel kapcsolatos (4e. ábra), ami összhangban van az XBP1 ismert biológiai szerepével.

A ChIPmentációs kísérletek összességében az XBP1 fehérje-összehajtás és szekréció fokozásában, valamint a Th2 limfociták aktiválásában betöltött szerepét jelzik előre.

Transzkriptomikai adatok és ChIP-seq adatok integrálása az XBP1 által szabályozott génszabályozó hálózat feltárásához

Az XBP1 által szabályozott közvetlen célgének és a transzkripciós szabályozó hálózat feltárásához integráltuk a genom-szintű transzkriptomikai adatokat és a ChIPmentation adatokat. A közvetlen célgént az IRE1a gátlása (azaz a 4μ8c kezelés) és az XBP1 transzkripciós faktor elfoglaltsága a génlokuszon történő eltérő expressziója határozza meg. A Th2-ben 1143 közvetlen célgént találtunk, amelyek közül 122 célgént korábban más sejttípusokban (pl. izom, hasnyálmirigy β-sejt és plazmasejt) XBP1 közvetlen célgénként jelentettek (5a. ábra). Ebben az összefüggésben 1021 gén tekinthető Th2-specifikusnak. Az XBP1 közvetlen célpontjai feletti hatásnak nincs meghatározott iránya, tartalmaz fel- és leszabályozott géneket. Az 5b. ábrán látható az e két minta valamelyikét követő 38 legfontosabb gén, a teljes lista pedig a 4. kiegészítő fájlban található: S3. táblázat. A legjelentősebb azonosított biológiai folyamatok és útvonalak a fehérjék hajtogatásához és az ER-stresszhez kapcsolódnak (Additional file 1: S5 ábra), amelyek összhangban vannak az ismert biológiai szerepeivel, és új Th2-specifikus célpontokat is tartalmaznak.

A ChIPmentációs és RNS-seq adatok integrációja feltárja az XBP1 közvetlen célgénjeit és szabályozó hálózatát. a Venn-diagram, amely összehasonlítja más szekréciós sejttípusok korábban jelentett XBP1 célgénjeit a jelen vizsgálat Th2 közvetlen célgénjeivel. Az e tanulmányban szereplő XBP1 közvetlen célgének azok, amelyek közösek mind az “XBP1 által elfoglalt gének a Th2-ben”, mind a “Differenciálisan expresszált gének (Th2 → Th2+4μ8c)” kategóriákban. A B-sejtek/plazmasejtek, vázizomsejtek és hasnyálmirigy β-sejtek XBP1 közvetlen célgénjei az Acosta-Alvear és munkatársai által megfigyeltek voltak, és itt az összehasonlításhoz használtuk őket. b Az XBP1 közvetlen célgének expressziójának mintázatát bemutató hőtérkép. A 38 legfontosabb gént, amelyek határozott mintázatot követnek, ábrázoltuk. c Transzkripciós szabályozó hálózat: az XBP1 közvetlen célpontjait jelentő transzkripciós faktorok. A hálózatban szereplő gének differenciálisan expresszálódnak (felfelé szabályozott-piros; lefelé szabályozott-kék) a 4μ8c kezelés hatására. A nem differenciálisan expresszálódó, de XBP1 ChIPseq-csúccsal rendelkező transzkripciós faktorok a jobb oldali listában

Az XBP1 szerepének túlsúlya ellenére az XBP1 szerepe ennek az útvonalnak a szabályozásában más transzkripciós faktorok is szerepet játszanak. Az XBP1 szabályozást követő szabályozási kaszkád vizsgálatához transzkripciós szabályozó hálózatot építettünk fel a promóter vagy exonikus/intronikus ChIP-seq csúcsokkal annotált transzkripciós faktorok kivonásával (5c. ábra). A transzkripciós faktorok teljes listája az 5. kiegészítő fájlban található: S4 táblázat. Ezt a hálózatot tovább egészítettük ki a STRING adatbázisban a célzott transzkripciós faktorokkal annotált kölcsönhatásokkal rendelkező differenciálisan expresszált gének hozzáadásával (Additional file 6: Table S5).

Az XBP1 által közvetlenül szabályozott transzkripciós faktorok három széles funkcionális kategóriába sorolhatók, amelyek a következőkben vesznek részt: a fehérje szekréciós ER stressz feloldása, a sejtciklus és a proliferáció szabályozása, valamint az effektor immunsejtek működésének szabályozása. Az ER-stresszben érintett transzkripciós faktorok valószínűleg elősegítik a Th2 limfociták citokinszekrécióját. Ez az előrejelzés a szekréciós sejtekről, például a hasnyálmirigy acináris sejtjeiről és a plazmasejtekről szóló korábbi jelentéseken alapul. Ezek a transzkripciós faktorok, nevezetesen a Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4 és Creb3l2, bizonyítottan részt vesznek az ER szekréciós stressz adaptációjában .

