Global bla KPC-E. coli-stammar är olika, även inom den vanligaste ST-stammen, ST131, med bevis för lokal överföring

45 isolat erhölls från 21 städer i 11 länder på fyra kontinenter (2010-2013; tidigare laboratorietypningsresultat sammanfattas i tabell S1). Ett isolat var bla KPC-negativt vid sekvensering av hela arvsmassan (WGS; ecol_252), vilket kan ha förlorat bla KPC under lagring eller subkultur under den mellanliggande tidsperioden mellan när den ursprungliga typningen utfördes och det efterföljande DNA-extraheringen och förberedelserna för WGS. För ett isolat var WGS-data inkonsekventa med laboratorietypningsresultaten (ecol_451), vilket sannolikt var en laboratorieförväxling. ecol_252 och ecol_451 uteslöts därför från efterföljande analyser. De övriga 43 isolaten sekvenserades framgångsrikt (för kvalitetsmått se tabell S1). Bland dessa 43 isolat fanns 21 olika E. coli STs representerade (tabell 1; förutsagda in silico från WGS), bland annat: ST131 , ST410 , ST38 , ST10, ST69 (övriga isolat singleton STs).

Av 16 053 annoterade öppna läsramar (ORF) som identifierats i alla KPC-E. coli-isolat var endast 2 950 (18,4 %) gemensamma för alla isolat (”core”) och ytterligare 222 (1,4 %) i 95- < 100 % av isolaten (”soft core ”27). På nukleotidnivå fanns det 213 352 enskilda nukleotidvarianter (SNV) i kärngenomet, vilket stämmer överens med den tidigare observerade artdiversiteten28. Resistensgenprofilerna varierade också markant mellan stammarna, där vissa hade flera beta-laktam-, aminoglykosid-, tetracyklin- och fluorokinolonresistensmekanismer (t.ex. ecol_224) och andra innehöll endast bla KPC (t.ex. ecol_584; figur 1). För de 16 KPC-ST131-stammarna var 4 071/7 910 (51 %) ORF:er centrala, med 6 778 SNV:er i kärngenomet för dessa isolat, vilket återigen överensstämmer med tidigare globala studier av ST131-diversitet23, 24 (figur S1). Accessoriska genomer var mycket överensstämmande för vissa (t.ex. ecol_356/ecol_276/ecol_875), men inte alla (t.ex. ecol_AZ159/ecol_244) isolat som var nära besläktade i sina kärngenom, vilket stöder en mycket varierande evolutionär dynamik mellan kärn- och accessoriska genomer (fig. 1). Den geografiska spridningen av isolat som är nära besläktade i både kärn- och accessoriska genomer stöder lokal (t.ex. ecol_AZ166, ecol_AZ167 ) överföring av vissa KPC-E. coli-stammar. Homologin i de genetiska flankerande motiven runt bla KPC-generna i dessa närbesläktade isolatpar skulle också vara förenlig med denna hypotes och mindre förenlig med flera förvärvshändelser av bla KPC inom samma genetiska bakgrund, särskilt med tanke på den mångfald i bla KPC-flankerande sekvenser som observerats i resten av datasetet (se nedan).

Fylogeni av KPC-Escherichia coli som identifierats från globala övervakningssystem för karbapenemresistens, 2008-2013. Panelerna till höger om fylogenin representerar vanliga resistensgenmekanismer (fullständig information om typning av resistensgener i tabell S2), kärn- och accessoriska arvsmassakomponenter. För panelen för accessoriska arvsmassor representerar blått annoterade regioner som finns och vitt de som saknas.

Bla KPC-gener verkar för närvarande vara begränsade till plasmidkontexter i E. coli, men kan förekomma i flera kopior på enstaka plasmidstrukturer eller i plasmider med högt kopieringsantal.

Trettiofyra isolat (80 %) innehöll bla KPC-2, och nio isolat (20 %) bla KPC-3. Kromosomal integration av bla KPC har beskrivits i andra Enterobacteriaceae, Pseudomonas och Acinetobacter spp. men är fortfarande sällsynt5, 29, 30. Det fanns inga tecken på kromosomal integration av bla KPC vare sig i de 18 kromosomala strukturer som rekonstruerades från sekvensering med långa läsningar eller baserat på en granskning av annotationerna i de kontigs som innehöll bla KPC (som härrörde från Illumina de novo-sammansättningar) för de övriga 25 isolaten. Bla KPC-alleler var inte segregerade efter ST.

