Etablering av en mänsklig gastrisk cancer xenograftmodell i immunkompetenta möss med hjälp av Microcarrier-6
Abstract
Gastrisk cancer är en av de vanligaste maligna tumörerna i matsmältningskanalen. Att etablera en robust och pålitlig djurmodell är grunden för att studera cancerpatogenesen. I den här studien etablerades en musmodell av magkarcinom genom att inokulera immunkompetenta möss med MKN45-celler med hjälp av mikrobärare. Sextio manliga C57BL/6-möss delades slumpmässigt in i tre grupper: en 2D-grupp, en grupp med tom bärare och en 3D-grupp, i enlighet med samodlingssystemet av MKN45 och mikrobäraren. Musmodellerna upprättades genom hypodermisk injektion. Tid för att utveckla tumör, tumörbildningshastighet och patologiska egenskaper observerades i varje grupp. I 3D-gruppen var tumörbildningstiden kort, medan tumörbildningsgraden var hög (75 %). Det fanns ingen påvisbar tumörbildning i vare sig 2D-gruppen eller gruppen med tom bärare. Både H&E och immunohistokemisk färgning av tumör xenograft visade karakteristiska tecken på mänskliga gastriska neoplasmer. Den här studien etablerade framgångsrikt en modell för mänskligt magkarcinom i immunkompetenta möss, vilket ger en ny och värdefull djurmodell för cancerforskning och utveckling av cancerläkemedel.
1. Introduktion
Med cirka en miljon nydiagnostiserade fall årligen utgör magsäckscancer ett allvarligt hot mot människors hälsa och liv världen över . Patogenesen och mekanismerna för metastasering av magsäckscancer har dock ännu inte helt klarlagts. In vivo-modeller av magsäckscancer är viktiga verktyg för att utforska de biologiska egenskaperna hos denna cancer och potentiella nya behandlingsalternativ . Xenograftmodeller för magsäckscancer från människa har etablerats i immunbristande möss, t.ex. nakenmöss och möss med svår kombinerad immunbrist. Det är dock svårt att föda upp immunbristande möss och de är kostsamma. Det är viktigt att immunbristande möss inte återspeglar immunsystemets viktiga roll i tumörutveckling och tumörprogress. Det är därför av stor betydelse att skapa en ny xenograftmodell för mänsklig magsäckscancer hos möss med ett normalt immunförsvar. I den här studien samodlades MKN45, mänskliga magsäcksceller och mikrobäraren, och immunkompetenta möss inokulerades därefter med suspensionen, vilket ledde till att man lyckades etablera en ny xenograftmodell för mänsklig magsäckscancer.
2. Material och metoder
2.1. Material
Roswell Park Memorial Institute- (RPMI-) 1640 kulturmedium, trypsin, serum från fetalt nötkreatur och penicillin köptes från Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Monoklonala antikroppar mot humant kolhydratantigen 199 (CA199), cytokeratin 7 (CK-7) och caudal type homeobox 2 (CDX-2) köptes från Abcam (Cambridge, Storbritannien). Mikrobäraren-6 köptes från Elyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, USA).
2.2. Försöksdjur
Sextio 6-8 veckor gamla manliga C57BL/6-möss med en vikt på 22-25 g köptes från Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. (licensnummer: SCXK 20140007, Shandong-provinsen, Kina) och inhystes i ett specifikt patogenfritt djurcentrum vid det anslutna sjukhuset vid Jining Medical College (Shandong-provinsen, Kina). Alla djurförsök utfördes med godkännande av Institutional Animal Care and Use Committee of the Affiliated Hospital of Jining Medical University och utfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna.
2.3. Cellinjer
Cellinjen MKN45 för mänsklig magsäckscancer köptes från Cell Bank of the Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) och odlades i RPMI-1640-medium som innehåller 10 % serum från fetalt nötkreatur och 100 U/mL penicillin vid 37 °C med 5 % CO2. Odlingsmediet byttes var 24:e timme och cellerna skördades genom digestion med 0,25 % trypsin.
