Abstract

2010 és 2014 között Lengyelország különböző területeiről 474 vadmadár, 378 ló és 42 ember meningitisben és lymphocytás meningitisben szenvedő ember szérummintáit gyűjtötték be. A nyugat-nílusi vírus (WNV) antitesteket kompetitív, enzimhez kötött immunszorbens tesztekkel mutatták ki: ELISA-1 ID Screen West Nile Competition, IDvet, ELISA-2 ID Screen West Nile IgM Capture és ELISA-3 Ingezim West Nile Compac. Az antitesteket 474 vadmadár szérummintából 63-ban (13,29%), 378 lószérummintából pedig egyben (0,26%) találták meg. A betegek 42 szérumából tizennégy (33,33%) volt pozitív a WNV antigénnel szemben, és egy szérum volt kétséges. A madarakból nyert pozitív mintákat a pozitív eredmények és a japán agyvelőgyulladás-komplex más antigénjeivel való keresztreakciók megerősítése érdekében vírus-mikroneutralizációs teszttel vizsgálták újra. Gyanítjuk, hogy az emberekben, madarakban és lovakban talált pozitív szerológiai eredmények arra utalnak, hogy a WNV valamilyen módon szoros kapcsolatban állhat a lengyelországi ökoszisztémával.

1. Bevezetés

A nyugat-nílusi vírus (WNV) a madárfajok, lovak és emberek széles körét érintheti. A vírus világszerte az említett állatok és az emberek megbetegedéséért felelős, újonnan megjelenő kórokozó. A WNV fő vektorai a vérszívó rovarok számos faja, amelyek a vírust madarakra, lovakra és emberekre is átadhatják.

A fertőzéseket az eddig csak az állatokra nézve patogénnek elismert tényezők által okozott nagyfokú pirexia, bénulás és morbiditás jellemzi. Gyakrabban a fertőzéseket enyhe klinikai tünetek jellemzik .

AWNV szerepel az Állategészségügyi Világszervezet (OIE) listáján, mint a bejelentési kötelezettség alá tartozó betegséget okozó neurotrop tényező. A vírus által okozott nyugat-nílusi láz (WNF) zoonózis, amely az USA-ban a legnagyobb közegészségügyi probléma .

A WNV a Flaviviridae családba, a Flavivirus nemzetségbe tartozó arbovírus, amely a japán encephalitis antigénkomplexbe tartozik, amelyet a rokon antigénnel rendelkező japán encephalitis vírus (JEV), a St. Louis encephalitis vírus (SLEV), a Murray Valley encephalitis vírus (MVEV) és az Usutu vírus (USUV) indukál. A vírus ssRNS+ genomja egyetlen, 11.000-12.000 nukleotidból álló nyitott olvasókeretet tartalmaz. A vírus genomja hét nem szerkezeti fehérjéből, az NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b és NS5 fehérjékből, valamint három szerkezeti fehérjéből: glikoprotein E, core protein C és premembrán protein prM .

A vírus fő rezervoárját a különböző fajokhoz tartozó trópusi és vándormadarak alkotják. A WNV 1-es vonalát az egész világon izolálták, de a 2-es vonalat csak Afrikában és Madagaszkáron izolálták, egészen a magyarországi WNV kitörésekig, amelyeket egy új 2-es vonal okozott, amelyet 2004-ben hoztak be Magyarországra, valószínűleg Afrikából származó vándormadarakkal . Ugyanez a 2-es vonal 2010 nyarán endémiás neuroinvazív betegséget (WNND) okozott emberekben Görögországban, 262 megerősített esettel és 35 halálesettel. 2011-ben a vírus átterjedt Görögország középső részére, de kevesebb, 101 diagnosztizált és 9 halálos áldozatot követelő esettel. A vírus által megfertőzött emberek száma Görögországban összesen 18000-re becsülhető .

A WNV több mint 300 különböző madárfajt fertőzött meg. A vírus általában zárt körben kering a vadon élő madarak és a szúnyogok között, és a madarak a különböző régiókba való átvonulásuk során hordozhatják .

A vírus a világ számos országában előfordul, és 20 európai országban is, köztük olyan országokban, amelyek Lengyelország közeli szomszédjai, ahol a vírus jelenlétét megerősítették . A WNV antitestek jelenlétét Lengyelországban vadon élő madarak és emberek szérummintáiban is megerősítették .

