Egy humán gyomorrák xenograft modell létrehozása immunkompetens egerekben a Microcarrier-6
Abstract
A gyomorrák az emésztőrendszer leggyakoribb rosszindulatú daganatai közé tartozik. Egy robusztus és megbízható állatmodell létrehozása az alapja a rák patogenezisének tanulmányozásának. Jelen tanulmányban a gyomorrák egérmodelljét hoztuk létre immunkompetens egerek MKN45 sejtekkel történő beoltásával mikrohordozó segítségével. Hatvan hím C57BL/6 egeret véletlenszerűen három csoportra osztottunk: 2D csoportra, üres hordozó csoportra és 3D csoportra, az MKN45 és a mikrohordozó kokultúrás rendszere szerint. Az egérmodelleket hipodermikus injekcióval hoztuk létre. A tumor kialakulásáig eltelt időt, a tumorképződés arányát és a patológiai jellemzőket minden csoportban megfigyeltük. A 3D csoportban a daganatképződés ideje rövid volt, míg a daganatképződés aránya magas (75%). Sem a 2D, sem az üres hordozós csoportban nem volt kimutatható tumorképződés. Mind a H&E, mind a tumor xenograft immunhisztokémiai festése a humán gyomor daganatok jellegzetes jeleit mutatta. A jelen tanulmány sikeresen létrehozott egy humán gyomorkarcinóma modellt immunkompetens egerekben, amely új és értékes állatmodellt biztosít a rákkutatáshoz és a rákellenes gyógyszerek fejlesztéséhez.
1. Bevezetés
Évente körülbelül egymillió újonnan diagnosztizált esettel a gyomorrák komoly veszélyt jelent az emberek egészségére és életére világszerte . A gyomorrák patogenezisét és áttétképződési mechanizmusait azonban még nem sikerült teljesen tisztázni. A gyomorrák in vivo modelljei alapvető eszközök e rák biológiai jellemzőinek és a lehetséges új kezelési lehetőségek feltárásához . Emberi eredetű gyomorrák xenograft modelleket hoztak létre immunhiányos egerekben, például nude egerekben és súlyos kombinált immunhiányos egerekben. Az immunhiányos egerek azonban nehezen tenyészthetők és költségesek. Fontos, hogy az immunhiányos egerek nem tükrözik az immunrendszer fontos szerepét a tumor kialakulásában és progressziójában. Ezért nagy jelentőséggel bír egy új humán gyomorrák xenograft modell létrehozása normális immunrendszerrel rendelkező egerekben. A jelen tanulmányban MKN45, humán gyomorrák sejteket és a mikrohordozót kokultúráztattuk, majd immunkompetens egereket oltottunk be a szuszpenzióval, sikeresen létrehozva egy új, humán eredetű gyomorrák xenograftot.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Anyagok és módszerek
2.1. A szuszpenzió és az immunkompetens egerek szuszpenziója. Anyagok
Roswell Park Memorial Institute- (RPMI-) 1640 táptalajt, tripszint, magzati szarvasmarha szérumot és penicillint a Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) cégtől vásároltunk. A nyúl anti-humán szénhidrát antigén 199 (CA199), citokeratin 7 (CK-7) és caudal típusú homeobox 2 (CDX-2) monoklonális antitesteket az Abcam-tól (Cambridge, Egyesült Királyság) vásároltuk. A mikrokarrier-6-ot az Elyon Biotechnologies LLC-től (Gaithersburg, MD, USA) szereztük be.
2.2. A mikrokarrier-6-ot az Elyon Biotechnologies LLC-től (Gaithersburg, MD, USA) vásároltuk. Kísérleti állatok
Hatvan 6-8 hetes, 22-25 g súlyú hím C57BL/6 egeret vásároltunk a Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. cégtől. (engedélyszám: SCXK 20140007, Shandong tartomány, Kína), és a Jining Medical College (Shandong tartomány, Kína) kapcsolt kórházának specifikus kórokozómentes állatközpontjában tartották őket. Minden állatkísérletet a Jining Orvosi Egyetem Társult Kórházának Intézeti Állatgondozási és Állatfelhasználási Bizottságának jóváhagyásával és a jóváhagyott irányelvekkel összhangban végeztek.