2.4. Etablering av en tredimensionell (3D) tumörcellkulturmodell
Mikrobäraren-6 blötlades i 75 % etanol i 24 timmar, tvättades tre gånger med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning och inkuberades i RPMI-1640-medium i 24 timmar. Därefter modifierades mikrobäraren-6 via en 3 timmars inkubering med stromalcellsavledd faktor-1 alfa (SDF-1α) och vaskulär endotelisk tillväxtfaktor (VEGF), båda i en koncentration på 100 ng/mL. Celler i logaritmisk tillväxtfas räknades efter trypanblåfärgning och justerades till en koncentration när livskraften var >95 %. MKN45-cellsuspensionen blandades med den modifierade mikrobäraren-6 och inkuberades vid 37 °C med 5 % CO2 i ytterligare 24 timmar för att mätta cellerna med mikrobäraren, vilket observerades med hjälp av mikroskopi (figurerna 1(c) och 1(d)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
2,5. Gruppering av djur
De 60 C57BL/6-mössen delades slumpmässigt in i tre grupper (20 möss per grupp): den tvådimensionella (2D) gruppen (djur som inokulerades med containing ), gruppen med tom bärare (djur som inokulerades med containing 30 μg mikrobärare-6) och 3D-gruppen (djur som inokulerades med containing och 30 μg mikrobärare-6).
2.6. Generering av djurmodell
Den 3D-tumörcellskulturmodellen etablerades på försökets första dag och inkuberades i 24 timmar. På den andra dagen tvättades de odlade cell-mikrobärarkomplexen tre gånger i och blandades försiktigt med för att justera koncentrationen till celler och 300 μg mikrobärare-6 per 1 mL suspension, och placerades på is för senare användning. MKN45-celler i logaritmisk tillväxtfas skördades, trypsiniserades, tvättades tre gånger med , och resuspenderades i i en koncentration av , som placerades på is för senare användning. Den modifierade mikrobäraren-6 tvättades tre gånger med , resuspenderades i en koncentration på 300 μg/mL och placerades på is för senare användning. Varje mus i alla tre försöksgrupperna inokulerades med 100 μL av motsvarande lösning under den högra axillärkammen.
2.7. Indikatordetektion och patologisk undersökning
Efter inokulering inhystes mössen separat per grupp, och daglig aptit, aktiviteter och vikt övervakades. Tiden för lokal tumörbildning och tumörvolym hos varje mus registrerades. När tumörerna var synliga mättes den långa diametern (a) och den korta diametern (b) för varje tumör dagligen, och tumörvolymen beräknades enligt tumörvolymformeln : . Tumörbärande möss offrades i tre omgångar: 10, 20 och 30 dagar efter inokuleringen. Tumörvävnader avlägsnades helt från varje mus och tumörkvalitet, textur och graden av infiltration och nekros registrerades. Tumörvävnaderna fixerades därefter i 4 % neutral buffrad formaldehyd och färgades med hematoxylin och eosin (H&E). EnVision-teknik för färgning i två steg användes för immunohistokemi. Färgningsresultaten fastställdes utifrån den positiva granulära cytoplasmafärgningen av tumören. Negativ (-ve) färgning definierades som <5% positivt färgade celler och positiv (+ve) färgning definierades som ≥5% positivt färgade celler.
2.8. Statistisk analys
Programmet SPSS 13.0 (IBM SPSS, Chicago, IL, USA) användes för statistisk analys. Mätdata presenteras som medelvärden ± standardfel för medelvärdet (SEM). Skillnaderna mellan medelvärdena för varje grupp jämfördes med hjälp av envägs variansanalys (ANOVA) eller Kruskal-Wallis-testet, beroende på vad som var lämpligt. anses vara en statistiskt signifikant skillnad.