2010-ben Görögországból, Oroszországból, Romániából, Olaszországból és Izraelből jelentették a WNV fertőzés okozta emberi megbetegedést és halálozást . az Usutu vírus terjedését Lengyelországban is megerősítették . A japán encephalitis komplexet okozó egyéb vírusok lengyelországi keringéséről nem jelentek meg tanulmányok.

A vizsgálat célja a WNV antitestek kimutatása volt különböző vadon élő madarak, lovak és neurológiai tünetekkel rendelkező kórházi betegek szérummintáiban.

2. Anyagok és módszerek

Madarak. 474 vadon élő madár, 400 fehér gólya (Ciconia ciconia), 21 közönséges fácán (Phasianus colchicus), 19 közönséges cinege (Fringilla coelebs), kilenc vadkacsa (Anas platyrhynchos) szérummintái, négy fehérfarkú sas (Haliaeetus albicilla), két nyugati kerecsensólyom (Tetrao urogallus), hat postagalamb (Ectopistes migratorius), három északi gém (Accipiter gentilis), két csuklyás varjú (Corvus cornix), három északi héja (Accipiter gentilis), valamint egy fecske (Apus apus), egy feketerigó (Turdus merula), egy cinege (Sturnus vulgaris), egy holló (Corvus corax) és egy ölyv (Buteo buteo), amelyeket Lengyelország különböző helyszínein gyűjtöttek (Állatkert, Védett Állatok Rehabilitációs Központja). A legtöbb minta azonban az Albatros Alapítvány Vadmadár Rehabilitációs Központjából származik. A mintákat 2010-2014 március és október között gyűjtötték, amikor a szúnyogok aktivitása a legmagasabb volt (1. ábra).

1. ábra

Lengyelország térképe. Területek, ahol a mintákat gyűjtötték.

Lovak. Négy körzetben található néhány farmról 378 szérummintát nyertek egészséges háziasított lovaktól. A szérummintákat versenylovaktól is vették (1. ábra).

Ember. A Bialystoki Orvosi Egyetem Fertőző Betegségek és Neuroinfekciók Tanszékéről származó 42 beteg (17 férfi és 25 nő) szérummintái. A betegek meningitisre, lymphocytás meningitisre és kullancsencephalitisre jellemző neurológiai tüneteket mutattak. A betegek 2010 májusa és szeptembere között kerültek kórházba. Valamennyi beteget Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus antitestekkel vizsgálták kullancsencephalitis vírus ellen. A mintákat -20°C-on tartósítottuk.

Minden vizsgált mintát kétszeresen ellenőriztünk és 3+ biológiai biztonsági szintű körülmények között vizsgáltunk.

ELISA-1. A szerológiai vizsgálatot a kereskedelmi forgalomban kapható ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, Franciaország) versenyvizsgálattal végeztük a japán agyvelőgyulladás vírusával közös epitópot tartalmazó pr-E és pr-M burkolófehérjék elleni antitestek kimutatására a gyártó protokollja szerint. Minden mintát kétszer vizsgáltak meg. A mikrolemezeket 450 nm-en olvastuk le. Az ELISA-t akkor validálták, amikor kiszámították a maradék kötési arányokat (S/N%). A 40%-os vagy annál kisebb S/N arányú szérummintákat pozitívnak tekintettük; az 50%-nál nagyobb arányú mintákat negatívnak tekintettük. A 40% és 50% közötti S/N értékek kétségesnek számítottak.

Az ELISA-2-t az ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, Franciaország) segítségével végeztük. A lyukakat IgM poliklonális antitesttel vonták be. Pozitív eredmény esetén az antitestek jelenléte kék oldatként jelent meg, majd a stop oldat hozzáadása után sárgává vált. Antitestek hiányában nem jelent meg színeződés. A lemezeket 450 nm-en olvastuk le.