2.3. Sejtvonalak
Az MKN45 humán gyomorrák sejtvonalat a Kínai Tudományos Akadémia sejtbankjából (Sanghaj, Kína) vásároltuk, és 10% magzati szarvasmarha szérumot és 100 U/mL penicillint tartalmazó RPMI-1640 tápfolyadékban tenyésztettük 37°C-on, 5% CO2 mellett. A táptalajt 24 óránként cseréltük, és a sejteket 0,25%-os tripszinnel történő emésztéssel szedtük le.
2.4. Háromdimenziós (3D) tumorsejtkultúra modell létrehozása
A mikrokarrier-6-ot 24 órán keresztül 75%-os etanolban áztattuk, háromszor mostuk 1x foszfát-pufferelt sóoldattal, majd 24 órán keresztül RPMI-1640 médiumban inkubáltuk. Ezt követően a mikrokarrier-6-ot 3 órás inkubációval módosítottuk stromasejt-eredetű faktor-1 alfa (SDF-1α) és vaszkuláris endotél növekedési faktorral (VEGF), mindkettő 100 ng/ml koncentrációban. A logaritmikus növekedési fázisban lévő sejteket trypan-kék festést követően megszámoltuk, és olyan koncentrációra állítottuk be, amikor az életképesség >95% volt. Az MKN45 sejtszuszpenziót összekevertük a módosított mikrohordozó-6-tal, és további 24 órán át 37°C-on, 5% CO2 mellett inkubáltuk, hogy a sejtek telítődjenek a mikrohordozóval, amint azt mikroszkópiával megfigyeltük (1. ábra c) és 1. ábra d)).
(a)
(b)
(c)
.
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
2.5. Az állatok csoportosítása
A 60 C57BL/6 egeret véletlenszerűen három csoportra osztottuk (csoportonként 20 egér): a kétdimenziós (2D) csoport (a tartalmazó ), az üres hordozó csoport (a tartalmazó 30 μg mikrohordozó-6-tal beoltott állatok) és a 3D csoport (a tartalmazó és 30 μg mikrohordozó-6-tal beoltott állatok).
2.6. Az állatok beoltása a kétdimenziós (2D) csoportban történt. Állati modell létrehozása
A 3D tumorsejtkultúra-modellt a kísérlet első napján hoztuk létre, és 24 órán át inkubáltuk. A második napon a tenyésztett sejt-mikrohordozó komplexeket háromszor megmostuk és óvatosan összekevertük, hogy beállítsuk a koncentrációt a sejtekre és 300 μg mikrohordozó-6-ra 1 ml szuszpenzióban, majd jégre tettük későbbi felhasználásra. A logaritmikus növekedési fázisban lévő MKN45 sejteket betakarítottuk, tripszináltuk, háromszor mostuk , és újra szuszpendáltuk , koncentrációban , amelyet későbbi felhasználásra jégre tettünk. A módosított mikrokarrier-6-ot háromszor mostuk , 300 μg/ml koncentrációban reszuszpendáltuk, és későbbi felhasználásra jégre tettük. Mindhárom kísérleti csoportban minden egyes egeret 100 μL megfelelő oldattal oltottunk be a jobb hónaljgerinc alá.
2.7. Indikátor kimutatása és patológiai vizsgálat
A beoltást követően az egereket csoportonként elkülönítve helyeztük el, és naponta megfigyeltük az étvágyat, az aktivitást és a testsúlyt. Minden egérnél feljegyezték a helyi tumor kialakulásának idejét és a tumor térfogatát. Amint a tumorok láthatóvá váltak, naponta megmértük az egyes tumorok hosszú átmérőjét (a) és rövid átmérőjét (b), és a tumor térfogatát a tumor térfogat képlet szerint számoltuk ki : . A daganatot hordozó egereket három tételben áldozták fel: 10, 20 és 30 nappal a beoltás után. A tumorszöveteket minden egérből teljesen eltávolítottuk, és feljegyeztük a tumor minőségét, textúráját, valamint az infiltráció és nekrózis mértékét. A tumorszöveteket ezt követően 4%-os semleges pufferelt formaldehidben rögzítettük, majd hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük. Az immunhisztokémiához az EnVision kétlépéses festési technikát alkalmaztuk. A festési eredményeket a tumor pozitív granuláris citoplazmafestése alapján határoztuk meg. Negatív (-ve) festődést <5% pozitívan festett sejtként, pozitív (+ve) festődést pedig ≥5% pozitívan festett sejtként definiáltunk.
