Abstract

Serumprover från 474 vilda fåglar, 378 hästar och 42 människor med hjärnhinneinflammation och lymfocytär hjärnhinneinflammation samlades in mellan 2010 och 2014 från olika områden i Polen. Antikroppar mot West Nile-virus (WNV) påvisades med hjälp av tävlingsenzymkopplade immunosorbentanalyser: ELISA-1 ID Screen West Nile Competition, IDvet, ELISA-2 ID Screen West Nile IgM Capture och ELISA-3 Ingezim West Nile Compac. Antikropparna hittades i 63 (13,29 %) av 474 serumprover från vilda fåglar och i ett (0,26 %) av 378 serumprover från hästar. Fjorton (33,33 %) av 42 serum från patienter var positiva mot WNV-antigen och ett serum var tveksamt. Positiva prover från fåglar testades därefter på nytt med virusmikronutraliseringstest för att bekräfta positiva resultat och korsreaktioner med andra antigener från det japanska encefalitkomplexet. Vi misstänker att positiva serologiska resultat hos människor, fåglar och hästar tyder på att WNV på något sätt kan ha ett nära samband med ekosystemet i Polen.

1. Introduktion

West Nile virus (WNV) kan drabba ett stort antal fågelarter, hästar och människor. Viruset är ett framväxande agens som ansvarar för sjukdomar hos dessa djur och människor över hela världen. De viktigaste vektorerna för WNV är flera arter av blodsugande insekter, som kan överföra viruset till fåglar, hästar och människor .

Infektionerna kännetecknas av hög pyrexi, förlamning och sjuklighet som orsakas av de faktorer som hittills erkänts som patogena endast för djuren. Oftare kännetecknas infektionerna av milda kliniska tecken .

WNV finns på Världsorganisationen för djurhälsa (OIE):s förteckning över neurotropa faktorer som orsakar sjukdomen enligt anmälningsplikten. West Nile Fever (WNF) som orsakas av viruset är en zoonos som är det största folkhälsoproblemet i USA .

WNV är ett arbovirus som tillhör familjen Flaviviridae, släktet Flavivirus som ingår i det antigena komplexet för japansk encefalit som induceras av antigeniskt besläktade virus som japanskt encefalitvirus (JEV), St Louis encefalitvirus (SLEV), Murray Valley encefalitvirus (MVEV) och Usutuvirus (USUV). Virusets ssRNA+-genom innehåller en enda öppen läsram med 11 000-12 000 nukleotider. Virusets genom består av sju icke-strukturella proteiner, NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b och NS5, och tre strukturella proteiner: glykoprotein E, kärnprotein C och premembranprotein prM .

Tropiska fåglar och flyttfåglar, som tillhör olika arter, är den huvudsakliga reservoaren för viruset . Linje 1 av WNV är en linje som isolerats över hela världen, men linje 2 isolerades endast i Afrika och Madagaskar, fram till de ungerska utbrotten av WNV, som orsakades av en ny linje 2, som introducerades till Ungern, troligen av flyttfåglar från Afrika, år 2004 . Samma linje 2 orsakade sommaren 2010 endemisk neuroinvasiv sjukdom (WNND) hos människor i Grekland med 262 bekräftade fall och 35 dödsfall. Under 2011 spred sig viruset till centrala Grekland, men med färre fall, 101 diagnostiserade fall och 9 dödsfall. Det totala antalet människor i Grekland som smittats av viruset uppskattas till 18000 .

Över 300 olika fågelarter har smittats av WNV. Vanligtvis cirkulerar viruset mellan vilda fåglar och myggor i ett slutet kretslopp och kan bäras av fåglarna under deras flyttningar till olika regioner.

Viruset förekommer i många länder runt om i världen och även i 20 europeiska länder, inklusive länder som är nära grannar till Polen, där förekomsten av viruset har bekräftats. Förekomsten av WNV-antikroppar har också bekräftats i serumprover från vilda fåglar och människor i Polen .

Under 2010 rapporterades morbiditet och dödlighet hos människor till följd av WNV-infektion i Grekland, Ryssland, Rumänien, Italien och Israel .Usutu-virusets spridning har också bekräftats i Polen . Inga andra studier har publicerats om cirkulationen av andra virus som är ansvariga för det japanska encefalitkomplexet i Polen.

Syftet med studien var att detektera WNV-antikroppar i serumprover från olika vilda fåglar, hästar och sjukhusvårdade patienter med neurologiska symtom.

