Un écran génétique haploïde pour la dépendance au glucose

De nombreuses lignées cellulaires immortalisées montrent une flexibilité nutritionnelle limitée et sont fortement dépendantes du glucose comme source primaire de carbone. Nous avons constaté que la survie de la lignée cellulaire haploïde humaine Hap1 nécessite du glucose dans le milieu de culture. Afin d’identifier les facteurs impliqués dans cette  » dépendance au glucose « , nous avons effectué un criblage génétique haploïde15 pour isoler les mutants qui survivent en l’absence totale de glucose. Nous avons mutagénisé au hasard 1 × 108 cellules Hap1 à faible multiplicité d’infection avec un vecteur rétroviral piège à gènes16 et cultivé la population mutagénisée dans un milieu pauvre en glucose pendant 12 jours. Après la mort de la majorité (>99%) des cellules, les cellules résistantes à la déplétion en glucose ont été récupérées et développées dans un milieu riche en nutriments. Les sites d’insertion de gènes de la population résistante ont été identifiés par séquençage Illumina basé sur la PCR inverse17. Dans la population sélectionnée, les gènes SLC3A2/4F2hc (399 insertions distinctes) et xCT/SLC7A11 (39 insertions) ont été perturbés à une fréquence élevée par intégration rétrovirale (Fig. 1a). De façon remarquable, les produits protéiques de ces gènes sont connus pour interagir physiquement, avec la sous-unité SLC3A2 appelée chaîne lourde et la sous-unité SLC7A11 appelée chaîne légère, pour former l’antiporteur d’acides aminés connu sous le nom de système xc- ou antiporteur xCT18. L’antiporteur xCT est un transporteur d’acides aminés à la surface des cellules qui exporte le glutamate en échange de la cystine. Cet échange est important pour la défense contre les espèces réactives de l’oxygène (ROS) cellulaires, car la cystine est le dimère oxydé de la cystéine, un précurseur critique pour la synthèse du glutathion (GSH), un antioxydant majeur19. Par souci de clarté, nous désignons le transporteur fonctionnel par le terme  » système xc-  » ou  » antiporteur xCT « , et la sous-unité de la chaîne légère par le terme SLC7A11.

(a) Représentation des insertions de piège à gènes trouvées dans les gènes SLC3A2 et SLC7A11, dans les cellules Hap1 survivant à la déplétion en glucose. Les rectangles noirs représentent les exons, et les marques bleues les événements d’insertion. Le nombre d’insertions dans les pièges à gènes des populations non sélectionnées et sélectionnées a été analysé par le test exact unilatéral de Fisher pour calculer les valeurs P. (b) Analyse par transfert Western des niveaux de SLC3A2 et SLC7A11 dans les cellules Hap1 WT (WT), AC6 (clone de piège à gène SLC7A11) et AC24 (clone de piège à gène SLC3A2). (c) Quantification de la libération de glutamate dans le milieu. Les valeurs ont été normalisées par rapport à WT. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3) ; **P<0,01 ; test t de Student non apparié. (d,e) Images représentatives (d) et quantification (e) de la viabilité cellulaire 24 h après le retrait du glucose, avec véhicule (DMSO) ou 500 μM de sulfasalazine (SASP). Barre d’échelle, 200 μm. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3).