Oskattningar av antalet bla KPC-kopior per bakteriekromosom varierade mellan <1 (ecol_879, ecol_881) och 55 (ecol_AZ152). I nio fall var denna uppskattning ≥10 kopior av bla KPC per bakteriekromosom (ecol_276, ecol_356, ecol_867, ecol_869, ecol_870, ecol_875, ecol_AZ150, ecol_AZ152, ecol_AZ159, tabell S2). Sex av dessa isolat innehöll bla KPC i en col-liknande plasmidkontext, i två fall var plasmidreptypen okänd och i ett fall var det en IncN-replikon. Plasmidkopieringsantalet är förknippat med högre nivåer av antibiotikaresistens om den relevanta genen är belägen på en enhet med hög kopieringsgrad. Intressant nog antas plasmider med högt antal kopior ha större chans att fixeras i efterföljande celler, eftersom de fördelas mer adekvat av en slump och utan krav på separationssystem31 , och att de överförs i någon konjugationshändelse, antingen direkt eller indirekt32,33,34 .

Bla KPC- och icke-bla KPC-plasmidpopulationer i globala KPC-E. coli-stammar är extremt varierande

Plasmid Inc-typning avslöjade förekomsten av i median fyra plasmidreplikontyper per isolat (intervall: 1-6; IQR: 3-5), vilket representerar en stor mångfald (tabell 1). Replikonerna IncN, col, IncFIA och IncI1 var dock oproportionerligt överrepresenterade i vissa ST (p < 0,05; tabell 1). Bland de 18 isolat som genomgick PacBio-sekvensering identifierade vi 53 slutna, icke-bla KPC-plasmider, som varierade från 1 459 bp till 289 903 bp (tabell S1; minst fyra ytterligare, delvis fullständiga plasmidstrukturer fanns). Av dessa icke-bla KPC-plasmider hade 10 (storlek: 2 571-150 994 bp) <70 % likhet (definierat genom procentuell sekvensidentitet multiplicerat med andelen av frågelängden som visar homologi) med andra sekvenser som finns tillgängliga i GenBank, vilket understryker att en del av ”plasmidomet” i KPC-E. coli fortfarande är ofullständigt karakteriserat. För de övriga 43 plasmiderna var den bästa matchningen i GenBank en plasmid från E. coli i 35 fall, K. pneumoniae i 5 fall och Citrobacter freundii, Shigella sonnei, Salmonella enterica i 1 fall vardera (tabell S3).

Tjugotvå bla KPC-plasmidstrukturer var helt upplösta (17 från enbart Pacbio-data, fyra från enbart Illumina-data, 1 från både PacBio- och Illumina-data), från 14 029 bp till 287 067 bp (median = 55 590 bp; IQR: 23 499-82 765 bp). Dessa bla KPC-innehållande plasmider, och ytterligare sex fall där bla KPC identifierades på en replikoninnehållande contig, var mycket varierande baserat på Inc-typning (tabell S1). IncN var den vanligaste typen (n = 8/28 typningsbara bla KPC-strukturer; 29 %), följt av små, col-liknande plasmider (n = 6/28 ; 21 %). Andra mindre vanliga typer var: A/C2, FII(k), U (alla n = 2) och L/M, P, Q1 och R (alla n = 1). Fyra (14 %) bla KPC-plasmider var multireplikonkonstruktioner, nämligen: col/repA, FIB/FII, FIA/FII och FIA/FII/R.

Gemensamma IncN-plasmidbakgrunder har spridits globalt inom E. coli

Från GenBank valde vi ut alla unika, fullt sekvenserade IncN-bla KPC-plasmidsekvenser (tabell S4) för jämförelse, från så tidigt som 2005, runt tiden för de tidigaste rapporterna om KPC-producerande E. coli. Plasmidbakgrunderna och flankerande sekvenser som omger bla KPC i dessa 16 plasmidreferenser och en delmängd av 12 studiesekvenser (se ”Metoder”) överensstämde med flera förvärv av två kända IncN-Tn4401-bla KPC-komplex i divergerande E. coli ST: för det första inom en Plasmid-9 (FJ223607, 2005, USA)-liknande bakgrund, och för det andra inom ett Tn2/3-liknande element i en Plasmid-12 (FJ223605, 2005, USA)-liknande bakgrund.