2. Material och metoder

Fåglar. Serumprover från 474 vilda fåglar, 400 vita storkar (Ciconia ciconia), 21 vanliga fasaner (Phasianus colchicus), 19 vanliga bofinkar (Fringilla coelebs), nio vilda ankor (Anas platyrhynchos), fyra havsörnar (Haliaeetus albicilla), två västliga tuppar (Tetrao urogallus), sex passagerarduvor (Ectopistes migratorius), tre nordliga goshawks (Accipiter gentilis), två kråkfåglar (Corvus cornix), tre hökfåglar (Accipiter gentilis) samt en sångare (Apus apus), en koltrast (Turdus merula), en stare (Sturnus vulgaris), en korp (Corvus corax) och en ormvråk (Buteo buteo) samlades in på olika platser i Polen (Zoologiska trädgårdarna, rehabiliteringscentret för skyddade djur). De flesta proverna kom dock från Wild Birds Rehabilitation Center, Albatros Foundation. Proverna har samlats in under mars-oktober, 2010-2014, då myggornas aktivitet var som störst (figur 1).

Figur 1

Karta över Polen. Områden där proverna samlades in.

Hästar. 378 serumprover har tagits från friska domesticerade hästar från några få ranchar i fyra distrikt. Serumproverna togs även från tävlingshästar (figur 1).

Människor. Serumprover från 42 patienter (17 män och 25 kvinnor) från avdelningen för infektionssjukdomar och neuroinfektioner vid medicinska universitetet i Bialystok. Patienterna uppvisade neurologiska symtom som är karakteristiska för meningit, lymfocytär meningit och fästingburen encefalit. De var inlagda på sjukhus mellan maj och september 2010. Alla patienter testades för antikroppar mot fästingburet encefalitvirus med Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens . Proverna förvarades vid -20°C.

Alla undersökta prover dubbelkontrollerades och testades under biosäkerhetsnivå 3+ förhållanden.

ELISA-1. Serologisk undersökning utfördes med kommersiellt tillgänglig tävling, ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, Frankrike), för detektion av West Nile-virusantikroppar mot pr-E- och pr-M-höljeproteinerna som innehåller en epitop som är gemensam med japanskt encefalitvirus i enlighet med tillverkarens protokoll. Alla prover undersöktes två gånger. Mikroplattorna avlästes vid 450 nm. ELISA-analysen validerades när de återstående bindningsförhållandena (S/N%) beräknades. Serumprover med en S/N-kvot på 40 % eller mindre har betraktats som positiva; prover med en kvot på mer än 50 % har betraktats som negativa. S/N-värden mellan 40 % och 50 % var tveksamma.

ELISA-2 utfördes med ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, Frankrike). Brunnarna var belagda med IgM-polyklonala antikroppar. När positiva resultat erhölls syntes förekomsten av antikroppar som en blå lösning och efter tillsats av stopplösningen blev den gul. I avsaknad av antikroppar uppträdde ingen färgning. Plattorna avlästes vid 450 nm.

ELISA-3 utfördes med hjälp av Ingezim WNV Compac enzymatic assay (Ingenasa, Spanien) baserat på blockerande ELISA, där en monoklonal antikropp (MAb) som är specifik för WNV:s protein E användes. Om antikroppar fanns i serumproverna, band de till antigenet. När MAb som är specifikt för protein E tillsattes, band det till antigenet som inte blockerades av antikroppar från serumprovet. Om antikroppar blockerade antigenet, band konjugatet inte till det. Testet avlästes genom en kolorimetrisk reaktion efter tillsats av substrat. Proverna betraktades som positiva när OD-värdena var lika med eller lägre än de positiva kontrollserumproverna. Proverna betraktades som negativa när OD-värdet var lika med eller högre än det negativa gränsvärdet. Prover med OD-värde inom intervallet för båda värdena betraktades som tveksamma.

Virus Microneutralisation Test. Virusmikronutraliseringstest med ELISA-positiva prover från vilda fåglar utfördes i det europeiska referenslaboratoriet, ANSES, Frankrike. Vero-celler och West Nile-virus, stam IS-98-ST1, användes i testet. Testet baserades på OIE:s standardförfarande .

3. Resultat

Distrikt i Polen och områden där proverna samlades in visas i figur 1.

De flesta proverna togs från fåglarna i samband med tilldelningen och veterinärbehandlingar. En del av fåglarna befann sig på rehabiliteringscentret efter vissa olyckor. Fåglarna uppvisade inga symtom på neurologiska sjukdomar och inga tecken på neurologiska infektioner. Varje fågel försågs av den organisation som skickade proverna med information om plats, kön, ålder och, när det var möjligt, om resehistoria.

Undersökningarna av serumproverna avslöjade specifika WNV-antikroppar i 63 prover från vilda fåglar: 62 från vita storkar och en från bofink. Ett positivt serumprov erhölls från ett sto.

När det gäller serumprover från människor var 14 av 42 positiva och ett var tveksamt. Alla patienterna hade anamnes på mygg- och fästingbett. Fästingburen encefalit diagnostiserades hos 16 patienter.

För att bekräfta resultaten utfördes ELISA-2 för att påvisa specifika IgM-antikroppar mot WNV i serum som en första linje av immunitetssvar. Resultaten var negativa och bekräftade därför inte förekomsten av IgM-antikroppar eller några tecken på att djuren nyligen smittats.