Pour caractériser les conséquences cellulaires de ces perturbations génétiques, nous avons isolé des clones Hap1 avec des insertions de pièges génétiques SLC3A2 et SLC7A11. Le mutant SLC3A2, appelé AC24, présente une insertion de piège à gène dans le deuxième intron de SLC3A2 dans l’orientation attendue pour la perturbation du gène et ne montre aucune expression de SLC3A2. De plus, l’expression de SLC7A11 est nettement plus faible, ce qui est attendu car SLC3A2 doit s’associer à SLC7A11 pour former un complexe stable (Fig. 1b). Le mutant SLC7A11, appelé AC6, a une insertion de piège à gène dans la région 5′ non traduite du premier exon de SLC7A11 et montre une expression SLC7A11 considérablement réduite au niveau de la protéine (Fig. 1b) et de l’ARNm (Fig. 1 supplémentaire). Les niveaux de SLC3A2 ne sont pas affectés dans AC6, probablement parce que la sous-unité SLC3A2 est partagée par plusieurs transporteurs d’acides aminés18. Les deux clones montrent une libération plus faible de glutamate dans le milieu (Fig. 1c), confirmant que le système xc- est fonctionnellement perturbé. Il est important de noter que les deux clones montrent une viabilité fortement améliorée dans des conditions de carence en glucose (Fig. 1d,e). Après 24 heures de privation de glucose, >70% des cellules des deux clones restent viables, alors que seulement 10% des cellules parentales Hap1 survivent. Conformément à ce résultat, le traitement des cellules Hap1 avec la sulfasalazine (SASP)20, un inhibiteur du système xc-, a amélioré la viabilité des cellules WT Hap1 après le retrait du glucose (Fig. 1d,e).

Le système xc- régule la viabilité cellulaire pendant le retrait du glucose

Pour confirmer indépendamment les résultats du crible génétique, nous avons utilisé des ARN à épingle à cheveux courte (shRNA) pour knockdown stablement le système xc- dans les cellules Hap1 (Fig. 2a). Comme SLC3A2 a des fonctions pléiotropiques en tant que chaîne lourde commune à plusieurs transporteurs d’acides aminés18, nous avons concentré nos efforts de knockdown sur la sous-unité SLC7A11. Les cellules contenant l’un des deux shRNA SLC7A11 indépendants ont libéré beaucoup moins de glutamate dans le milieu (Fig. 2b). Elles ont montré une viabilité considérablement améliorée après le retrait du glucose (Fig. 2c). Cependant, il n’y avait aucun changement dans le taux de prolifération dans les milieux contenant du glucose (Fig. 2a supplémentaire).

(a) Analyse par Western blot des niveaux de protéine SLC7A11 dans les cellules Hap1 knockdown SLC7A11 et HeLa surexprimant SLC7A11. (b) Quantification de la libération de glutamate dans le milieu. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=4) ; **P<0,01 ; test t de Student non apparié ; scr, shRNA brouillé. (c,d) Viabilité cellulaire 24 heures après le retrait du glucose. Les cellules Hap1 knockdown SLC7A11 (c) et les cellules HeLa surexprimant SLC7A11 (d) ont été cultivées dans un milieu pauvre en glucose avec un véhicule (DMSO), 500 μM SASP ou 4 mM dm-αKG pendant 24 h. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3) ; vecteur : vecteur vide.

A l’inverse, nous nous sommes demandés si l’augmentation du niveau de système xc- dans une lignée cellulaire avec un faible SLC7A11 endogène sensibiliserait les cellules au retrait du glucose. Comparées aux cellules Hap1, les cellules HeLa exprimaient des niveaux presque indétectables de la sous-unité SLC7A11 (Fig. 2a) et présentaient une faible libération de glutamate dans le milieu (Fig. 2b). Il est intéressant de noter que les cellules HeLa témoins ont montré une viabilité élevée face à l’élimination du glucose (Fig. 2d). La surexpression de la sous-unité SLC7A11 a provoqué une forte augmentation de la libération de glutamate (Fig. 2a,b) et a considérablement augmenté la mort cellulaire lors de l’épuisement du glucose (Fig. 2d). Cependant, dans un milieu contenant du glucose, le taux de prolifération des cellules HeLa surexprimant la sous-unité SLC7A11 n’a pas changé par rapport au témoin (figure supplémentaire 2a). Ainsi, la surexpression de SLC7A11 est suffisante pour provoquer une dépendance au glucose. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant des conditions de culture à faible teneur en glucose (par opposition à l’absence de glucose dans les expériences ci-dessus) (figure supplémentaire 2b). En outre, ni le knockdown ni la surexpression de SLC7A11 n’ont modifié de manière significative la viabilité cellulaire lors de la déplétion en glutamine (figure supplémentaire 2c). Pris ensemble, ces résultats indiquent que le niveau d’activité du système xc- contrôle la sensibilité des cellules au retrait du glucose.

