A Wnt3a mért hatása a HEK293T sejtek proliferációjára az alkalmazott teszttől függ
Abstract
A Wnt jelátviteli útvonal számos alapvető sejtfolyamathoz kapcsolódik. A tanulmány célja, hogy megvizsgálja a Wnt jelátvitel hatását a tenyésztett HEK293T sejtek proliferációjára. A sejteket Wnt3a-val inkubáltuk, és a Wnt-útvonal aktiválódását a β-katenin fehérje szintjének és a MYC és CCND1 célgének expressziós szintjének elemzésével követtük. A β-katenin fehérje szintje akár négyszeresére is megnőtt. Míg a c-Myc és a ciklin D1 mRNS-szintje enyhén emelkedett, a fehérjeszint akár 1,5-szeresére is megnőtt. Figyelemre méltó, hogy a Wnt3a stimulált HEK293T sejtek proliferációs rátájának mérésekor az MTT és BrdU próbák eltérő eredményeket mutattak. A BrdU-tesztekben a proliferációs ráta növekedését lehetett kimutatni, amely korrelált az alkalmazott Wnt3a-koncentrációval. Ezzel szemben az MTT-vizsgálatokban ez a korreláció nem volt kimutatható. A mitokondriális aktivitáson alapuló MTT-eredményeket a szukcinát-dehidrogenáz-komplex immunfluoreszcenciával és western blottinggal végzett elemzésével igazoltuk. Összességében tanulmányunk azt mutatja, hogy a Wnt3a aktiválja a HEK293 sejtek proliferációját. Ezek a hatások inkább a DNS-szintézis mérésével, mint a mitokondriális aktivitás változásainak mérésével mutathatók ki.
1. Bevezetés
A Wnt jelátviteli útvonalról ismert, hogy kulcsszerepet játszik a sejtek differenciálódásának, proliferációjának, túlélésének és apoptózisának szabályozásában . A Wnt fehérjék a szekretált lipid-modifikált cisztein-gazdag glikoproteinek egy erősen konzervált családja, amelyek a sejten belüli jelátviteli kaszkádokat aktiválják a Frizzled (Fz) család egyik tagjához kötődve a G-fehérje-kapcsolt receptorokhoz az extracelluláris mátrixon . A gerinces Wnts-nek 19 tagja van , amelyek két fő osztályba sorolhatók a citoszolikus β-katenin stabilizálására való képességük alapján: kanonikus és nem kanonikus útvonal . A legújabb munkák azt is kimutatták, hogy bizonyos Wnt-ligandok, mint például a Wnt5a, nem csak egy Wnt-jelátviteli útvonalat képesek aktiválni , így a szigorúan bináris osztályozás egyre inkább elavulttá válik. A Wnt jelátviteli útvonal hibás működése számos betegséggel, például csontritkulással , Crohn-kórral , Alzheimer-kórral , skizofréniával és különösen a rákos megbetegedésekkel áll összefüggésben .
A Wnt3a ligandum a β-katenin függő (kanonikus) Wnt jelátvitelhez tartozik, amely a frizzled transzmembrán receptorokhoz kötődik. Ezt követően az alacsony sűrűségű lipoprotein receptorral kapcsolatos fehérje 5 (LRP5) vagy LRP6 receptor komplex aktiválja a citoplazmatikus zilált fehérjéket, amelyek a glikogén-szintáz kináz 3β (GSK-3β) gátlását váltják ki. A β-katenin protoonkoprotein felhalmozódik a citoplazmában az adenomatosis polyposis coli (APC), az AXIN és a GSK-3β által alkotott destrukciós komplex szétesése következtében. Így a β-katenin transzlokálódhat a sejtmagba, ahol a T-sejt-specifikus transzkripciós faktor (TCF)/limfoid-erősítő faktor (LEF) által közvetített célgének transzkripcióját aktiválja. Ezek a gének felelősek az embrionális és felnőttkori fejlődés alapvető fiziológiai folyamatainak szabályozásáért, mint például a sejtproliferáció, differenciálódás, morfogenezis és sejtadhézió .
A proliferáció jelzésére a kanonikus Wnt-szignalizáció és a sejtciklus között komplex kölcsönhatás van. A Wnt/β-katenin jelátviteli útvonal jelentős szerepet játszik a G1-fázis progressziójának serkentésében a GSK-3β gátlásával, amely szabályozza a sejtciklus effektorokat és növekedési szabályozókat .