I det första fallet identifierades genetiska likheter mellan plasmid-9, pKPC-FCF/3SP, pKPC-FCF13/05, pCF8698, pKP1433 (som representerar en hybrid IncN) och bla KPC-plasmider från isolaten ecol_516, ecol_517, ecol_656 och ecol_736 (denna studie). Plasmid-9 innehåller dubbla Tn4401b-element i omvänd orientering med fyra olika 5 bp flankerande sekvenser i ett atypiskt arrangemang inom ett grupp II-intron35. Ryggradstrukturen hos de andra plasmiderna i denna grupp stämmer överens med en separat förvärvshändelse av ett Tn4401b-element mellan pld- och traG-regionerna inom en förfäderversion av Plasmid-9-strukturen, med generering av en flankerande TTCAG-målplatsduplikation (TSD) (märkt som Plasmid-9-liknande plasmid (hypotetisk), fig. 2). Internationell spridning följt av lokal evolution både inom och mellan arter skulle förklara skillnaderna mellan plasmiderna, inklusive: (I) variation på nukleotidnivå (observerad i alla plasmider), ii) små insättnings- och borttagningshändelser (observerad i alla plasmider), iii) större insättnings- och borttagningshändelser som förmedlas av transposabla element (t.ex. pCF8698_KPC_2) och iv) troligen homolog rekombination, vilket resulterar i klustervariationer inom en liknande plasmidryggrad (t.ex. ecol_656/ecol_736), samt mer distinkta omläggningar, inklusive bildandet av ”hybridplasmider” (t.ex. pKP1433) (fig. 2).

Skematisk jämförelse av FJ223607-liknande (Plasmid 9-liknande) IncN-plasmider (offentligt tillgängliga; den här studien) och deras geografiska ursprung/datum för isolering. Plasmidsekvensnamn i rött är de från denna studie, härledda från PacBio-data och slutna (ecol_517, ecol_656) eller ofullständiga plasmidstrukturer (ecol_516, ecol_736) härledda från Illumina-data. De linjerade staplarna i anslutning till plasmidnamnen representerar plasmidsekvenser: ljusgrått anger regioner med 100 % sekvensidentitet, svart representerar nukleotiddiversitet mellan sekvenser och tunna linjer representerar indels. Kodningssekvenser representeras av tjocka pilar under enskilda sekvenser och är färgkodade enligt färgnyckeln. Det inlagda schemat som beskriver den genetiska variationen mellan sekvenser visar exempel på identifierade evolutionära händelser: (a) förändring på en enda nukleotidnivå, (b) små indels (≤100 bp), (c) stora indels (>100 bp), (d) rekombinationshändelser.

I plasmid-12 (FJ223605) har Tn4401b infogats i ett hybrid Tn2-Tn3-liknande element (med associerade läkemedelsresistensgener inklusive bla TEM-1, bla OXA-9 och flera aminoglykosidresistensgener), dock i avsaknad av dubblering av målsekvensen, möjligen som ett resultat av en intramolekylär, replikativ transponeringshändelse som genererar missanpassade målplatssekvenser (L TSS = TATTA; R TSS = GTTCT). Detta komplex är i sin tur placerat mellan två IS15DIV (IS15Δ)/IS26-liknande element som flankeras av inverterade upprepningar på 8 bp, och är placerat mellan traI (891 bp från 3′ slutet) och pld loci (~28 Kb; Fig. 3A). IncN-plasmid-12:s ryggradskomponenter stämmer överens med dem som observerats i ett NIH-utbrott5 och i en omarbetad version i ett utbrott från University of Virginia (CAV1043; 2008)6 . Från denna studie har plasmider från ecol_224, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_422 och scaffolds från ecol_AZ151, ecol_744, ecol_AZ150 alla nästan identiska strukturer som Plasmid-12, med klustrad nukleotidnivåvariation i traJ-traI-generna, vilket är förenligt med en homolog rekombinationshändelse som påverkar denna region, och bevis på sporadiska insättnings- och utplåningshändelser (fig. 3A). Bla KPC-Tn4401-strukturerna i dessa isolat är dock nästan helt nedbrutna av närvaron av andra mobila genetiska element (MGE), inklusive Tn2/Tn3-liknande element, ISKpn8/27 och Tn1721. I ecol_224 har bla KPC-2 förts in i IncN-ryggen som en del av två upprepade, inverterade Tn3-liknande strukturer, flankerade av en TTGCT TSD, och närmare traI (136 bp från 3′-ändan) än det tidigare nämnda IS15DIV (IS15Δ)/IS26-liknande komplexet i plasmid-12 (fig. 3B). Även om det inte är möjligt att exakt spåra den här genomiska regionens evolutionära historia med tanke på tillgängliga data, tyder förekomsten av gemensamma signaturer av denna struktur i ecol_422, ecol_744, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_AZ150 och ecol_AZ151 på en gemensam anskaffning och flera efterföljande omarrangemang som förmedlas av närvaron av det stora antalet MGE:er som flankerar bla KPC-2.