Les avantages de la déplétion en xCT nécessitent le métabolisme de la glutamine

Lors du retrait du glucose, la glutamine devient la principale source de carbone et son métabolisme est essentiel à la survie cellulaire6,7,8. Une fois importée, la glutamine intracellulaire est convertie en glutamate, puis en α-cétoglutarate, un intermédiaire du cycle TCA. Par conséquent, nous avons supposé que les cellules présentant une faible activité du système xc- pourraient être mieux à même de maintenir les niveaux de glutamate intracellulaire et son métabolisme dans le cycle TCA. Pour tester cette idée, nous avons mesuré directement les niveaux de glutamate intracellulaire 1 h après le retrait du glucose. Les cellules knockdown SLC7A11 (Fig. 3a) et les mutants pièges à gènes SLC3A2 ou SLC7A11 (Fig. 3a supplémentaire) ont maintenu leur niveau de glutamate intracellulaire après le retrait du glucose bien mieux que les cellules témoins. À l’inverse, les cellules HeLa surexprimant SLC7A11 présentaient des niveaux de glutamate intracellulaire inférieurs à ceux des cellules témoins (Fig. 3b). Conformément au rôle connu du système xc- pour la synthèse du GSH, le knockdown de SLC7A11 a réduit le niveau de GSH intracellulaire dans les cellules Hap1, tandis que les cellules HeLa surexprimant SLC7A11 ont montré des niveaux de GSH plus élevés que les cellules témoins (figure supplémentaire 3b).

(a,b) Quantification du glutamate intracellulaire dans les cellules Hap1 knockdown SLC7A11 (a) et les cellules HeLa surexprimant SLC7A11 (b) avant et 1 h après l’élimination du glucose. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3) ; **P<0,01 ; test t de Student non apparié. (c) Enzymes et inhibiteurs impliqués dans le métabolisme de la glutamine/glutamate. (d,e) Viabilité des cellules Hap1 24 heures après le retrait du glucose. Les médicaments suivants ont été ajoutés comme indiqué : 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES ou 4 mM dm-αKG. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3). (f) Consommation d’oxygène dans des conditions d’appauvrissement en glucose. Les cellules ont été incubées pendant 3 h dans un milieu pauvre en glucose (1 mM de glutamine) et la RCO a été mesurée. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=4) ; *P<0.05. **P<0,01 ; test t de Student non apparié. (g) Modèles de marquage isotopique des intermédiaires du TCA. Les cellules ont été incubées pendant 8 h dans un milieu sans glucose contenant de l’U-13C5-glutamine avant d’extraire les métabolites. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3).

Nous avons ensuite demandé si le métabolisme de la glutamine/glutamate est important pour l’amélioration de la survie cellulaire des cellules déficientes en système xc pendant le retrait du glucose. Nous avons testé trois composés, l’aminooxyacétate (AOA, inhibiteur d’aminotransférase) et le gallate d’épigallocatéchine (EGCG, inhibiteur de glutamate déshydrogénase)21 qui inhibent les enzymes impliquées dans la conversion de la glutamine en glutamate puis en α-cétoglutarate (Fig. 3c). Après traitement par l’EGCG, les cellules Hap1 perturbées pour SLC7A11 (Fig. 3d ; Fig. 3c supplémentaire) ou SLC3A2 (Fig. 3c supplémentaire) ne présentent plus une viabilité accrue en cas de privation de glucose, ce qui suggère que la glutamate déshydrogénase (GDH) est essentielle pour cet effet. Comme la GDH convertit le glutamate en α-cétoglutarate, nous avons demandé si l’α-cétoglutarate pouvait inverser l’effet inhibiteur de l’EGCG. En effet, l’effet inhibiteur de l’EGCG a été entièrement compensé par une supplémentation en α-cétoglutarate de diméthyle (dm-αKG), une forme d’α-cétoglutarate perméable aux cellules (Fig. 3e ; Fig. 3d supplémentaire). En outre, la supplémentation en dm-αKG pendant le retrait du glucose a considérablement amélioré la viabilité cellulaire des cellules Hap1 de type sauvage (WT) et à shRNA témoin (Fig. 3e ; Fig. 3d supplémentaire) et des cellules HeLa surexprimant SLC7A11 (Fig. 2d), tandis que la supplémentation supplémentaire en glutamine dans le milieu n’a pas amélioré de manière significative la viabilité cellulaire (Fig. 3e supplémentaire). Par conséquent, ces résultats suggèrent que la conversion du glutamate en α-cétoglutarate sous-tend l’effet protecteur de la perturbation du système xc- dans des conditions de carence en glucose. L’absence d’effet du BPTES ou de l’AOA suggère que GLS1 n’est pas la glutaminase primaire dans les cellules Hap1, et que la GDH, plutôt que l’aminotransférase, est importante pour la conversion du glutamate en α-cétoglutarate.