Az ELISA-3 vizsgálatot az Ingezim WNV Compac enzimatikus teszttel (Ingenasa, Spanyolország) végeztük, amely a blokkoló ELISA-n alapul, amelyben a WNV E fehérjére specifikus monoklonális antitestet (MAb) használtunk. Ha az antitestek jelen voltak a szérummintákban, akkor azok az antigénhez kötődtek. Ha az E fehérjére specifikus MAb-ot adtak hozzá, az az antigénhez kötődött, amelyet a szérummintából származó antitestek nem blokkoltak. Az antigént blokkoló antitestek esetén a konjugátum nem kötődött hozzá. A vizsgálatot a szubsztrát hozzáadása után kolorimetriás reakcióval olvastuk le. A mintákat akkor tekintettük pozitívnak, ha az OD-értékek megegyeztek a pozitív kontroll szérummintákéval vagy annál alacsonyabbak voltak. A mintákat akkor tekintették negatívnak, ha az OD-érték megegyezett vagy meghaladta a negatív határértéket. Azokat a mintákat, amelyek OD-értéke mindkét érték tartományában volt, kétesnek tekintették.

Vírus mikroneutralizációs teszt. A vírus mikroneutralizációs tesztet vadon élő madarakból származó ELISA-pozitív mintákkal az ANSES európai referencialaboratóriumban (Franciaország) végezték. A vizsgálatban Vero sejteket és az IS-98-ST1 törzsű nyugat-nílusi vírust használták. A vizsgálat az OIE szabványos eljárásán alapult.

3. Eredmények

Lengyelország járásait és azokat a területeket, ahol a mintákat gyűjtötték, az 1. ábra mutatja.

A legtöbb mintát a madarakból vették kiutalás és állatorvosi kezelés során. A madarak egy része a rehabilitációs központban volt néhány baleset után. A madarak nem mutattak neurológiai betegségekre utaló tüneteket és neurológiai fertőzésekre utaló jeleket. Minden madarat a mintákat küldő szervezet ellátott a helyére, nemére, életkorára, és ha lehetséges volt, az utazási előzményekre vonatkozó információkkal.

A szérumminták vizsgálatai 63 vadon élő madárból származó mintában mutattak ki specifikus WNV-antitesteket: 62 fehér gólyától és egy kerecsensólyomtól származó mintában. Egy pozitív szérummintát kancából nyertek.

A humán szérumminták tekintetében 42-ből 14 volt pozitív, egy pedig kétséges. Valamennyi beteg kórtörténetében szerepelt szúnyog- és kullancscsípés. Kullancs által okozott agyvelőgyulladást 16 betegnél diagnosztizáltak .

Az eredmények megerősítésére ELISA-2-t végeztek a szérum WNV IgM specifikus antitestek kimutatására, mint az immunitás első vonalbeli válaszát. Az eredmények negatívak voltak, így nem erősítették meg az IgM antitestek jelenlétét vagy az állatok friss fertőzésének bármilyen bizonyítékát.

Az ELISA-1 által kapott eredmények ellenőrzésére ELISA-3 vizsgálatot végeztek, és ezekben az esetekben megerősítették a specifikus WNV antitestek jelenlétét. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.

A pozitív eredmények megerősítésére a madarak pozitív szérummintáit vírus mikrononeutralizációs teszttel újravizsgáltuk. A vadon élő madarakból származó mind a 63 szérummintát megerősítették és pozitívnak minősítették a WNV-antitestek tekintetében, 60 mintában 10-es, három mintában pedig 30-as titerrel. A JECV más tagjainak vizsgálatát illetően a minták szintén negatívak voltak az Usutu vírusra. Keresztreakciós reakciókat nem észleltek.

A különböző diagnosztikai módszerekkel (ELISA és vírus mikroneutralizációs tesztek) kapott eredmények összehasonlítását az 1. táblázat tartalmazza.

4. Megbeszélés

Az elmúlt évek során megállapították, hogy a WNV a mérsékelt éghajlatú országokban terjed. a Culicidae családba tartozó szúnyogok a vírus terjedésének leggyakoribb vektorai, és napjainkban hat szúnyogfaj létezik a lengyel éghajlati övezetben . A múlt század kilencvenes éveiben Juřicová és munkatársai hemagglutinációs gátlási próbával igazolták a WNV antitesteket a házi verebek (Passer domesticus) 12,1%-ában és az eurázsiai fakölykök (Passer montanus) 2,8%-ában a lengyelországi Campinas erdőterületen. A következő néhány évben WNV-antitesteket találtak három gólyában, egy varjúban (Corvus corone cornix) és egy néma hattyúban (Cygnus olor) Lengyelország másik részén .