A Wnt/β-katenin jelátviteli útvonal egyik közvetlen célgénje a protoonkogén MYC, amelyet Wnt célpontként azonosítottak a vastagbélrákos sejtekben . A c-Myc transzkripciós szabályozó számos sejtfunkciót szabályoz, különösen a sejtciklus progressziójának szabályozását . A ciklin D1-et kódoló CCND1 gén szintén a Wnt/β-katenin útvonal célgénje, amelyet vastagbélrákos sejtekben írtak le . A ciklin D1 mint a ciklinfüggő kináz (cdk) 4 vagy cdk 6 aktivátora hajtja a G1/S fázis átmenetet .
A Wnt3a által indukált sejtproliferáció mérésének több módja van. Az egyik nem radioaktív módszer az 5-brom-2′-deoxiuridin (BrdU) DNS-be történő beépülésén alapuló immunvizsgálat a DNS-szintézis meghatározására, amely korrelál az S-fázisú átmenettel és így a sejtproliferációval . Egy másik módszer az életképes sejtek mitokondriális aktivitásának mérését használja. Az MTT-teszt során az MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium-bromid) redukciója során a mitokondriális dehidrogenázok által egy oldhatatlan kék formazán termék keletkezik .
A jelen tanulmányban a HEK293T sejtek proliferációját vizsgáltuk Wnt3a ligandumok hatására az MTT, valamint a BrdU-teszt segítségével. Továbbá összehasonlítottuk ezen próbák eredményeit a Wnt3a kezelt sejtek mitokondriális aktivitásával, amelyet az elektrontranszportlánc fehérje SDHA (szukcinát-dehidrogenáz komplex alegység A) immunfestésével mértünk.
2. Anyagok és módszerek
2.1. A Wnt3a kezelt sejtek mitokondriális aktivitása. Sejtek és sejtkultúra
A humán embrionális vesesejteket, HEK293T-t, 10% magzati szarvasmarha szérummal (PAN Biotech, Aidenbach, Németország), 1% nem esszenciális aminosavval és 1% penicillinnel/streptomicinnel (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) kiegészített Dulbecco’s modified Eagle’s mediumban (DMEM) tenyésztettük 37°C-on, 5% CO2 mellett.
2.2. A sejtek és a sejtek tenyésztése
A humán embrionális vesesejtek (HEK293T) tenyésztése Dulbecco’s modified Eagle’s mediumban (DMEM) történt. Proliferációs vizsgálatok
MTT és BrdU vizsgálatokat végeztünk 96 lyukú lemezeken. Üregenként tízezer sejtet vetettünk be, és a sejteket Wnt3a (R&D Systems, Minneapolis, USA) növekvő dózisával stimuláltuk, nevezetesen 0, 10, 50, 50, 100, 150 és 200 ng/ml, 24, 48 és 72 órán keresztül. 5 mg/ml MTT-t (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) oldottunk PBS-ben, és 20 μL MTT-oldatot adtunk minden egyes üregbe, majd három órás inkubációt végeztünk 37°C-on, 5% CO2 mellett. Az MTT-t tartalmazó közeget ezután kihúztuk, és 200 μL DMSO-t adtunk hozzá. A kristályok feloldásához a sejteket 15 percig ráztattuk szobahőmérsékleten. A lemezeket ELISA olvasóval (Tecan Group Ltd., Männedorf, Svájc) olvastuk le 590 nm-en. A BrdU vizsgálathoz a “Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric” (Roche, Mannheim, Németország) kereskedelmi kitet használtuk a gyártó utasításainak megfelelően. A BrdU-jelölő oldat hozzáadása után a sejteket három órán át inkubáltuk 37°C-on, 5% CO2 -ban. Az utolsó mosási lépés után 100 μL/lyuk szubsztrátoldatot adtunk a sejtekhez, és a reakciót 15 perc szobahőmérsékleten történő inkubálás után kénsavval állítottuk le. A lemezeket azonnal leolvastuk ELISA-olvasóval 450 nm-en. Minden vizsgálatot három példányban végeztünk (). A kalibráláshoz a sejteket különböző számban (0,1 × 104 és 3 × 104 között) vetettük be.