En l’absence de glucose, l’OXPHOS mitochondriale (en tant que source principale de synthèse d’ATP) devient essentielle pour la survie. Par le biais de l’anaplérose, l’α-cétoglutarate dérivé de la glutamine réapprovisionne les intermédiaires du cycle TCA, qui génère des substrats pour alimenter l’OXPHOS21. Nous avons donc testé si les niveaux du système xc- peuvent réguler la respiration mitochondriale. En présence de glucose, le taux de consommation d’oxygène (RCO) des cellules Hap1 knockdown SLC7A11 ou des cellules HeLa surexprimant SLC7A11 est comparable à celui des cellules témoins (figure supplémentaire 3f). Cependant, les cellules knockdown SLC7A11 montrent une respiration mitochondriale plus élevée après 3 h de déplétion de glucose, tandis que le ROC des cellules HeLa surexprimant SLC7A11 est inférieur à celui des cellules témoins sous retrait de glucose (Fig. 3f).

Des travaux récents ont montré que l’α-cétoglutarate généré à partir de la glutamine consommée peut subir un métabolisme oxydatif via le cycle TCA  » avant « , dans le sens des aiguilles d’une montre, ou une carboxylation réductrice via une réaction TCA  » inverse  » dans le sens inverse des aiguilles d’une montre22,23,24. Le flux relatif à travers le cycle TCA avant et le cycle TCA inverse peut être déterminé en utilisant un marquage isotopique 13C stable (C5) de la glutamine extracellulaire et en mesurant l’incorporation du marqueur dans les intermédiaires du cycle TCA22,23,25. Pour déterminer si la modulation du système xc- modifie le flux du cycle TCA vers l’avant ou vers l’arrière, des cellules HeLa SLC7A11 knockdown Hap1 ou surexprimées ont été cultivées en l’absence de glucose et avec de la U-13C5-glutamine (voir Méthodes). L’exposition à l’U-13C5-glutamine extracellulaire a entraîné un marquage presque complet (M+5) de la glutamine et du glutamate intracellulaires (figure supplémentaire 3g). Le glutamate marqué est entré dans le TCA via une réaction anaplérotique en α-cétoglutarate avec un marquage M+4 des intermédiaires avancés du TCA : succinate, fumarate, malate et citrate (Fig. 3g). Le marquage M+5 du citrate (produit TCA réducteur) a été observé à un degré beaucoup plus faible (∼8:1 M+4:M+5 citrate), ce qui indique un faible flux TCA inverse. Fait important, le degré relatif du flux avant par rapport au flux inverse n’a pas été modifié par le knockdown ou la surexpression de SLC7A11.