A sejtproliferációval és a sejtciklussal kapcsolatos transzkripciós faktorok célja az lehet, hogy elősegítsék az aktivált Th2 sejtek ellenőrzött gyors terjeszkedését. Az immunválaszhoz kapcsolódó faktorok valószínűleg részt vesznek a Th2 differenciálódásban és a citokintermelésben. Ezért szerettük volna megvizsgálni az XBP1s downregulációjának hatását a citokinszekrécióra, a sejtproliferációra és a citokintermelésre.

Az IRE1a-XBP1 útvonal szabályozza a citokinszekréciót a T-helper sejtekben

Az XBP1s-szabályozott gének genomszintű összehasonlítása azt jelzi előre, hogy a faktor részt vesz a citokinek szekréciójában. Ennek a predikciónak a validálása érdekében blokkoltuk az IRE1a endonukleáz aktivitását Th2 sejtekben, és elemeztük a sejtkultúra felülúszót, hogy ELISA-val számszerűsítsük az IL4 szintjét. Az IL4-et választottuk tesztelhető citokinjelöltnek, mivel mRNS-e és fehérjéje nem változik az XBP1 downregulációja hatására (Additional file 1: ábra S6A bal oldali panel, 6. ábra bal oldali és a felső sor középső panel). Azt találtuk, hogy az IL4 szekréciója jelentősen gátolt a 4μ8c-vel kezelt sejtekben (6. ábra, felső sor jobb oldali panel). A várakozásoknak megfelelően ez az eredmény alátámasztja az IRE1a-XBP1 útvonal részvételét a Th2 sejtek citokinszekréciójának megkönnyítésében, ahogy azt előre jeleztük. Az útvonal gátlása a restimulációs fázisban nincs jelentős gátló hatással az IL4-szekrécióra (Additional file 1: S6B ábra). Ez az eredmény arra utal, hogy az XBP1s szükséges a Th2 differenciáció során, valószínűleg a hatékony szekréciós gépezet kialakulásához.

AzIRE1a-XBP1 útvonal szükséges a citokin expressziójához és szekréciójához a Th2 limfocitákban. Naiv T helper sejteket Th2 aktivációs állapotot követően 3 napig IRE1a inhibitor 4μ8c jelenlétében tenyésztettük, 2 napig pihentettük, bevonatos lemezzel reaktiváltuk, és áramlási citometriával elemeztük az IL4, IL5 és IL13 sejten belüli citokinek expressziójának kimutatására. Az első két oszlopban reprezentatív FACS-profilok láthatók. Az intracelluláris citokinek expresszióját a 3. oszlopban hasonlítjuk össze, három-hét független biológiai ismétléssel. Negyedik oszlop: a 4μ8c-vel kezelt vagy DMSO-val kezelt Th2 sejtkultúra felülúszóit ELISA-val elemeztük a citokinkoncentráció mérésére. FACS kapuzás: limfociták > egyes sejtek > élő sejtek > citokinek

Az IRE1a-XBP1 útvonal szabályozza az IL13 és IL5 citokinek expresszióját

Az IL5 és az IL13 két kiemelkedő 2-es típusú citokin, amelyek részt vesznek az eozinofíliában, az allergiában és a helmintusfertőzésben. Azt találtuk, hogy az IRE1a-XBP1 útvonal gátlása jelentősen elnyomja az IL5 és IL13 fehérje expresszióját és szekrécióját a táptalajba (6. ábra középső és alsó sor jobb oldali panelek). A Th2 transzkriptom bioinformatikai elemzése azt jelzi előre, hogy az IRE1a-XBP1 útvonal pozitívan szabályozza az IL5 és IL13 gének expresszióját, mivel mindkét gént differenciálisan expresszált génekként azonosítottuk az IRE1a gátlására (Additional file 2: S1 táblázat). Ezt az előrejelzést RT-qPCR-közvetítésű génexpressziós elemzéssel (Additional file 1: S6A ábra, középső és jobb oldali panel) és áramlási citometriával (6. ábra) validáltuk. Ezek az eredmények az IL5-öt és az IL13-at szabályozó útvonal transzkripciós részvételére utalnak. Figyelemre méltó, hogy az IL4 mRNS- és fehérjeszintjét nem befolyásolták, ami az IL5 és IL13 specifikus szabályozására utal.