2,8. Statisztikai elemzés
A statisztikai elemzéshez az SPSS 13.0 szoftvert (IBM SPSS, Chicago, IL, USA) használtuk. A mérési adatokat átlagok ± az átlag standard hibája (SEM) formájában mutattuk be. Az egyes csoportok átlagértékei közötti különbségeket adott esetben egyirányú varianciaanalízis (ANOVA) vagy a Kruskal-Wallis teszt segítségével hasonlítottuk össze. statisztikailag szignifikáns különbségnek minősül.
3. Eredmények
3.1. Eredmények
3.1. Az egyes csoportok átlagértékei közötti különbségek összehasonlítása. Az in vitro MKN45 3D-s tumorkultúra-rendszer létrehozása a Microcarrier-6 használatával
A microcarrier-6 egy újszerű mikrohordozó, amely többrétegű porózus szerkezetű, pozitívan elektrifikálható szerves polimerekből áll. A mikrohordozó-6 pórusmérete, pozitív felületi töltéssűrűsége és mérete kémiai szintézissel beállítható. A kis térfogatú, nagy pórusmérettel és sokszoros térhajtással rendelkező C típusú mikrohordozó-6-ot elsősorban 3D-s sejtkultúrához és gyógyszerérzékenységi kísérletekhez használják (2(a) és 2(b) ábra). Az M típusú mikrohordozó-6, nagy térfogat, kis pórusméret és alacsony belső hajtogatási idő, elsősorban szövettechnológiai kutatásokhoz használják (2(c) és 2(d) ábra). Vizsgálatunkban a C típusú mikrohordozó-6-ot használtuk. A mikrohordozó-6 tiszta szerves vegyület, amely nem hajlamos a szennyeződésre, nem tartalmaz szennyeződéseket, alacsony az immunogenitása és az anyagcseréje, valamint rendkívül biokompatibilis, és stabil mikrokörnyezetet biztosít a sejtek növekedéséhez (2(a)-2(d) ábrák). Ezenkívül a mikrohordozó-6-ot közvetlenül az egerek bőrébe ágyazzák, vérerek benövését indukálva (2(e) és 2(f) ábra), ami elegendő vérellátást biztosíthat a tumorsejtek növekedéséhez. Az MKN45 sejtek gyorsan megtapadtak a 2D környezetben, és a 24 órás tenyésztést követően mikroszkópiával megfigyelt sejtmorfológia szabálytalan sokszög alakot mutatott (1. ábra (a)). A mikrokarrier-6 szabálytalan vagy hosszú orsó alakot és laza textúrát mutatott (1. ábra (b)). Az MKN45 és a módosított mikrohordozó-6 24 órás kokultúráját követően az MKN45 sejtek jól tapadtak a mikrohordozóhoz és elérték a konfluenciát. Ezenkívül a mikrohordozó-6-ra tapadt MKN45 sejtek körül szabálytalan sejtklaszterek voltak megfigyelhetők (1. ábra (c)). Az MKN45 sejt-mikrohordozó komplexeket 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) oldattal festettük meg, ami megmutatta, hogy nagyszámú MKN45 sejt tapadt a mikrohordozó-6 állványzathoz (1. ábra (d)). A mikrohordozók többrétegű porózus szerkezete megfigyelhető pásztázó elektronmikroszkóp alatt (1. ábra (e)). Az MKN45 sejtek megtapadtak a mikrotartókon, és a felszínre tapadt sejtek sejtklasztereket alkottak (1. ábra (f)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(f)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2. Egér túlélés és tumorképződés
A kísérlet során a csoportok között nem észleltünk jelentős változást az étvágyban, a szőrzetben vagy a testsúlyban (1. táblázat). A 3D csoport egereinél egy héttel a beoltás után enyhe aktivitáscsökkenés volt tapasztalható. Egyik csoportban sem pusztult el egyetlen állat sem, és a 30 napos kísérlet során sem az üres hordozó, sem a 2D csoportokban nem találtak daganatképződést. A 3D csoportban a 20 egér közül 15-nél tapintással 7-10 nappal az inokulációt követően bőr alatti daganatokat azonosítottak, ami 75%-os tumorképződési arányra utal (1. táblázat). A tumor xenograftok gyorsan növekedtek, és körülbelül 10 nappal az inokulációt követően szubkután tömegek formájában észlelték őket (3. ábra (a), 3. kiegészítő ábra). A tumor xenograftok az inokuláció után 2-3 héttel 0,5-1,0 cm3 -re nőttek. A tumor xenograft szövetek könnyen elkülönültek a szomszédos szövetektől, és viszonylag szabályos alakú, többnyire kerek vagy ovális, szürkésfehér vagy szürkésvörös színű, bőséges perifériás vérellátással rendelkező tumorszövetek voltak (3(b) és 3(c) ábra, 3. kiegészítő ábra). Az üres hordozós csoportban szövettani elváltozások mutatkoztak az injekció beadásának helyén, a 2D csoportban azonban nem (3(d) és 3(e) ábra). Az üres hordozócsoportban kis, sárga színű szubkután tömegek voltak megfigyelhetők (3. ábra (d)).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Az adatok a .
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3. H&E festés
A fénymikroszkópos vizsgálat alapján a hisztomorfológia a 3D csoportban lévő egerekből származó tumoros xenotranszplantátumokban nagyszámú rendezetlen és atipikus sejtet mutatott (4. a)-4. c) ábra). A beoltás után 10 nappal nagyszámú heterotípusos sejt, maradék mikrohordozók és bőséges vérerek voltak megfigyelhetők (4(a) ábra). A beoltás után 20 nappal kis számú maradék mikrohordozót (4. ábra (b)) és nagyszámú nekrotikus elváltozást (4. ábra (d)) figyeltünk meg. A mikrohordozók azonban 30 nappal a beoltás után lényegében eltűntek (4. ábra (c)). Az üres hordozócsoportban nagyszámú mikrohordozót és kisszámú gyulladásos sejtet figyeltünk meg, de tumorsejteket nem találtunk (4. ábra (e)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.4. Immunhisztokémia
Immunhisztokémiát végeztünk a tumor xenograftolását követően 20 nappal elaltatott állatokon. A tumor xenograft szövetek pozitív CA199, CK-7 és CDX-2 festődést mutattak (4(f)-4(h) ábrák), ami tovább erősítette, hogy az atípusos sejtek humán eredetű tumorsejtek voltak.
4. Megbeszélés
Az állatmodelleket széles körben használják a gyomorrák patogenezisének és metasztatikus mechanizmusainak tanulmányozására, és rendkívül fontos szerepet játszanak a terápiás gyógyszerek hatékonyságának és toxicitásának értékelésében . Jelenleg a gyomorrák állati modelljei főként a következők: az indukciós modell, a transzplantációs modell és a géntechnológiai modell . A három modelltípus közül a transzplantációs modell könnyen működtethető, ezért széles körben használják. A kísérleti állatok típusát, a tumor xenograftokat, valamint a transzplantáció helyét és útvonalát olyan tényezőknek tekintik, amelyek befolyásolják a xenograft modellek sikerét . A xenotranszplantációs modellekhez általában olyan egereket használnak, amelyek immunfunkciós hibákkal rendelkeznek, mint például a nude egerek és a súlyos kombinált immunhiányos egerek (SCID) . Az immunhiányos egerek viszonylag drága költsége, rövid élettartama és a daganatokra adott immunválasz hiánya miatt azonban a xenograft modellhez immunkompetens C57BL/6 egereket választottunk, hogy elkerüljük az immunhiányos egerek hiányosságait. Általánosan elfogadott nézet, hogy a gyomorrák előfordulása nincs összefüggésben az ösztrogén szintjével, és a gyomorrák előfordulása a férfiaknál magasabb, mint a nőknél. Ezért hím egereket használtunk modellként. Ezenkívül a jelen tanulmányban az MKN45 humán gyomorráksejteket használtuk az in vitro modell létrehozásához, elsősorban a sejtvonal erős invazív és metasztatikus jellemzői miatt . Ezenkívül a hónalj alatti szubkután régiót és az ektópiás transzplantációt választottuk a tumorsejt-transzplantáció helyének, illetve útvonalának, mivel e terület bőséges vérellátása és laza szövetszerkezete megkönnyíti a tumor növekedését az egerekben .