3. Resultat
3.1. Upprättande av in vitro MKN45 3D-tumörodlingssystemet med hjälp av Microcarrier-6
Microcarrier-6 är en ny mikrobärare som består av positivt elektrifierbara organiska polymerer med en flerskiktad porös struktur. Porstorleken, den positiva ytladdningstätheten och storleken på mikrobäraren-6 kan justeras genom kemisk syntes. Mikrobärare-6 av typ C, med liten volym, stor porstorlek och många gånger vikning av rymden, används främst för 3D-cellodling och experiment med läkemedelskänslighet (figurerna 2 a och 2 b). Mikrobärare av typ M-6, med stor volym, liten porstorlek och få interna vikningstider, används främst för vävnadsteknisk forskning (figurerna 2 c och 2 d). Mikrobärare av typ C-6 användes i vår studie. Mikrobäraren-6 är en ren organisk förening som inte är känslig för kontaminering, har inga föroreningar, har låg immunogenicitet och metabolism och är mycket biokompatibel, vilket ger en stabil mikromiljö för celltillväxt (figurerna 2(a)-2(d)). Dessutom är mikrobäraren-6 direkt inbäddad i huden på möss, vilket inducerar blodkärlsinväxt (figurerna 2(e) och 2(f)), vilket kan ge tillräcklig blodtillförsel för tumörcellstillväxt. MKN45-cellerna fäste snabbt i 2D-miljön, och cellmorfologin som observerades med mikroskopi efter 24 timmars odling uppvisade en oregelbunden polygonform (figur 1(a)). Mikrobäraren-6 uppvisade en oregelbunden eller lång spindelform och en lös textur (figur 1(b)). Efter 24 timmars samodling av MKN45 och den modifierade mikrobäraren-6, fäste MKN45-cellerna väl vid mikrobäraren och nådde konfluens. Dessutom observerades oregelbundna cellkluster som omgav MKN45-cellerna som fastnat på mikrobäraren-6 (figur 1(c)). MKN45-cell-mikrobärarkomplexen färgades med 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)-lösning, vilket avslöjade ett stort antal MKN45-celler som fastnat på mikrobäraren-6 (figur 1(d)). Mikrobärarnas porösa flerskiktsstruktur kan observeras i svepelektronmikroskop (figur 1(e)). MKN45-cellerna fastnade på mikrobärarna, och de celler som fastnade på ytan bildade cellkluster (figur 1(f)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2. Musens överlevnad och tumörbildning
Ingen signifikant förändring av aptit, päls eller kroppsvikt noterades mellan grupperna under försöket (tabell 1). Möss i 3D-gruppen uppvisade en liten minskning av aktiviteten en vecka efter inokulering. Inga djur dog i någon grupp, och ingen tumörbildning konstaterades i gruppen med tom bärare eller 2D-gruppen under 30-dagarsförsöket. Subkutana massor hos 15 av 20 möss i 3D-gruppen identifierades genom palpation 7-10 dagar efter inokulering, vilket tyder på en tumörbildningsgrad på 75 % (tabell 1). Tumör xenografts växte snabbt och observerades som subkutana massor ungefär 10 dagar efter inokuleringen (figur 3(a), kompletterande figur 3). Tumör xenografts växte till 0,5-1,0 cm3 i storlek från 2 till 3 veckor efter inokulering. Tumör xenograftvävnaderna separerades lätt från de intilliggande vävnaderna och uppvisade relativt regelbundna former, mestadels runda eller ovala, gråvita eller gråröda i färgen och med en riklig perifer blodtillförsel (figurerna 3(b) och 3(c) samt kompletterande figur 3). Det fanns histologiska förändringar på injektionsstället i gruppen med tom bärare, men inga förändringar i 2D-gruppen (figurerna 3(d) och 3(e)). Små subkutana massor observerades med en gul färg i den tomma bärargruppen (figur 3(d)).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Data visas som .
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3. H&E-färgning
Histomorfologi, sett med ljusmikroskopi, visade ett stort antal oordnade och atypiska celler i tumör xenografts från möss i 3D-gruppen (figurerna 4(a)-4(c)). Ett stort antal heterotypiska celler, kvarvarande mikrobärare och rikliga blodkärl observerades, 10 dagar efter inokulering (figur 4(a)). Ett litet antal kvarvarande mikrobärare (figur 4(b)) och ett stort antal nekrotiska lesioner (figur 4(d)) observerades 20 dagar efter inokulering. Mikrobärarna var dock i stort sett eliminerade 30 dagar efter inokuleringen (figur 4(c)). Ett stort antal mikrobärare och ett litet antal inflammatoriska celler observerades i gruppen med tomma bärare, men inga tumörceller hittades (figur 4(e)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.4. Immunohistokemi
Immunohistokemi utfördes på djur som avlivades 20 dagar efter tumör xenograft. Tumör xenograft vävnader visade positiv CA199, CK-7 och CDX-2 färgning (figurerna 4(f)-4(h)), vilket ytterligare bekräftade att de atypiska cellerna var humana tumörceller.