AIRE1a-XBP1 útvonal elősegíti az aktivációfüggő T helper sejtek proliferációját

A sejtek proliferációs sebessége a pozitív és negatív szabályozók kölcsönhatásának eredője. Megfigyeltük, hogy a sejtproliferáció pozitív és negatív szabályozó génjeit kódoló gének differenciáltan expresszálódtak, amikor az IRE1a-XBP1 útvonalat 4μ8c-vel blokkoltuk (7a. ábra, bal oldali panel, 7. kiegészítő fájl: S6. táblázat), amelyek közül számos gént az XBP1 közvetlen célpontjának találtunk (7a. ábra, jobb oldali panel, 8. kiegészítő fájl: S7. táblázat). Ez a megfigyelés a proliferációs ráta változását vetíti előre az IRE1a gátlásakor. Ezért érdekelt bennünket az IRE1a-XBP1 gátlás sejtproliferációra gyakorolt hatásának ellenőrzése. Sejtproliferációs vizsgálatot végeztünk Th2 sejtekkel. Naiv lépi CD4+ T-sejteket CellTrace violettel jelöltünk és Th2 differenciálódási körülmények között aktiváltuk 4μ8c jelenlétében vagy hiányában. A fluoreszcens festék bomlását áramlási citometriával követtük nyomon. Azt találtuk, hogy az XBP1s downregulációja jelentősen gátolja a sejtproliferációt (7b. ábra), de nem indukál sejthalált (Additional file 1: Figure S7).

AIRE1a-XBP1 útvonal elősegíti az aktivációfüggő Th2-sejt proliferációt és a sejtciklust. a Bal oldali panel: a sejtproliferációhoz kapcsolódó, differenciálisan expresszált gének hierarchikus klaszterezése a 4μ8c-vel kezelt és kezeletlen Th2 transzkriptomban. Jobb oldali panel: az XBP1 közvetlen célgének hierarchikus klaszterezése, amelyekről ismert, hogy részt vesznek a sejtproliferációban. A hőtérkép a sor Z-pontszámaként jelzett skálázott expressziós értékeket mutatja, piros-kék színskálán, ahol a piros a fokozott expressziót, a kék pedig a csökkent expressziót jelzi. b A lépi naiv T-helper sejteket CellTrace Violet festékkel festettük és 72 órán át Th2 differenciálódási körülmények között aktiváltuk, majd áramlási citometriával elemeztük. A Th2 sejtek generációi “piros”, a 4μ8c-vel kezelt sejtek pedig “kék” színnel jelennek meg a sejtproliferáció hisztogramján (bal oldali panel, egy reprezentatív kísérlet). Öt független biológiai ismétlésből kapott osztódási index grafikus ábrázolása (jobb oldali panel)

A T-segítő sejtek proliferációja összefügg a differenciálódással és a citokintermeléssel. A csökkent IL5 és IL13 expresszió (6. ábra) potenciálisan azzal magyarázható, hogy a sejtproliferáció késleltetett. Ha azonban a csökkent proliferáció lenne az elsődleges oka a szekréció hiányának, akkor az IL4-termelés is gátolt lenne. Mégis, nem figyeltünk meg jelentős változást az IL4-expresszióban az IRE1a gátlására (6. ábra, Additional file 1: S6A ábra). Ennek az ellentmondásnak a további vizsgálatához sejtproliferációs vizsgálatokat végeztünk IL13-GFP és IL4-GFP riporter egérvonalakkal. Az IL4-GFP-t expresszáló Th2 sejtekben az IL4-termelés gátlását figyeltük meg a sejtosztódás első néhány generációjában egészen 72 óráig 4μ8c kezelés hatására (Additional file 1: S8 ábra). Azonban 96 óra elteltével az IL4-expresszióban mutatkozó különbség jelentéktelenné válik, függetlenül attól, hogy a sejtek a sejtosztódás melyik generációjában vannak. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a proliferáció IRE1a-gátlás miatti lassulása nem elegendő az IL4-expresszió gátlásához. Ezzel szemben az IL13-GFP esetében már az első generációtól kezdve megfigyeltük az IL13 expressziójának csökkenését, és ez a későbbi generációkban is folytatódik (Additional file 1: S9 ábra).