För att verifiera de resultat som erhållits med ELISA-1 utfördes ELISA-3, och förekomsten av specifika WNV-antikroppar bekräftades i dessa fall. Resultaten presenteras i tabell 1.

För bekräftelse av positiva resultat testades fåglarnas positiva serumprover på nytt med ett mikronutraliseringstest för virus. Alla 63 serumprover från vilda fåglar bekräftades och identifierades som positiva för WNV-antikroppar med titern 10 i 60 prover och titern 30 i tre prover. När det gäller undersökningar av andra medlemmar av JECV var proverna också negativa för Usutu-virus. Inga korsreaktioner observerades.

Tabell 1 visar en jämförelse av de resultat som erhållits med olika diagnostiska metoder (ELISA och mikroneutraliseringstester för virus).

4. Diskussion

Under de senaste åren har det noterats att WNV sprids i länder med måttligt klimat. myggor från Culicidae-familjen är den vanligaste smittbäraren för viruset, och i dag finns sex av myggarterna i den polska klimatzonen. På 1990-talet bekräftade Juřicová et al. med hjälp av hemagglutinationsinhibitionsanalys WNV-antikroppar hos 12,1 % av hussparvarna (Passer domesticus) och hos 2,8 % av trädsparvarna (Passer montanus) i Campinas skogsområde i Polen. Under de följande åren hittades WNV-antikroppar hos tre storkar, en kråka (Corvus corone cornix) och en knölsvan (Cygnus olor) i den andra delen av Polen.

Vi har utfört tre olika ELISA-analyser för att presentera och sedan bekräfta de erhållna resultaten. Det första ELISA-testet var ID Screen West Nile Competition, ett test som är specifikt för WNV, men som också ger serologiska korsreaktioner bland JECV-medlemmarna. När positiva resultat erhölls utfördes ELISA-2 West Nile IgM Capture-testet, som är specifikt endast för WNV och gör det möjligt att utesluta korsreaktioner, men detekterar endast IgM. Det innebär att vi endast kan identifiera en nyligen inträffad infektion och inte kan påvisa IgG-antikroppar. ELISA-3 användes för att bekräfta de erhållna resultaten med ELISA-1 och resultaten bekräftades i 100 % av fallen.

I vår studie bekräftades positiva resultat med serumprover från vilda fåglar som erhållits med ELISA:erna med virusmikronutraliseringstest. Dessutom visade ELISA på WNV-antikroppar i 14 av 42 serumprover från patienter med symtom på hjärnhinneinflammation, lymfocytär hjärnhinneinflammation och fästingburen hjärnhinneinflammation, men vi kunde inte verifiera de erhållna resultaten med plakreduktionsneutralisationstest (PRNT). WNV-infektion hos människor och identifiering av WNV i cerebrospinalvätska bekräftades vanligen genom RT-PCR, Nested PCR , eller i formalinfixerade, paraffinininbäddade mänskliga vävnader genom RT-PCR. Enligt studien av Czupryna et al. var alla prover av cerebrospinalvätska från 24 patienter som lagts in på sjukhus vid avdelningen för infektionssjukdomar och neuroinfektioner vid medicinska universitetet i Bialystok negativa för WNV-RNA.

serumprover från människor, fåglar och hästar användes som lämpliga prover för att bestämma specifika WNV-antikroppar. Om vi bekräftade specifika antikroppar i serumproverna ansågs djuret eller människan ha varit i kontakt med viruset (i Polen eller utanför landet). Det antas att positiva vilda fåglar kan ha kommit i kontakt med viruset utanför landet. När det gäller de positiva proverna från människor lämnade 11 patienter aldrig landet, vilket innebär att de måste ha varit i kontakt med viruset redan i Polen. Detsamma gäller hästarna, som enligt deras resehistorik aldrig lämnade landet.

Med utgångspunkt i den epidemiologiska situationen i Europa, vilda fåglars roll i överföringen av WNV och resultaten av tidigare serologiska undersökningar av människor och fåglar tyder på att förekomsten av WNV i Polen kan vara möjlig. I Polen påvisades WNV-antikroppar hos febriga kvinnor och friska skogsarbetare från regionerna Swietokrzyskie (28,85 %) och Podlaskie (34,14 %) . Våra serologiska resultat kan tyda på att viruset redan finns i vår klimatzon och i vårt ekosystem. Möjligheten till korsreaktion med virus av fästingburen encefalit och endemiska sjukdomar bör beaktas.

Etiskt godkännande

Studien godkändes av den II lokala etikkommissionen i Lublin (nummer 92/2010 av den 16 november 2010) och fick tillstånd av generaldirektören för miljöskydd (nummer DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł).

Interessentkonflikter

Författarna uppger att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för det ekonomiska stödet från ramprojektet P/020, Free Living Water Birds as a Reservoir and the Vector during the Expansion of Viral Diseases, och ramprojektet W/211, Development Diagnostic Methods and Risk Evaluation of the Occurrence of West Nile Virus Infection in Birds in Poland (2014-2018).