L’xCT régule la dépendance des cellules cancéreuses du sein au glucose

Pour étendre nos observations sur l’effet négatif du système xc- sur le métabolisme de la glutamine et la respiration, nous avons analysé les données d’expression génique de 947 lignées cellulaires cancéreuses du projet Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)26. Pour chaque type de cancer, nous avons classé 15-20 lignées cellulaires cancéreuses en deux catégories : celles qui expriment fortement et celles qui expriment faiblement le système SLC7A11, et nous avons effectué une analyse d’enrichissement des ensembles de gènes entre ces deux groupes. Nous avons constaté que les gènes liés à l’OXPHOS étaient enrichis dans les groupes exprimant peu SLC7A11, en particulier dans les lignées cellulaires de cancer du poumon (valeur P=0,018) et du sein (valeur P=0,039). En outre, l’analyse de 59 cellules cancéreuses du sein a montré une corrélation négative marquée et sélective entre l’expression de SLC7A11 et les gènes de l’OXPHOS mitochondriale (figures supplémentaires 4a,b). Cette observation suggère que la plupart des cellules cancéreuses du sein présentant une faible expression de SLC7A11 ont un profil d’expression compatible avec une régulation à la hausse de la machinerie OXPHOS, et vice versa.

Nous avons choisi deux lignées cellulaires de cancer du sein, Hs578T et SK-BR-3, comme représentatives des lignées cellulaires exprimant fortement et faiblement SLC7A11, respectivement (figure supplémentaire 4a). Conformément aux données d’expression de la CCLE, les cellules Hs578T ont montré un niveau d’expression élevé de SLC7A11 et une libération active de glutamate dans le milieu, tandis que les cellules SK-BR-3 ont montré une faible expression de SLC7A11 et aucune libération détectable de glutamate (Fig. 4a ; Fig. 5a supplémentaire). Nous avons également déterminé le statut métabolique des cellules Hs578T et SK-BR-3 en mesurant les activités de l’OCR et de la glycolyse (taux d’acidification extracellulaire (ECAR)). Les cellules Hs578T ont montré une OCR plus faible et un rapport OCR/ECAR plus faible que les cellules SK-BR-3 (Fig. 4b,c), ce qui suggère que les cellules Hs578T sont plus dépendantes de la glycolyse que les cellules SK-BR-3. La plupart des cellules Hs578T, comme les cellules Hap1, sont mortes lors du retrait du glucose (Fig. 4d), alors que les cellules SK-BR-3 étaient résistantes (Fig. 4e). Les cellules Hs578T dépourvues de SLC7A11 ont montré une diminution de la libération de glutamate dans le milieu (Fig. 5a supplémentaire) et ont maintenu plus efficacement les niveaux de glutamate intracellulaire lors de la privation de glucose (Fig. 5b supplémentaire). Il est important de noter que le knockdown de SLC7A11 a considérablement amélioré la viabilité des cellules Hs578T pendant le retrait du glucose (Fig. 4d). Cependant, les cellules Hs578T dépourvues de SLC7A11 présentaient des niveaux de ROS cellulaires plus élevés que les cellules témoins, ce qui est cohérent avec son rôle dans la défense antioxydante (figure supplémentaire 5c). À l’inverse, les cellules surexprimant SLC7A11 présentaient des taux de ROS plus faibles (figure supplémentaire 5c). La survie des cellules Hs578T knockdown SLC7A11 pendant le retrait du glucose a été abolie par l’EGCG et le BPTES, ce qui implique à nouveau que la production d’α-cétoglutarate à partir du glutamate est essentielle (Fig. 4d). Comme prévu, les effets néfastes du traitement à l’EGCG ou au BPTES ont été entièrement annulés par la supplémentation en dm-αKG (Fig. 4d). L’effet différentiel du BPTES (comparer la Fig. 4d avec la Fig. 3d) implique que GLS1 est la glutaminase primaire dans les cellules Hs578T mais pas dans les cellules Hap1.

(a) Niveaux de protéine SLC7A11 dans les cellules Hs578T inactivées par SLC7A11 et les cellules SK-BR-3 surexprimant SLC7A11. (b,c) Statut métabolique dans des conditions d’alimentation en glucose. L’OCR (b) et le rapport OCR/ECAR (c) ont été mesurés en présence de 10 mM de glucose+2 mM de glutamine. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3). (d,e) Viabilité cellulaire 24 h après le retrait du glucose. Les cellules Hs578T knockdown SLC7A11 (d) et les cellules SK-BR-3 surexprimant SLC7A11 (e) ont été cultivées dans un milieu pauvre en glucose pendant 24 h. Les médicaments suivants ont été ajoutés comme indiqué : 500 μM SASP, 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES ou 4 mM dm-αKG. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3).