2.3. Immuncitokémia és fluoreszcens mikroszkópia
HEK293T sejteket 24 lyukú lemezekbe vetettük, és 30 %-os konfluencia mellett 0-200 ng/mL Wnt3a-val kezeltük, majd 24, 48 és 72 óra elteltével 4%-os formaldehidben fixáltuk. 1 : 200 hígításban SDHA ellenanyagot (Abcam, Cambridge, UK) adtunk hozzá, és a sejteket egy órán át inkubáltuk. A sejtmagokat 5 percig DAPI-val ellenfestettük. A sejteket fluoreszcens mikroszkópiával (Observer. Z1 a Zeiss-től, Jena, Németország) és a hozzá tartozó AxioVision 4.7.
2.4 szoftverrel elemeztük. Fehérje gélelektroforézis és Western Blot
A Bradford-Assay segítségével határoztuk meg a fehérjekoncentrációkat az egész sejtek lizátumaiban. Az egyenlő fehérjemennyiségeket SDS-poliakrilamid gélekre (NuPAGE, 4-12%, Life Technologies, Carlsbad, USA) töltöttük. A géleket 150 V-on futtattuk 1 órán keresztül, majd az iBlot System (Life Technologies) segítségével nitrocellulóz membránra vittük át. A membránokat SDHA, β-katenin, c-Myc, Cyclin D1 és β-aktin elleni primer antitestekkel (Cell Signaling, Cambridge, UK) elemeztük, 1 : 1000 arányban hígítva TBS-Tweenben 3%-os tejjel, majd megfelelő torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesttel inkubáltuk (hígítás 1 : 2000). A fehérje sávokat ECL detektálással tettük láthatóvá.
2.5. RNS-izolálás és RT-PCR
A teljes RNS-t NucleoSpin RNS II (Macherey-Nagel, Düren, Németország) segítségével izoláltuk, majd 1 μg RNS-t Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Németország) segítségével 40 μL térfogatban reverz-átírtunk. A félkvantitatív reverz transzkriptáz PCR-hez használt primerek (MWG, München, Németország) szekvenciái a következők: GAPDH 5′-catggtgctgaggagatttgccaac-3′ (előre) és 5′-tcaacacaccttgaccttctcatcac-3′ (hátra), a MYC esetében 5′-ccgagcaaggacgcgcgactctctc-3′ (előre) és 5′-gcctttttcagagaagcgggtcct-3′ (hátra), valamint a CCND1 esetében 5′-gcctgaacctgaggaggagagcccca-3′ (előre) és 5′-gtcacacacttgatcactctctgg-3′ (hátra). A PCR-amplifikációt a My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Németország) segítségével végeztük a gyártó protokollja szerint. A reakciót 2 perces 94°C-on történő előzetes denaturálással, majd 30 ciklusos denaturálással 94°C-on 1 percig, 55°C-on (CCND1), 57°C-on (GAPDH) vagy 60°C-on (MYC) 30 másodpercig tartó lágyítással és 72°C-on 1 percig tartó hosszabbítással végeztük. Az utolsó hosszabbítási lépés 10 percig tartott 72°C-on. A PCR-termékeket 1,5%-os agarózgélen végzett elektroforézissel elemeztük.
2.6. Adatelemzés
Az adatok kezeléséhez, beleértve a standard eltérések kiszámítását is, a Microsoft Excel szoftvert használtuk. a western blotokat és az agaróz géleket a Quantum ST4 géldokumentációs rendszerrel (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Németország) szkenneltük. A sávokat az ImageJ szoftver (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, USA) segítségével számszerűsítettük.
3. Eredmények
3.1. Eredmények
3. A Wnt3a hatása a β-katenin és a tipikus Wnt-célgének indukciójára
A Wnt-útvonal aktiválódásának bizonyítására kimutattuk a β-katenin fehérje koncentrációjának mennyiségét a HEK293T sejtekben Wnt3a kezelés után (1. ábra). A 24 órás kezelést követően a β-katenin fehérje koncentrációja a Wnt3a növekvő koncentrációjával emelkedett. A legmagasabb β-katenin fehérje koncentrációt 24 órán belül 200 ng/ml Wnt3a koncentráció mellett azonosítottuk. Itt a mennyiségi meghatározás négyszeres növekedést mutatott a kontrollhoz képest. A kezelést követő 48 és 72 órás időpontokban a β-katenin indukció hatása már nem volt egyértelműen felismerhető. Továbbá elemeztük a Wnt célgének, a CCND1 és a MYC szabályozását a Wnt3a kezelés után mind félkvantitatív RT-PCR, mind western blot segítségével (2. és 3. ábra). A c-Myc és a ciklin D1 bazális szintjét mutattuk ki a kezeletlen sejtekben. Az RT-PCR eredményei marginális változásokat mutattak a MYC cDNS mennyiségében és a CCND1 indukcióját 24 és 48 óra után 10 ng/ml Wnt3a, valamint 72 óra után 100-200 ng/ml Wnt3a koncentrációval. A c-Myc fehérjeszintjének enyhe emelkedését figyeltük meg 50 ng/ml koncentrációval 24 óra elteltével. A ciklin D1 western blot kvantitatív meghatározása 1,5-szeres növekedést mutatott 50 és 200 ng/ml közötti Wnt3a-koncentráció mellett 24 óra elteltével. A c-Myc fehérjeszintje ugyanígy emelkedett 50 ng/ml Wnt3a koncentrációval 24 óra elteltével.
