By Sara Ryding, B.Sc.Reviewed by Deepthi Sathyajith, M.Pharm.

A teljes genom biszulfitos szekvenálás vagy WGBS egy újgenerációs szekvenálási technika a DNS-metiláció elemzésére.

Image Credit: Egorov Artem /

A DNS-metiláció a génexpresszió szabályozásának epigenetikai mechanizmusa, amely egy metilcsoport hozzáadását jelenti egy citozin bázishoz. A rendellenes metilációs mintázatokat számos állapottal és betegséggel, például a rákkal hozták összefüggésbe. A WGBS kifejlesztése óta alkalmazzák többek között az epigenetikus átprogramozás és az epigenetikus szignatúrák tanulmányozására.

Az alapvető módszertan

A WGBS egyesíti a nátrium-biszulfát kezelés és a nagy áteresztőképességű DNS-szekvenálás alkalmazását. A nátrium-biszulfit megvédi a metilált citozinokat, vagyis a metilcitozinokat az átalakulástól, míg a nem metilált citozinok uracillá alakulnak át.

A metilálatlan citozinokat aztán PCR után tovább alakítják timinre, ami azt jelenti, hogy a szekvenálási eredmények túlnyomórészt adenin-, guanin- és timinbázisokat mutatnak, minden citozinbázis metilált citozinhelyeket jelez.

A módszert kezdetben a viszonylag kis genomja miatt az Aradopsis thaliana nevű növényen próbálták ki. Azóta bebizonyosodott, hogy a megkísérelt citozinok mintegy 90%-át képes elemezni. A WGBS technikát alkalmazták az ember, az egér, a kukorica és a szójabab genomján.

A törzssejtek alkalmazása

A törzssejtek olyan differenciálatlan sejtek, amelyek megőrzik azt a képességüket, hogy bármilyen sejttípussá, például idegsejtekké vagy izomsejtekké váljanak. Ez teszi őket rendkívül érdekessé a fejlődésbiológusok és az esetleges orvosi alkalmazások számára, hogy megértsük, miben különböznek az érett sejtektől.

A humán embrionális őssejtek és a magzati fibroblasztok metilált citozinjainak első genom-széles, egyetlen bázis felbontású térképei nagy különbségeket mutattak a kettő között. Az embrionális sejtekben az összes azonosított metiláció közel egynegyede nem citozin guanin (CG) kontextusban volt, míg a magzati sejtekben a metilcitozinok 99,98%-a GC kontextusban volt.

A nem-CG kontextus azt jelenti, hogy CHG vagy CHH kontextusban volt, ahol a H adenint, timint vagy citozint jelent. Ezt megelőzően túlnyomórészt úgy vélték, hogy az emlősök DNS-ének szinte minden metilációja CG-kontextusban történik, míg ez a vizsgálat azt jelezte, hogy ez általános jellemző lehet az emberi embrionális őssejtekben.

A nem-CG metiláció a differenciálódás során elveszni látszott. A nem-CG metiláció helyreállt, amikor a magzati sejteket indukált pluripotens őssejtekké manipulálták. Ez is bizonyítja, hogy a CHG és CHH metiláció nem genetikai különbségeknek köszönhető, hanem az embrionális őssejtek jellemzője.

A korábbi vizsgálat azt mutatta, hogy az őssejtek, akár indukált pluripotens őssejtek, akár embrionális őssejtek, a metiláción keresztül közös epigenetikai jellemzőket mutatnak. Az őssejtek óriási jelentőséggel bírnak terápiás célokra és a betegségek tanulmányozására. A szomatikus sejtektől nem genetikai, hanem epigenomikai átalakulások révén különböznek, így metilációs mintázatuk tanulmányozása rendkívül érdekes.

A következő vizsgálat az embrionális őssejtek és az indukált pluripotens őssejtek közötti különbségekre összpontosított, és megállapította, hogy bár metilációs mintázatuk globális szinten nagyon hasonló, az indukált pluripotens őssejtek jelentős eltéréseket mutatnak az átprogramozásban az embrionális őssejtekhez képest. Így, bár a WGBS sok mindent segített megvilágítani az őssejtekről, bizonyos kérdések még mindig fennállnak.

WGBS a fejlődésbiológiában

A DNS-metiláció fontos az emlősök normális fejlődése során. Különösen a nem-CG metiláció széles körben elterjedt a pluripotens őssejtekben és az oocitákban.

A kutatók a WGBS-t használták e koncepció további feltárására, és megállapították, hogy az egér csírahólyagocitákban a metiláció közel kétharmada nem-CG kontextusban történik. Azt is megállapították, hogy a nem-CG helyek metilációja felhalmozódott az oocita növekedése során.

A nem-CG metiláció úgy tűnt, hogy különösen néhány metiltranszferáztól függ, nevezetesen a DNS-metiltranszferázok komplexétől, azaz a Dnmt3s-Dnmt3L komplextől. Ezzel szemben úgy tűnt, hogy a Dnmt1 tartja fenn a CG-metilációt.

Az epigenetikus programozás öröklődése gyakoribb a növényekben, mint az emlősökben. Egy metilációra összpontosító vizsgálat megállapította, hogy a WGBS segítségével a növényi csíravonal megőrizte a CG és CHG metilációt. Ez ellentétben áll az emlősökkel, ahol a CHH-metiláció a mikrospórákban és a spermiumokban elvész. Ez azonban a megtermékenyítés után a kis RNS által irányított de novo DNS-metiltranszferáz által helyreáll.

WGBS a betegségek korai diagnosztizálására

A vizsgálatok kimutatták, hogy a WGBS felhasználható a rendellenes metiláció kimutatására a specifikus hipermetilált szupresszor gének szűrésével, ahogy az olyan rákos megbetegedésekben, mint az akut promilocitikus leukémia, gyomorrák stb. látható.

A WGBS alkalmazása a törvényszéki orvostudományban

A WGBS segítségével DNS-extrakciót követően szárított vérfoltmintákon végeztek törvényszéki vizsgálatokat. A WGBS használata jó minőségű mintákat biztosít, amelyek javítják a DNS-metiláció elemzését a törvényszéki vérfoltokon.

Összefoglalva, a WGBS egyre népszerűbbé válik a DNS-metiláció vizsgálatában, mivel ez a technika képes a biszulfittal konvertált genomi DNS DNS metilációjának becslésére egyetlen nukleotid felbontással.

Noha a WGBS nagyon hatékony eszköz az epigenetikai átprogramozás megértéséhez, ugyanilyen fontos egy olyan költséghatékony, nagy szekvenálási hatékonyságú technológia kifejlesztése és fenntartása, amely a tudományos kutatás változatos területein alkalmazható.

További olvasmányok

• Minden DNS szekvenálás tartalma
• DNS szekvenálás
• DNS szekvencia összeállítás
• DNS mikroarray
• Magas…throughput DNA Sequencing Techniques

Written by

Sara Ryding

Sara szenvedélyes élettudományi író, aki az állattanra és az ornitológiára specializálódott. Jelenleg az ausztráliai Deakin Egyetemen fejezi be doktori disszertációját, amelynek témája az, hogy a madarak csőre hogyan változik a globális felmelegedés hatására.

Hivatkozások