La surexpression de SLC7A11 dans les cellules SK-BR-3 a augmenté la libération de glutamate (figure supplémentaire 5a) et a réduit de façon concomitante la capacité à maintenir le glutamate intracellulaire dans des conditions de carence en glucose (figure supplémentaire 5b). La surexpression de SLC7A11 a provoqué une mort cellulaire importante chez les SK-BR-3 après le retrait du glucose. La mort cellulaire a été sauvée par l’ajout de dm-αKG, ce qui suggère que la surexpression de SLC7A11 entraîne une carence en α-cétoglutarate dans des conditions de carence en glucose (Fig. 4e).

Les cellules Hs578T avec knockdown de SLC7A11 ont pu maintenir leur activité respiratoire pendant des périodes prolongées après le retrait du glucose (Fig. 5d supplémentaire). À l’inverse, les cellules SK-BR-3 surexprimant SLC7A11 ont présenté un déclin brutal de l’OCR sous le même régime. Pris ensemble, ces résultats indiquent que le système xc- dans les cellules du cancer du sein régule le flux de glutamate intracellulaire dans le cycle TCA et augmente la sensibilité au retrait du glucose.

Nrf2 opère en amont de SLC7A11

Nrf2 (facteur nucléaire érythroïde 2-like 2, NFE2L2) est un facteur de transcription clé qui régule à la hausse de nombreux gènes cytoprotecteurs impliqués dans le stress oxydatif27. Comme SLC7A11 est un gène cible connu de Nrf2 (réf. 27), nous avons examiné la corrélation entre l’expression de Nrf2 et de SLC7A11 dans les cellules cancéreuses. L’expression de Nrf2 est positivement corrélée à l’expression de SLC7A11 dans 59 lignées cellulaires de cancer du sein (R=0.5688), ainsi que dans les 947 lignées cellulaires de cancer (R=0.4306) dans les données d’expression de la CCLE. En outre, l’expression du gène cible Nrf2 présente une corrélation élevée avec l’expression de SLC7A11 dans les 947 lignées cellulaires cancéreuses. Le coefficient de corrélation (R) entre SLC7A11 et les gènes cibles de Nrf2 sont : NQO1 (+0,4179), GCLC (+0,3283), GCLM (+0,3944) et TXNRD1 (+0,4321).

Ces corrélations suggèrent que Nrf2 soutient l’expression de SLC7A11 dans un sous-ensemble de cellules cancéreuses. Pour tester cette idée, nous avons éliminé Nrf2 dans les cellules cancéreuses du sein Hs578T et MDA-MB-231, deux cellules qui expriment fortement SLC7A11. Le knockdown de Nrf2 a provoqué une diminution marquée de l’expression de SLC7A11 (Fig. 5a,b,e) et a réduit la libération de glutamate (Fig. 5c,f). Il est important de noter que les cellules dépourvues de Nrf2 ont montré une viabilité considérablement améliorée pendant le retrait du glucose (Fig. 5d,g). Là encore, ce changement de viabilité dépend du métabolisme du glutamate, car le traitement à l’EGCG a aboli l’effet pro-survivant du knockdown de Nrf2 (Fig. 5d). En outre, la supplémentation en α-cétoglutarate était suffisante pour favoriser la survie des cellules, même en présence d’EGCG.

