A teljes genom biszulfitos szekvenálás alapelvei

Epigenetikai vizsgálatok megerősítették, hogy a DNS-metilációs módosulása bizonyos génterületeken fontos szerepet játszik a kromoszóma konformációjában és a génexpresszió szabályozásában. A DNS citozin-maradékok C5-ös metilációja (5meC) számos eukariótában gyakori epigenetikai jelölés, és széles körben megtalálható a CpG vagy CpHpG (H=A, T, C). Elsősorban három megközelítés létezik, köztük az endonukleázos emésztés, az affinitás dúsítás és a biszulfit átalakítás (1. táblázat). Szinte minden szekvenciaspecifikus DNS-metilációs elemzési megközelítés metilációfüggő kezelést igényel az amplifikáció vagy a hibridizáció előtt a hűség fenntartása érdekében. Ezt követően különböző molekuláris biológiai technikákat, például újgenerációs szekvenálást (NGS) végeznek az 5meC-maradványok kimutatására.

1. táblázat. Az NGS-alapú metilációs elemzés fő elvei.

*MCA: MCA: metilált CpG-sziget-amplifikáció; *HELP: HpaII tiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR; *MSCC: methylation-sensitive cut counting; *MeDIP-seq: methylated DNA immunoprecipitation; *MIRA: methylated CpG island recovery assay; *RRRBS: reduced representation bisulfite sequencing; *WGBS: whole genome bisulfite sequencing; *BSPP: bisulfite padlock probes.

A bizulfitkonverzió forradalmat indított el a genom metilációs analízisében az 1990-es években. Mivel a biszulfit képes a genomban lévő nem metilált citozinokat uracillá alakítani, majd a PCR-amplifikáció során timinekkel helyettesíteni, amelyek a szekvenálás után a citozinok és timinek pozíciónkénti megszámlálásával megkülönböztethetők az eredetileg metilációval módosított citozintól (1. ábra). A teljes genom biszulfitos szekvenálás (WGBS), mint e területen nagy jelentőségű kutatási módszer, a biszulfitos kezelés és az új/harmadik generációs szekvenálási technológiák (többnyire shotgun szekvenálás) kombinációját alkalmazza a DNS-metiláció genomi szintű vizsgálatára.

1. ábra. Biszulfitkonverzió és PCR-amplifikáció a DNS-szekvenálás előtt.

A teljes genom biszulfit-szekvenálás előnyei

• A genomszintű metilációs profilalkotás lehetővé tétele egyetlen bázis szintjén.
• Szinte minden CpG-lókusz metilációs állapotának felmérése, beleértve az intergenikus “génsivatagokat”, a részleges metilációs tartományokat és a távoli szabályozó elemeket.
• Az abszolút DNS-metilációs szintek és a metilációs szekvencia-háttér feltárása.

A teljes genomi biszulfit-szekvenálás munkafolyamata

Röviden, a teljes genomi biszulfit-szekvenálás (WGBS) alapvető lépései közé tartozik a DNS extrakció, a biszulfitkonverzió, a könyvtár előkészítése, a szekvenálás és a bioinformatikai elemzés. Itt az Illumina HiSeq-et használjuk példaként a WGBS munkafolyamatának bemutatására.

2. ábra. A teljes genom biszulfitos szekvenálás munkafolyamata (Khanna et al. 2013).

• DNS kivonás

Először körülbelül 1-5 mg emberből, állatból, növényből vagy mikroorganizmusból gyűjtött szövetmintát készítünk elő DNS-hez. Általánosságban elmondható, hogy a teljes genom biszulfitos szekvenáláshoz használt mintáknak a következő négy jellemzőnek kell megfelelniük.

i. Eukarióták;

ii. Hipometiláció (ahogy a 3. ábrán látható, a vizsgálatok azt mutatják, hogy amint a CpG-helyek száma növekszik egy régióban, a WGBS szekvenálási adatai csökkenni kezdenek);

iii. A referencia genomját legalább a scaffold szintig összeállították;

iv. Viszonylag teljes a genom annotációja. Ezután pedig alkalmazzon megfelelő kitet a nagy tisztaságú és nagy molekulatömegű DNS kivonására. A kivont DNS tömege ne legyen kevesebb, mint 5 μg, koncentrációja ne legyen kevesebb, mint 50 ng/ul, és az OD260/280 értéke 1,8 és 2,0 között legyen.