A kapott eredmények bemutatására, majd megerősítésére három különböző ELISA-t végeztünk. Az első ELISA az ID Screen West Nile Competition volt, a WNV-re specifikus teszt, de a JECV tagjai között is ad szerológiai keresztreakciókat. Amikor pozitív eredményeket kaptunk, ELISA-2 West Nile IgM Capture tesztet végeztünk, amely csak a WNV-re specifikus, és lehetővé teszi a keresztreakciók kizárását, de csak IgM-et mutat ki. Ez azt jelenti, hogy csak a friss fertőzést tudjuk azonosítani, és nem tudjuk kimutatni az IgG antitesteket. Az ELISA-3 tesztet az ELISA-1 módszerrel kapott eredmények megerősítésére használtuk, és az eredmények az esetek 100%-ában megerősítést nyertek.

Vizsgálatunkban a vadon élő madarak ELISA módszerrel nyert szérummintáival kapott pozitív eredményeket vírus mikrononeutralizációs teszttel erősítettük meg. Ezenkívül az ELISA-próbák WNV-antitesteket mutattak ki az agyhártyagyulladás, a limfocitikus agyhártyagyulladás és a kullancsencephalitis tüneteit mutató betegek 42 szérummintájából 14-ben, de a kapott eredményeket nem tudtuk plakkredukciós neutralizációs teszttel (PRNT) igazolni. Az emberekben előforduló WNV-fertőzést és a WNV azonosítását az agy-gerincvelői folyadékban általában RT-PCR, Nested PCR , vagy formalinban rögzített, paraffinba ágyazott emberi szövetekben RT-PCR segítségével igazolták. Czupryna és munkatársai tanulmánya szerint a Bialystoki Orvosi Egyetem Fertőző Betegségek és Neuroinfekciók Osztályán kórházba került 24 betegből származó összes agy-gerincvelői folyadékminta negatív volt WNV RNS-re.

Emberek, madarak és lovak szérummintáit használták megfelelő mintaként a specifikus WNV-antitestek meghatározására. Ha a szérummintákban igazoltuk a specifikus antitesteket, akkor az állat vagy az ember úgy tekintettük, hogy kapcsolatba került a vírussal (Lengyelországban vagy az országon kívül). Feltételezhető, hogy a pozitív vadon élő madarak az országon kívül is érintkezhettek a vírussal. Ami az emberektől származó pozitív mintákat illeti, 11 beteg soha nem hagyta el az országot; ez azt jelenti, hogy már Lengyelországban kapcsolatba kellett kerülniük a vírussal. Ugyanez a helyzet a lovak esetében is, amelyek utazási előzményeik alapján soha nem hagyták el az országot.

Az európai járványügyi helyzet alapján a vadmadarak szerepe a WNV terjedésében, valamint az emberek és madarak korábbi szerológiai vizsgálatainak eredményei arra utalnak, hogy a WNV jelenléte lehetséges Lengyelországban. Lengyelországban a Swietokrzyskie (28,85%) és Podlaskie (34,14%) régiókból származó lázas nőkben és egészséges erdei munkásokban mutattak ki WNV-antitesteket. Szerológiai eredményeink arra utalhatnak, hogy a vírus már jelen van éghajlati övezetünkben és ökoszisztémánkban. Figyelembe kell venni a kullancsencephalitis és az endémiás betegség vírusaival való keresztreakció lehetőségét.

Etikai jóváhagyás

A vizsgálatot a lublini II. helyi etikai bizottság hagyta jóvá (2010. november 16-i 92/2010. szám), és megkapta a Környezetvédelmi Főigazgatóság engedélyét (DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł).

Érdekütközés

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.

Köszönet

A szerzők szeretnék megköszönni a P/020, Szabadon élő vízimadarak mint rezervoár és vektor a vírusos betegségek terjedése során, valamint a W/211, Diagnosztikai módszerek fejlesztése és a nyugat-nílusi vírusfertőzés madarakban való előfordulásának kockázatértékelése Lengyelországban (2014-2018) című keretprojekt által nyújtott pénzügyi támogatást.