AzIRE1a gátlása késlelteti a sejtciklus progresszióját az S és G2/M fázison keresztül

A differenciálisan expresszált gének (Th2 vs. 4μ8c kezelt Th2) és az XBP1 közvetlen célgének bioinformatikai elemzése számos olyan gént mutat, amelyek részt vesznek a sejtciklus progressziójának szabályozásában a különböző szakaszokon keresztül (pl, G1, S, G2/M) két csoportba klasztereződtek felfelé vagy lefelé szabályozott (8a. ábra). Vettük a 4μ8c-vel kezelt Th2-ben differenciálisan expresszált géneket a kezeletlen Th2-hez képest (korrigált p-érték < 0,05) (8a. ábra, balra, kiegészítő fájl 9: S8 táblázat) és a differenciálisan expresszált XBP1 közvetlen célgének génjeit (8a. ábra, jobbra, kiegészítő fájl 10: S9 táblázat), és ellenőriztük az ismert szerepeket a különböző sejtciklus szakaszokban, vagy az RNS-seq adatokon alapuló, kézzel kurált lista vagy közzétett adatbázis segítségével . Úgy találtuk, hogy számos gén minden sejtciklus-stádiumból (azaz G1, S és G2/M) érintett. Az IRE1a-XBP1 útvonal által szabályozott sejtciklus-stádiumok azonosításához létrehoztunk és használtunk egy transzgenikus FUCCI (fluoreszcens ubikvitin sejtciklus-indikátor) egértörzset, amely mCherry-jelölt Cdt1 és mVenus-jelölt Geminin fehérjét expresszál. A törzs hasonló a . A G1 sejtek mCherry+ mVenus- (Q3; 8b. ábra), a G1-S sejtek mCherry+ mVenus+ (Q2; 8b. ábra) és az SG2M sejtek mCherry- mVenus+ (Q1; 8b. ábra), míg a mitózisban lévő és G1-be lépő sejtek mCherry- mVenus- (Q4; 8b. ábra). Összehasonlítottuk a járművel és 4μ8c-vel kezelt Th2 sejtek sejtciklus-profilját a T-sejtek aktivációja során. Azt találtuk, hogy az IRE1a-XBP1 útvonal blokkolásakor a sejtek felhalmozódtak az S és/vagy G2/M fázisban (8b. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk egy másik megközelítésben is, amikor BrdU beépülési vizsgálatot végeztünk DAPI festéssel (Additional file 1: Figure S10).

AzIRE1a gátlása késlelteti a sejtciklus progresszióját az S és G2/M fázison keresztül. a Bal oldali panel: a 4μ8c-vel kezelt és kezeletlen Th2 transzkriptomban a sejtciklus stádiumához kapcsolódóan differenciálisan expresszálódó gének hőtérképe. Jobb oldali panel: az XBP1 közvetlen célgének hőtérképe, amelyekről ismert, hogy részt vesznek a sejtciklusban. A hőtérkép a sor Z-pontszámaként jelzett skálázott expressziós értékeket mutatja, piros-kék színskálán, ahol a piros a fokozott expressziót, a kék pedig a csökkent expressziót jelzi. b Th2 limfociták sejtciklus-analízise 72 órás aktiválást követően, mCherry-taggal jelölt CDT1-et és Venus-taggal jelölt GEMININ-t expresszáló FUCCI egérvonal felhasználásával. Balra fent: a sejtciklus szakaszainak diagramszerű ábrázolása a használt FUCCI egérben. Jobbra fent: a sejtciklus különböző szakaszaiból származó sejtek összehasonlítása (az összes sejt százalékában) a Th2 és a 4μ8c-vel kezelt Th2 (n = 6) esetében. Alsó panelek: Th2 és 4μ8c-kezelt Th2 egy-egy reprezentatív FACS-profilja, amely CDT1 és GEMININ expresszáló sejteket mutat

Az XBP1s transzgenikus expressziója kiegészíti az IRE1a endonukleáz aktivitás 4μ8c által közvetített gátlását

Tesztelni, hogy a megfigyelt 4μ8c-kezelt fenotípusok az XBP1s elvesztésének tudhatók be, komplementációs vizsgálatokat végeztünk XBP1s expressziós vektor transzdukciójával a Th2 sejtekbe in vitro. A vektor az XBP1 splicelt formáját (XBP1s) kódolta, amelynek funkciója független az IRE1a funkciójától. Azt találtuk, hogy az XBP1s stabil ektopikus expressziója negligálja a 4μ8c kezelés hatását, és nincs jelentős változás a transzkriptomban 4μ8c kezelés hatására, amikor a Th2 sejtek túlexpresszálják az XBP1s-t (Additional file 1: Figure S11A). Az XBP1s-t overexpresszáló Th2 sejtek 4μ8c jelenlétében normálisan proliferálnak és differenciálódnak (Additional file 1: S11B és S11C ábra). Ezek az eredmények határozottan arra utalnak, hogy a 4μ8c kezelés hatására megfigyelt fenotípusok az XBP1s elvesztésének köszönhetőek.