A 2D sejttenyésztési rendszer és az állatmodell közötti hídként a 3D sejttenyésztési rendszer jobban szimulálja a tumorsejtek növekedésének mikrokörnyezetét, és vonzó témává vált a jelenlegi kutatásban . A rákos sejtek 3D kultúrája tumororganoidokat képez, és a tumororganoidokon alapuló egér tumor xenograft modelleket elkezdték alkalmazni a rákellenes gyógyszerek szűrésére . A jelen tanulmány az új mikrokarrier-6 és MKN45 sejteket használta a kokultúrás kísérletekhez, hogy sikeresen létrehozzon egy 3D növekedési modellt. A mikrohordozó-6-ot közvetlenül az egerek bőr alatti szövetébe ágyaztuk be, hogy a vérerek bejuthassanak a mikrohordozókba, ami olyan különleges előnyt jelent, amely más mikrohordozókkal nem érhető el. Tanulmányok beszámoltak az immunkompetens egerek enyhe immunszuppressziójáról az emberi tumorsejtekkel szembeni rezisztencia elérése érdekében, sikeresen létrehozva egy tumorhordozó egérmodellt ; azonban a mai napig nincs jelentés emberi tumor sikeres ektopikus transzplantációjáról normális egerekben, nem immunszuppresszív körülmények között. Ezenkívül, amikor az MKN45 sejtek koncentrációját beállítottuk, és azonnal 100 μL MKN45 sejtszuszpenziót szubkután befecskendeztünk minden egyes egérbe, nem sikerült stabil tumorképződést elérni az ektopikusan transzplantált emberi tumorsejtek erős immunrendszeri tisztítása miatt. A jelen vizsgálatban használt mikrohordozó-6 alacsony immunogenitást és laza textúrát mutatott, amelynek közepén számos pórus volt, ami megkönnyítette a tumorsejtek növekedését. A mikrokarrier-6 gátként is működött, amely megakadályozta, hogy az immunsejtek közvetlenül elpusztítsák a tumorsejteket. A módosított mikrokarrier-6 lehetővé tette az erek könnyű növekedését a tumor belsejében, megfelelő feltételeket biztosítva a tumorsejtek gyors növekedéséhez.
A sejtes immunitás a fő hadsereg a tumor növekedése ellen; az érintett sejtek közé elsősorban a T-sejtek, természetes ölősejtek, makrofágok és dendritikus sejtek tartoznak . A mikrokarrier-6 szabálytalan “labirintus”-szerű szerkezete miatt rövid távú gátként működhet, és bizonyos mértékig blokkolhatja a tumorsejtek immunsejtek általi közvetlen elpusztítását. Ezenkívül három órával a kísérlet előtt a mikrokarrier-6-ot tovább módosították SDF-1α-val és VEGF-fel, hogy felgyorsítsák az érképződést és vérellátást biztosítsanak a gyors daganatnövekedéshez, ami felülmúlta az egerek daganatellenes immunhatását. Ezzel egyidejűleg azt találtuk, hogy az egerek perifériás vérében és lépszövetében a makrofágok száma jelentősen csökkent a transzplantált tumorképződés korai szakaszában, összehasonlítva a normál kontrollcsoporttal (1. kiegészítő ábra). A csontvelő makrofágok száma fokozatosan csökkent az üres hordozó csoport, a 2D csoport és a 3D csoport között, de nem volt statisztikai szignifikancia (2A., 2B. kiegészítő ábra). Az üres hordozócsoporthoz képest a 2D csoportban a lép T-limfociták száma csökkent, de nem volt statisztikai szignifikancia (2C. kiegészítő ábra). A 3D csoportban a lép T-limfociták száma szignifikánsan kevesebb volt, mint a 2D csoportban (2C. kiegészítő ábra). Ez arra utal, hogy a tumor növekedése gátolta az immunrendszert, lehetővé téve a tumor gyors növekedését.