Skematisk jämförelse av FJ223605-liknande (Plasmid-12-liknande) IncN KPC-plasmider från denna studie. Panel 3A. Geografiskt ursprung, datum för isolering och övergripande anpassning av plasmid/kontigstrukturer. Plasmidsekvensnamn i rött är de från den här studien som härrör från PacBio-data och slutna (ecol_224, ecol_422, ecol_881, ecol_AZ159) eller ofullständiga plasmidstrukturer (ecol_744, ecol_AZ151, ecol_AZ150) som härrör från Illumina-data. De linjerade staplarna i anslutning till plasmidnamnen representerar plasmidsekvenser: ljusgrått anger regioner med 100 % sekvenshomologi, svart representerar nukleotiddiversitet mellan sekvenserna, och tunna linjer representerar indels. Kodningssekvenser representeras av tjocka pilar under enskilda sekvenser och är färgkodade enligt färgnyckeln. Det inlagda schemat som beskriver den genetiska variationen mellan sekvenser visar exempel på identifierade evolutionära händelser: (a) förändring på en enda nukleotidnivå, (b) små indels (≤100 bp), (c) stora indels (>100 bp), (d) rekombinationshändelser. Panel 3B. Närbild av regionen mellan traI och pld som innehåller bla KPC-2 endast i undersökningsisolat. Kodande sekvenser är färgkodade som i figur 3A; sekvensregioner som det hänvisas till i texten är annoterade.

Kolliknande plasmider kan utgöra en viktig överföringsvektor för bla KPC i E. coli

Små col-liknande plasmider var den näst vanligaste typen av plasmid som bar bla KPC i E. coli (n = 5 ), men tre av dessa var identiska (bla KPC-2, 16 559 bp), alla isolerade i Pittsburgh, USA, från ST131-isolat under en tvåårig period (ecol_276 , ecol_356 , ecol_875 ). Dessa tre isolat innehöll dessutom FIA-, FIB-, FII-, X3- och X4-replikoner, vilket tyder på stabil persistens av en klonal stam + plasmider över tid, vilket stämmer överens med både SNV/core- och accessoriska genomanalyser (fig. 1, fig. S1).

De andra två col-liknande plasmiderna representerar i själva verket korta DNA-sträckor som kodar för olika mobiliseringsgener (mbeA/mbeC/mbeD) som är kopplade till Tn4401/bla KPC-moduler. De sekvenser på 5 bp som flankerar Tn4401 överensstämde med direkt, intermolekylär transposition i båda fallen (ecol_870: TGTTT-TGTTT; ecol_867: TGTGA-TGTGA). En col/repA- samintegrerad plasmid observerades också i detta dataset (ecol_AZ161), där Tn4401b infogades mellan colE3-signatursekvenser och ett Tn3-element (Tn4401 TSS: AGATA-GTTCT). Bildandet av sådana samintegrerade plasmidstrukturer i E. coli har också tidigare beskrivits36, inklusive en fusionerad col/pKpQIL-liknande plasmidstruktur (pKpQIL har historiskt sett förknippats med bla KPC)37.

Col-liknande plasmider har förknippats med KPC-producenter i andra mindre, regionala studier21, 38. Dessa små vektorer har visat sig vara ansvariga för spridningen mellan arter av qnr-gener som förmedlar fluorokinolonresistens, även i avsaknad av ett uppenbart antimikrobiellt selektionstryck39. Den betydande associeringen av col-liknande plasmider med vissa E. coli STs (främst ST131) i den här studien kan vara en förklaring till den oproportionerliga representationen av bla KPC i den här linjen.