3.2. A fehérjeszinteket a β-aktin szintjére normalizáltuk. Sejtproliferációs vizsgálatok
A Wnt-fehérjék sejtnövekedésre gyakorolt hatásának vizsgálatához a HEK293T sejteket 96 lyukú lemezekben 24 órán keresztül növesztettük, mielőtt 0, 10, 50, 100, 150 vagy 200 ng/ml koncentrációjú Wnt3a fehérjével kezeltük őket. A 24, 48 és 72 órás inkubáció után MTT és BrdU vizsgálatokat végeztünk. A BrdU-mérések egyértelmű tendenciát mutatnak; a Wnt3a koncentrációjának növekedésével a kapcsolódó leolvasási értékek növekedtek (4. ábra (a)), amelyben a Wnt3a 48 óra és 200 ng/ml koncentráció után jelzi a legnagyobb növekedési sebességet.
(a)
(b)
(a)
(b)
A BrdU-mérésekkel ellentétben az MTT-mérések nem mutattak korrelációt a Wnt-koncentrációk és a sejtek száma között. A sejtszámok mind körülbelül ugyanannyira maradtak vagy csökkentek a megfelelő kontrollokhoz képest (lásd a 4. ábra b) pontját).
3.3. Mitokondriális aktivitás
A Wnt3a mitokondriális aktivitással kapcsolatos szerepének további alátámasztására a HEK293T sejtekben az SDHA fehérje mennyiségét western blot, valamint immuncitokémiai elemzéssel határoztuk meg. A szukcinát-dehidrogenáz (SDH) SDHA alegységével a citromsavciklus egyik kulcskomponense, amely a mitokondriális elektrontranszportlánc II. komplexében vesz részt, és az elektronok szukcinátról ubikinonra történő átviteléért felelős. A sejteket a proliferációs elemzési kísérletekkel azonos módon kezeltük, és a fent leírtak szerint SDHA ellenanyaggal inkubáltuk. Az eredmények (5. ábra) 24 órás Wnt3a kezelést követően növekvő fluoreszcenciajelet és a kontrollhoz képest intenzívebb jelet mutattak a western bloton is. 48 óra elteltével az immunfluoreszcens mikroszkópiával vagy western blot analízissel regisztrált fehérjeszint nem mutatott jelentős változást. A 72 órás Wnt3a kezelés után még csökkenő jelet is megfigyeltünk mindkét kísérletben. A legmagasabb jelet 24 óra elteltével 50 ng/ml Wnt3a esetén mértük.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4. Megbeszélés
A Wnt fehérjék számos sejtfunkcióban vesznek részt, beleértve a sejtciklus és a proliferáció génexpressziójának szabályozását . A Wnt3a ismert a humán lencse epitélsejtek proliferációjának és migrációjának promótereként , a fibroblasztok proliferációjának vagy a hasnyálmirigy NIT-1 béta sejtek proliferációjának szabályozójaként is . A MYC és a CCND1 a Wnt jelátviteli útvonal célgénjei emlőssejtekben. Yoon és munkatársai például egy nagyszabású RNSi szűrés elvégzésével feltárták, hogy a Wnt jelátvitel aktiválja a mitokondriális biogenezist; olyan géneket azonosítottak, amelyek befolyásolják a mitokondriális funkciót, többek között a MYC-t .
Ebben a munkában a Wnt3a hatását határoztuk meg a HEK293T sejtek proliferációjára. Ehhez két fő próbát alkalmaztunk, amelyeket széles körben használnak a tenyésztett sejtek proliferációs sebességének elemzésére, nevezetesen az MTT és a BrdU próbát. Ennek során a Wnt-ligandok DNS-szintézisre és mitokondriális aktivitásra gyakorolt specifikus hatásait detektáltuk és közvetlenül összehasonlítottuk.