3. ábra. A hagyományos WGBS technológiának alacsony a metilációs helyek lefedettsége (Raine et al. 2016)

• Biszulfitkonverzió

A DNS-metilációs analízis “arany standardjának” a bizulfitkonverziót tekintik, elveit a 4. ábra mutatja be. Ennél a módszernél a BS által indukált DNS-lebontás a nem metilezett citozinekben gazdag genomi régiók kiürüléséhez vezethet. Ezért fontos felmérni a DNS-degradáció mértékét a reakció körülményei között, és azt is figyelembe kell venni, hogy ez hogyan befolyásolja a kívánt amplikont. Olova és munkatársai (2018) megállapították, hogy a DNS-degradáció erős a nagy denaturációt vagy nagy biszulfit-molaritást alkalmazó biszulfit-konverziós protokollokban. A piacon többféle készlet is kapható (2. táblázat).

4. ábra. A citozin biszulfit-mediált deaminálása (Hayatsu et al. 2004).

2. táblázat. Biszulfitkonverziós protokollok és paraméterek.

• Library Preparation

Mutatjuk példaként az EpiGnomeTM Methyl-Seq Kit-et (Epicentre) (az 5. ábrán látható), a biszulfittal kezelt egyszálú DNS-t egy uracil-nukleotidok olvasására képes polimerázzal véletlenszerűen indítjuk, hogy egy specifikus szekvenciacímkét tartalmazó DNS-t szintetizáljunk. Az újonnan szintetizált DNS-szál 3′ végét ezután szelektíven megjelölik egy második specifikus szekvenciával, így egy kétjelölős DNS-molekulát kapunk, amelynek 5′ és 3′ végén egy ismert szekvenciacímke található. Az Illumina P7 és P5 adaptereket ezt követően PCR segítségével adják hozzá az 5 és 3 véghez a DNS-szekvenálás előtt.

5. ábra. Az EpiGnomeTM Methyl-Seq Kit munkafolyamata.

• Szekvenálás

A WGBS-hez széles körben alkalmazott új szekvenálási módszer, a Hiseq szekvenálási technológia, amely a szekvenálás a szintézisen (SBS) alapul. Az áramlási cellán történő híderősítés egyetlen molekula tömb használatával valósul meg. Mivel az új reverzibilis blokkolási technika egyszerre csak egy bázist képes szintetizálni és a fluorofort jelölni, a megfelelő lézert a fluorofór gerjesztésére használják, és a gerjesztő fényt a bázisinformáció leolvasásához lehet rögzíteni. A párosított végű 150 bp stratégiát jellemzően a WGBS-ben alkalmazzák a 250-300 bp-os inszerciós biszulfittal kezelt DNS-könyvtárak szekvenálásához. Az Illumina HiSeq mellett a PacBio SMRT, a Nanopore, a Roche 454 és más Illumina platformokat is gyakran használják erre a célra.

• Adatok elemzése

A szekvenálási eredményekhez egy sor elemzés végezhető. Az információelemzés öt fő típusát a 3. táblázat tartalmazza. Ezenkívül metilációs sűrűségelemzés, differenciálisan metilált régiók (DMR) elemzése, DMR annotáció és dúsítási elemzés (GO/KEGG) és klaszterelemzés is elvégezhető. A WGBS közös bioinformatikai erőforrásai közé tartoznak a BDPC, CpGcluster, CpGFinder, Epinexus, MethTools, mPod, QUMA és TCGA Data Portal.