4. Diskussion
Djursmodeller har använts i stor utsträckning för att studera patogenesen och metastatiska mekanismerna för magsäckscancer och spelar en ytterst viktig roll i utvärderingen av terapeutiska läkemedels effektivitet och toxicitet . För närvarande omfattar djurmodeller för magsäckscancer huvudsakligen följande: induktionsmodellen, transplantationsmodellen och den gentekniska modellen . Bland de tre typerna av modeller är transplantationsmodellen lätt att använda och används därför i stor utsträckning. Typen av försöksdjur, xenotransplantat av tumörer samt plats och väg för transplantation har betraktats som faktorer som påverkar framgången för xenotransplantationsmodeller. Möss med defekter i immunfunktionen, t.ex. nakenmöss och möss med svår kombinerad immunbrist (SCID), används ofta för xenograftmodeller . På grund av den jämförelsevis dyra kostnaden, den korta livslängden och bristen på immunsvar mot tumörer hos immunbristmöss valde vi dock immunkompetenta C57BL/6-möss för xenograftmodellen för att undvika bristerna hos immunbristmöss. Det anses allmänt att förekomsten av magsäckscancer inte är relaterad till östrogennivån, och incidensen av magsäckscancer hos män är högre än hos kvinnor. Därför använde vi hanmöss som modeller. I den här studien användes dessutom MKN45-celler från mänsklig magsäckscancer för att etablera in vitro-modellen, främst på grund av cellinjens starka invasiva och metastatiska egenskaper. Dessutom valdes det subkutana området under armhålan och ektopisk transplantation som plats och väg för tumörcellstransplantation, respektive, som ett resultat av den rikliga blodtillförseln och den lösa vävnadsstrukturen i detta område, vilket underlättar tumörtillväxten hos möss .
Som en brygga mellan 2D-cellodlingssystemet och djurmodellen, simulerar 3D-cellodlingssystemet bättre tumörcellstillväxtens mikromiljö och har blivit ett attraktivt ämne i nuvarande forskning . 3D-kultur av cancerceller kommer att bilda tumörorganoider, och xenograftmodeller för mus-tumörer baserade på tumörorganoider har börjat tillämpas för screening av cancerläkemedel . I denna studie användes den nya mikrobäraren-6 och MKN45-celler för samodlingsexperiment för att framgångsrikt etablera en 3D-tillväxtmodell. Vi bäddade in mikrobäraren-6 direkt i musens subkutana vävnad för att låta blodkärl komma in i mikrobärarna, vilket är en särskild fördel som inte uppnås med andra mikrobärare. I studier har man rapporterat om mild immunosuppression av immunkompetenta möss för att uppnå resistens mot mänskliga tumörceller och på så sätt lyckas man etablera en tumörbärande musmodell. Hittills finns det dock inga rapporter om framgångsrik ektopisk transplantation av en mänsklig tumör i normala möss under icke-immunosuppressiva förhållanden. När vi dessutom justerade koncentrationen av MKN45-celler till och omedelbart injicerade 100 μL MKN45-cellsuspension subkutant i varje mus, uppnåddes ingen stabil tumörbildning på grund av det starka immunförsvaret mot de ektopiskt transplanterade mänskliga tumörcellerna. Den mikrobärare-6 som användes i denna studie uppvisade låg immunogenicitet och en lös textur med många porer i mitten, vilket underlättade tumörcellstillväxten. Mikrobäraren-6 fungerade också som en barriär för att hindra immuncellerna från att direkt döda tumörcellerna. Den modifierade mikrobäraren-6 gjorde att blodkärl lätt kunde växa inuti tumören, vilket gav lämpliga förhållanden för snabb tillväxt av tumörceller.