A rendszerünk létrehozásához és a Wnt3a Wnt-útvonalra gyakorolt hatásának bizonyításához HEK293T sejtekben 24 órás Wnt3a kezelést követően kimutattuk a β-katenin indukcióját, valamint elemeztük a MYC és a CCND1 expressziós szintjét. Mindkét célgén szintje szintén emelkedett 24 órás Wnt3a expozíció után. A C-Myc kulcsszerepet játszik a G1-fázis progressziójában; felszabályozza a ciklin D1-et és elnyomja a p21-et és a p27-et . A ciklin D1 viszont elősegíti a retinoblasztóma (Rb) komplex foszforilációját és gátlását, ami maga is felszabályozza a ciklin E szintjét . A ciklin E feldúsulása a G1/S fázis ellenőrzési pont átmenetéhez vezet .
A G1 fázis alatt a mitokondriumoknak nagy mennyiségű energiát kell szolgáltatniuk . Ezt az oxidatív fázist egy reduktív időszak követi a sejtciklus S-/G2-/M-fázisa alatt, amelyben a DNS replikációja és a mitokondriumok proliferációja zajlik .
A Wnt3a kezelt HEK293T proliferációs rátái eltérőek voltak, amikor az ebben a vizsgálatban használt két teszttel mérték. A különbséget e módszerek eltérő kimutatási mechanizmusaival magyarázzuk. Az MTT-teszt a mitokondriumok aktivitását méri; ezzel szemben a BrdU-teszt az újonnan szintetizált DNS relatív mennyiségét detektálja. Wagner és munkatársai a BrdU és az MTT közötti rendkívül szignifikáns kapcsolatra hivatkoznak a kutyai limfociták proliferációjával kapcsolatos eredményeikben, bár a BrdU-teszt érzékenyebbnek bizonyult, mint az MTT-teszt . A Wnt3a sejtszámra gyakorolt látszólag negatív hatása a mitokondriális aktivitás csökkenésével magyarázható. A BrdU-teszt azonban a DNS-szintézist elősegítő hatást mutatott ezekben a sejtekben. A mitokondriális aktivitásra vonatkozó kísérletek azt mutatták, hogy csak 24 órás Wnt3a kezelés után emelkedett az SDHA szintje. A rekombináns Wnt3a-val történő aktiválás 48 óra után vagy később valószínűleg nincs hatással a mitokondriális aktivitásra. Ennek az időben korlátozott hatásnak megfelelően az MTT-vizsgálat során 48 és 72 óra után csökkenő jel. Ezt erősíti meg a β-katenin Wnt3a hatására 24 óra után csökkenő felhalmozódása is. Más publikációk is alátámasztják ezt a feltételezést, miszerint a Wnt3a kezelt sejtek csak 24 óra alatt jeleznek megnövekedett β-katenin szintet . A Wnt3a közölt proliferáló hatásával ellentétes eredményeinket azzal magyarázzuk, hogy a legtöbb tanulmány Wnt3a-túlexpresszált sejteket, Wnt3a-kondicionált tápfolyadékot vagy rekombináns Wnt-fehérjével széruméheztetett sejteket használt a Wnt/β-aktin jelátviteli útvonal aktiválásához.
Összefoglalva, a BrdU és az MTT-mérések eredményei alig hasonlíthatók össze a Wnt3a HEK293T sejtek proliferációs sebességére gyakorolt hatásának mérésekor. A különbségek magyarázhatóak a különböző alkalmazási pontjaikkal, nevezetesen a mitokondriális aktivitással és a DNS-szintézissel. Ahhoz, hogy végleges bizonyítékot adjunk a sejtek proliferációs rátájáról, félrevezető lehet egyetlen módszer eredményeinek értelmezése. A sejtproliferáció értékeléséhez a sejtek optikai módszerekkel történő közvetlen megszámlálása tükrözné legjobban a valós helyzetet. Érdekes lenne összehasonlítani a megfelelő eredményeket az olyan biokémiai vizsgálatok eredményeivel, mint a BrdU és az MTT.
Érdekellentét
A szerzők kijelentik, hogy e cikk publikálásával kapcsolatban nem áll fenn érdekellentét.
Köszönet
Ezt a munkát a Szövetségi Oktatási és Kutatási Minisztérium (BMBF) anyagilag támogatta.
Köszönet
Ezt a munkát a BMBF anyagilag támogatta.