(a) Western blot des niveaux de protéine SLC7A11 dans les cellules Hs578T Nrf2 et SLC7A11 knockdown. (b) Analyse par RT-PCR en temps réel des niveaux d’ARNm de Nrf2 et SLC7A11 dans les cellules MDA-MB-231 knockdown de Nrf2 et SLC7A11. Les mesures ont été normalisées par rapport aux niveaux d’ARNr 18 s. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3) ; **P<0,01, test t de Student non apparié. (c,d) Analyse des cellules Hs578T Nrf2 et SLC7A11 knockdown. (c) Libération de glutamate dans le milieu. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3) ; **P<0,01 ; test t de Student non apparié. (d) Viabilité cellulaire 24 h après le retrait du glucose. L’EGCG (50 μM) et le dm-αKG (4 mM) ont été ajoutés comme indiqué. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=4). (e-g) Les cellules MDA-MB-231 ont été traitées avec le véhicule (DMSO) ou 15 μM de DMF pendant 24 h dans un milieu enrichi en glucose. Les manipulations supplémentaires comprenaient le knockdown de SLC7A11 ou de Nrf2, et la surexpression de SLC7A11. (e) Western blot des niveaux de SLC7A11 après traitement au DMF. (f) Libération de glutamate dans le milieu. Après prétraitement au DMF, les cellules ont été incubées dans un milieu frais déficient en glucose sans DMF, et le glutamate libéré dans le milieu a été mesuré à 2 h. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=4). (g) Viabilité cellulaire 24 h après la déplétion en glucose. Après prétraitement au DMF, les cellules ont été incubées dans un milieu frais déficient en glucose sans DMF pendant 24 heures supplémentaires avant de mesurer la viabilité cellulaire. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=4) ; NT, aucun traitement.

Pour examiner l’effet de l’upregulation de Nrf2, nous avons traité les cellules avec du fumarate de diméthyle (DMF), un activateur Nrf2 perméable aux cellules28. Le traitement au DMF a fortement induit l’expression de SLC7A11 et la libération de glutamate dans les cellules MDA-MB-231 (Fig. 5e,f). De plus, les cellules prétraitées avec le DMF ont montré une viabilité considérablement réduite pendant la déplétion de glucose par rapport aux cellules de contrôle (Fig. 5g). Nous avons exclu les effets hors cible en montrant que ces résultats du traitement au DMF dépendaient à la fois de SLC7A11 et de Nrf2 (Fig. 5f,g). Ensemble, ces résultats indiquent que l’axe Nrf2-SLC7A11 régule le métabolisme du glutamate, la dépendance des cellules cancéreuses au glucose et leur capacité à utiliser la glutamine comme source alternative de carbone. De manière importante, cela suggère que l’adaptation au stress oxydatif dans les cellules cancéreuses peut compromettre la flexibilité des nutriments, en particulier par le renforcement d’un phénotype de dépendance au glucose.

L’xCT régule la fonction mitochondriale dans les cellules mutantes de l’ADNmt

Nos résultats ci-dessus indiquent que les cellules avec une régulation ascendante du système xc- due au stress oxydatif peuvent avoir une flexibilité nutritive restreinte en raison d’une altération du métabolisme de la glutamine. L’inhibition de la chaîne respiratoire mitochondriale peut augmenter les espèces réactives de l’oxygène29,30. Nous avons constaté que l’expression de SLC7A11 était induite par des médicaments qui bloquent la fonction mitochondriale, en particulier la roténone et l’oligomycine, qui inhibent respectivement le complexe I (NADH déshydrogénase) et V (ATP synthase) de la machinerie OXPHOS (figure supplémentaire 6a). Conformément à ces résultats pharmacologiques, SLC7A11 était régulé à la hausse dans les cellules cybrides contenant des mutations homoplasmiques de l’ADNmt dans la sous-unité ND1 du complexe I ou la sous-unité ATP6 du complexe V (NARP) (Fig. 6a)30,31. L’induction de SLC7A11 était particulièrement marquée dans la lignée cellulaire NARP, dont on a signalé qu’elle présentait des niveaux élevés de ROS et une induction de l’enzyme mitochondriale de piégeage des ROS, la MnSOD30. L’induction de SLC7A11 dans les cellules cybrides NARP dépendait fortement des facteurs de transcription Nrf2 et Atf4 (figure supplémentaire 6b) et pouvait être supprimée par un traitement avec l’antioxydant N-acétylcystéine (figure supplémentaire 6c).