Diverse Tn4401 5 bp target site sequences (TSSs) stödjer hög transposonmobilitet

Fullständiga Tn4401-isoformer som flankerar bla KPC-2 eller bla KPC-3 observerades endast i 24/43 (56 %) isolat, inklusive Tn4401a/a-like (n = 10; ett isolat med ett kontigbrott uppströms bla KPC), Tn4401b (n = 12) och Tn4401d (n = 2) varianter. Elva olika 5 bp målplatssekvenser (TSS) identifierades, varav 7 (64 %) inte observerades i någon jämförelseplasmid hämtad från GenBank (tabell S5). Tn4401a hade tre olika 5 bp TSS-partier, Tn4401b sju och Tn4401d en. De flesta representerade TSD:er, men i tre fall flankerade olika 5 bp TSS:er Tn4401, vilket är förenligt med både direkta inter- och replikativa intramolekylära transponeringshändelser.

Från hela uppsättningen GenBank-plasmider och in vitro-transponeringsexperiment som utförts av andra har 30 olika typer av 5 bp TSS-par karakteriserats, varav sju endast i den experimentella miljön40. De nedladdade plasmiderna kommer från en rad olika arter och tidpunkter (2005-2014), även om de kan underrepresentera en bredare mångfald av Tn4401-insättningsställen till följd av provtagningsbias. Våra data skulle dock stämma överens med en betydande rörlighet för Tn4401 inom E. coli efter förvärv av olika Tn4401-isoformer och/eller representerar flera importhändelser till E. coli från andra arter.

Den traditionella kopplingen mellan bla KPC och Tn4401 har minskat avsevärt i KPC-plasmider i E. coli

Noterbart är att i de andra 19/43 (44 %) isolaten hade Tn4401-strukturen försämrats genom att den ersatts med MGE:er, av vilka endast några har beskrivits tidigare41, 42. Två isolat hade nya Tn4401Δb-strukturer (trunkeringar uppströms av IS26 eller IS26-ΔIS5075 ). En Tn4401e-liknande struktur (255 bp deletion uppströms från bla KPC) fanns i tre isolat (ecol_227, ecol_316, ecol_583): denna karaktäriserades ytterligare i en komplett PacBio-plasmidassemblering (ecol_316) och representerade en omgruppering vid platsen för L TSS av ISKpn7-elementet. I denna plasmid fanns ett andra, partiellt Tn4401-element utan bla KPC, vilket skulle stämma överens med en ofullständig, replikativ, intramolekylär transponeringshändelse (GGGAA = L TSS och R TSS på de två Tn4401b-elementen, i omvänd riktning). Andra motiv som flankerar bla KPC var bl.a. följande: hybrid Tn2/Tn3-element-ISKpn8/27-bla KPC (n = 1; ecol_224); IS26-ΔtnppR(Tn3)-ISKpn8/27- bla KPC-ΔTn1721-IS26 (n = 5; ecol_AZ153-AZ155, ecol_AZ166, ecol_AZ167); ISApu2-tnppR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-klcA-ΔTn1721-IS26 (n = 1; ecol_542); IS26-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC-korC-IS26 (n = 1; ecol_545); hybrid Tn2/Tn3-element + ΔblaTEM-bla KPC-ΔTn1721 (n = 2; ecol_744, ecol_422), Tn3-element-Δbla TEM-bla KPC- ΔTn1721 (n = 4; ecol_881, ecol_AZ151, ecol_AZ159, ecol_AZ150) och ΔTn3-Δ -Δ -ΔIS3000 (Tn3-liknande) (n = 1; ecol_AZ152). Vi kunde inte bedöma den flankerande kontexten för bla KPC i ecol_452 på grund av begränsningar i sammansättningen.

Denna uppenbara mångfald i oberoende förvärvade MGE:er runt bla KPC-genen utökar de sätt på vilka bla KPC kan mobiliseras. Intressant nog, som observerats tidigare43, var alla nedbrutna Tn4401-sekvenser i detta dataset förknippade med varierande sträckor av flankerande Tn2/3-liknande sekvenser, vilket tyder på att införandet av Tn4401 i en Tn2/Tn3-liknande kontext kan ha gjort det möjligt för den sistnämnda att fungera som en hotspot för införandet av andra MGE:s6. Ett särskilt intressant resultat är associeringen med IS26, som har kopplats till spridningen av flera andra resistensgener i E. coli, inklusive CTX-M ESBLs24, 44; kan öka uttrycket av nära samlokaliserade resistensgener45; deltar i bildandet av samintegrerade gener och därmed plasmidrearrangemang46; och ökar förekomsten av andra IS26-medierade överföringshändelser till plasmider som hyser IS2646.