3. táblázat. A WGBS-adatok elemzésének főbb típusai.

Kiemelt szolgáltatások:

Whole genome bisulfite sequencing

Targeted bisulfite sequencing

ChIP-seq

Reduced Representation Bisulfite Sequencing

1. Fraga, M. F, Esteller, M. (2002). Dna-metilálás: módszerek és alkalmazások profilja. Biotechniques, 33(3), 636-49.
2. Green, R. E., Krause, J., Briggs, A. W., Maricic, T., Stenzel, U., et al. (2010). A Neandertal genom szekvencia tervezete. Science, 328(5979), 710-722.
3. Hayatsu, H., Negishi, K., & Shiraishi, M. (2004). DNS-metilációs analízis: a citozin biszulfit-közvetítésű dezaminációjának felgyorsítása a genomi szekvenálási eljárásban. Proceedings of the Japan Academy,80(4), 189-194.
4. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., & Baylin, S. B. (1996). Metiláció-specifikus pcr: új pcr assay a cpg szigetek metilációs állapotának meghatározására. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(18), 9821-9826.
5. Ji, L., Sasaki, T., Sun, X., Ma, P., Lewis, Z. A., & Schmitz, R. J. (2014). A metilált dna felülreprezentált a teljes genom biszulfit szekvenálási adatokban. Front Genet, 5(5), 341.
6. Khanna, A., Czyz, A., & Syed, F. (2013). Epignome methyl-seq kit: egy új poszt-biszulfit konverzió utáni könyvtár előkészítő módszer metilációs elemzéshez. Nature Methods, 10(10).
7. Laird, P. W. (2003). A DNS-metilációs markerek ereje és ígérete. Nature Reviews Cancer, 3(4), 253-266. doi:10.1038/nrc1045
8. Laura-Jayne, G., Mark, Q. T., Lisa, O., Jonathan, P., Neil, H., & Anthony, H. (2015). A dna-metiláció genomszintű felmérése hexaploid búzában. Genome Biology, 16(1), 273.
9. Lin Liu, Ni Hu, Bo Wang, Minfeng Chen, Juan Wang, & Zhijian Tian, et al. (2011). Rövid használati jelentés az illumina hiseq 2000 szekvenálóról. Mycology, 2(3), 169-191.
10. Meissner, A., Gnirke, A., Bell, G. W., Ramsahoye, B., Lander, E. S., & Jaenisch, R. (2005). Csökkentett reprezentációjú biszulfit szekvenálás összehasonlító, nagy felbontású dna-metilációs elemzéshez. Nucleic Acids Research, 33(18), 5868-77.
11. Meyer, M., Kircher, M., Gansauge, M. T., Li, H., Racimo, F., & Mallick, S., et al. (2012). Nagy lefedettségű genomszekvencia egy archaikus denisovan egyedből. Science, 338(6104), 222-6.
12. Olova, N., Krueger, F., Andrews, S., Oxley, D., Berrens, R. V., & Branco, M. R., et al. (2018). A teljes genom biszulfitos szekvenálási könyvtárkészítési stratégiák összehasonlítása azonosítja a dna-metilációs adatokat befolyásoló torzítások forrásait. Genome Biology, 19(1), 33.
13. Raine, A., Manlig, E., Wahlberg, P., Syvänen, A. C., & Nordlund, J. (2016). Splinted ligation adapter tagging (splat), egy új könyvtárkészítési módszer teljes genom biszulfit szekvenáláshoz. Nucleic Acids Research, 45(6), e36.
14. Ziller, M. J., Müller, F., Liao, J., Zhang, Y., Gu, H., & Bock, C., et al. (2011). A nem-pg metiláció genomiális eloszlása és mintán belüli variációja az emberi sejttípusok között. Plos Genetics, 7(12), e1002389.