(a) Western blot des niveaux de SLC7A11 dans les cellules 143B et les cellules ND1 et NARP isogéniques mutantes de l’ADNmt. (b-e) Analyse des cellules ND1 et NARP knockdown ou traitées à l’éraste (Era) (5 μM), cultivées en présence de 10 mM de galactose et 2 mM de glutamine. (b) Quantification du glutamate intracellulaire 24 h après la culture du galactose. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=4) ; ** P<0,01 ; test t de Student non apparié. (c) Viabilité cellulaire en milieu galactose pendant 3 jours. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=4). (d) Images représentatives et quantification de la morphologie des mitochondries 24 heures après la culture au galactose. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=3). Barre d’échelle, 10 μm. (e) La consommation d’oxygène a été déterminée 24 heures après la culture de galactose. Les données représentent les moyennes±s.d. (n=5) ; **P<0,01 ; test t de Student non apparié. (f) Modèle pour les effets doubles de l’antiporteur xCT. L’antiporteur xCT détourne le métabolisme de la glutamine du cycle TCA vers la synthèse du GSH, qui est important pour la fonction antioxydante. Dans certaines conditions cellulaires, le détournement excessif de la glutamine du cycle TCA est préjudiciable (panneau du milieu) et donc l’inhibition de l’antiporteur améliore la survie (panneau de droite).

Nous avons cherché à savoir si ces changements compensatoires dans l’expression du système xc- affectent le métabolisme cellulaire dans les cellules cybrides. Conformément à leur plus forte expression de SLC7A11, les cybrides ND1 et NARP présentaient des niveaux de glutamate intracellulaire plus faibles (Fig. 6b). L’inhibition du système xc- par le knockdown de SLC7A11 ou un inhibiteur puissant, l’éraste, a augmenté le glutamate intracellulaire dans les cellules ND1 et NARP. De même, l’α-cétoglutarate intracellulaire, un produit du métabolisme du glutamate, a également été augmenté par l’inhibition de SLC7A11 (figure supplémentaire 6d). On sait depuis longtemps que les cellules présentant des défauts d’OXPHOS survivent mal sur un milieu contenant du galactose, ce qui oblige à une plus grande demande d’OXPHOS comme source de génération d’ATP32. Les cybrides mutants ND1 et NARP, contrairement aux cellules isogéniques WT 143B, n’ont pas été capables de survivre dans un milieu contenant du galactose (Fig. 6c ; Fig. supplémentaire 6e). Cependant, le knockdown de SLC7A11 ou le traitement à l’éraste ont fortement sauvé la viabilité des cybrides ND1 et NARP en milieu galactose. L’effet était plus marqué dans les cybrides NARP, qui présentaient une induction beaucoup plus importante de SLC7A11 (Fig. 6c).

Cette augmentation de la viabilité cellulaire était corrélée à une normalisation frappante de la morphologie mitochondriale. Notre groupe a précédemment rapporté que les cellules WT allongent leurs mitochondries dans des conditions de milieu qui nécessitent une activité OXPHOS accrue, alors que les cellules avec des mutations de l’ADNmt fragmentent plutôt leurs mitochondries33. Conformément à ce résultat, les cybrides ND1 et NARP ont montré une fragmentation mitochondriale marquée après 24 h de culture au galactose. En revanche, les cybrides ayant subi un knockdown de SLC7A11 ou un traitement à l’éraste ont présenté un allongement substantiel des mitochondries lorsque la source de carbone dans le milieu est passée du glucose au galactose (Fig. 6d ; Fig. 6f supplémentaire). Le knockdown de SLC7A11 n’a pas modifié les niveaux de plusieurs protéines de la dynamique mitochondriale, notamment Opa1, Mfn1 et Drp1 (figure supplémentaire 6g). En outre, les cellules SLC7A11 knockdown ont montré une activité respiratoire plus élevée que les cellules témoins-mutantes (Fig. 6e). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que l’inhibition du système xc- dans les cybrides mutants de l’ADNmt améliore la morphologie et la respiration mitochondriales, ce qui entraîne une survie nettement accrue en milieu galactose.