A jelen tanulmányban egy MKN45 sejtes 3D növekedési modellt hoztunk létre, sikeresen létrehozva egy humán gyomorrák xenograft modellt immunkompetens egerekben a 3D csoportban, míg a 2D és az üres hordozó csoportban lévő egereknél nem alakult ki tumor. Ezt a xenograft modellt a tumorok gyors növekedése jellemezte, amelyek 7-10 nappal a beoltás után kézzel tapinthatók voltak, és 10-15 nappal a beoltás után érték el az optimális növekedést; a tumor térfogata körülbelül 20 nappal a beoltás után 0,5-1,0 cm3 volt. H&E festéssel nagyszámú atípusos sejtet mutattak ki, amelyek beszivárogtak az izom- és zsírszövetekbe. A maradék mikrokarrier-6-ot gyulladásos sejtek vették körül, és granulómákat képeztek, amelyek közepén nagy kiterjedésű nekrózisos terület volt, amit valószínűleg a gyors tumornövekedés miatti elégtelen vérellátás okozott. Ezek a jelenségek összhangban vannak az emberekben kialakuló daganatokkal. Ráadásul a bőséges kapillárisok főként a tumorok perifériáján helyezkedtek el. Jelenleg nincs specifikus tumormarker a gyomorrák számára; azonban a CA199, a CK-7 és a CDX-2 általában a gyomor-bélrendszeri daganatok markereiként használatosak. Ezért ezt a három markert választottuk a humán eredetű gyomorrákos sejtek jelölésére és azonosítására. A CA199, a CK-7 és a CDX-2 immunhisztokémiai festése pozitív volt, ami tovább erősítette, hogy a heteromorf sejtek emberi gyomorráksejtek voltak.
5. Következtetések
Sikeresen létrehoztunk egy humán gyomorrák xenograft modellt immunkompetens egerekben. Ez a modell képes tükrözni a szervezet immunrendszere és a daganatok közötti kölcsönhatást, és széleskörű alkalmazási kilátásokkal rendelkezik a tumorimmunitás jövőbeli kutatásában, valamint az új gyógyszerek kutatásában és fejlesztésében.
Adatok elérhetősége
A jelen tanulmány eredményeinek alátámasztására használt adatok kérésre elérhetők a megfelelő szerzőtől.
Érdekütközések
A szerzők kijelentik, hogy nincsenek érdekellentétek.
A szerzők hozzájárulása
Yanzhen Bi, Quanyi Wang és Yonghong Yang egyenlő mértékben járultak hozzá a munkához.
A köszönetnyilvánítás
Ezt a tanulmányt a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (81170395 és 81570556), a Jilin tartomány Természettudományi Alapítványa (20180101137JC és 20180101130JC), valamint a Jining Orvosi Egyetem Lin He új orvoslás és klinikai fordítás akadémikus munkaállomás kutatási alapja (JYHL2019FMS21) támogatta.
Kiegészítő anyagok
A gyulladásos sejtek változásai és egyéb tumorogén adatok. Kiegészítő 1. ábra: a gyulladásos sejtek változásai a tumort hordozó egerekben a transzplantált tumor kialakulásának korai szakaszában. Kiegészítő 2. ábra: a gyulladásos sejtek változásai a különböző csoportokban a transzplantált tumorképződés korai szakaszában. Kiegészítő ábra: tumort hordozó egerek és a transzplantált tumorszövetek. (Kiegészítő anyagok)