Cellulär immunitet är den viktigaste armén mot tumörtillväxt; de celler som är involverade inkluderar främst T-celler, naturliga mördarceller, makrofager och dendritiska celler . På grund av mikrobäraren-6:s oregelbundna ”labyrint”-liknande struktur kan den fungera som en kortsiktig barriär och i viss utsträckning blockera immuncellernas direkta dödande av tumörceller. Tre timmar före experimentet modifierades mikrobäraren-6 dessutom ytterligare med SDF-1α och VEGF för att påskynda blodkärlsbildningen och tillhandahålla blodtillförsel för snabb tumörtillväxt, vilket överträffade mössens immunförsvarseffekt mot tumörer. Samtidigt fann vi att makrofagerna i mössens perifera blod och mjältevävnader minskade betydligt under det tidiga skedet av den transplanterade tumörbildningen, jämfört med den normala kontrollgruppen (kompletterande figur 1). Antalet benmärgsmakrofager minskade gradvis mellan gruppen med tom bärare, 2D-gruppen och 3D-gruppen, men det fanns ingen statistisk signifikans (kompletterande figur 2A, 2B). Jämfört med den tomma bärargruppen minskade antalet T-lymfocyter i mjälten i 2D-gruppen, men det fanns ingen statistisk signifikans (kompletterande figur 2C). Antalet T-lymfocyter i mjälten i 3D-gruppen var signifikant mindre än i 2D-gruppen (kompletterande figur 2C). Detta tyder på att tumörens tillväxt hämmade immunförsvaret, vilket gjorde att tumören kunde växa snabbt.
Denna studie etablerade en 3D-tillväxtmodell för MKN45-celler och etablerade framgångsrikt en xenograftmodell för mänsklig magsäckscancer i immunkompetenta möss i 3D-gruppen, medan mössen i 2D-gruppen och gruppen med tom bärare inte bildade några tumörer. Denna xenograftmodell kännetecknades av snabb tumörtillväxt, som kunde palperas med handen 7-10 dagar efter inokulering och nådde optimal tillväxt 10-15 dagar efter inokulering; tumörvolymen var 0,5-1,0 cm3 ungefär 20 dagar efter inokulering. Ett stort antal celler med kärnatypi som hade infiltrerat muskel- och fettvävnad upptäcktes genom H&E-färgning. Resterande mikrocarrier-6 omgavs av inflammatoriska celler och bildade granulom med ett stort område med nekros i mitten, vilket sannolikt orsakades av otillräcklig blodtillförsel på grund av den snabba tumörtillväxten. Dessa fenomen stämmer överens med tumörutveckling hos människor. Dessutom var de rikliga kapillärerna huvudsakligen belägna i tumörernas periferi. För närvarande finns det ingen specifik tumörmarkör för magsäckscancer, men CA199, CK-7 och CDX-2 används vanligen som markörer för gastrointestinala tumörer. Vi valde därför dessa tre markörer för märkning och identifiering av mänskliga gastriska cancerceller. Immunohistokemisk färgning av CA199, CK-7 och CDX-2 var positiv, vilket ytterligare bekräftade att de heteromorfa cellerna var mänskliga gastriska cancerceller.
5. Slutsatser
Vi etablerade framgångsrikt en xenograftmodell för mänsklig magsäckscancer i immunkompetenta möss. Denna modell kan återspegla interaktionen mellan kroppens immunsystem och tumörer och har breda tillämpningsmöjligheter i den framtida forskningen om tumörimmunitet samt forskning och utveckling av nya läkemedel .
Datatillgänglighet
Den data som används för att stödja slutsatserna i den här studien är tillgänglig från motsvarande författare på begäran.
Intressekonflikter
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Författarnas bidrag
Yanzhen Bi, Quanyi Wang och Yonghong Yang bidrog i lika stor utsträckning till detta arbete.
Ackord
Denna studie stöddes av bidrag från Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (81170395 och 81570556), Jilinprovinsens naturvetenskapliga stiftelse (20180101137JC och 20180101130JC) och forskningsfond för Lin He’s akademikerarbetsstation för ny medicin och klinisk översättning vid Jining Medical University (JYHL2019FMS21).
Supplementary Materials
Förändringarna av inflammatoriska celler och andra tumörframkallande data. Kompletterande figur 1: Förändringarna av inflammatoriska celler i tumörbärande möss under det tidiga skedet av den transplanterade tumörbildningen. Kompletterande figur 2: Förändringar av inflammatoriska celler i olika grupper under det tidiga skedet av transplanterad tumörbildning. Kompletterande figur 3: Tumörbärande möss och transplanterade tumörvävnader. (Kompletterande material)