Una pantalla genética haploide para la dependencia de la glucosa

Muchas líneas celulares inmortalizadas muestran una flexibilidad nutricional limitada y son altamente dependientes de la glucosa como fuente primaria de carbono. Encontramos que la supervivencia de la línea celular haploide humana Hap1 requiere glucosa en el medio de cultivo. Para identificar los factores implicados en esta «adicción a la glucosa», realizamos un cribado genético haploide15 para aislar mutantes que sobreviven en ausencia total de glucosa. Mutagenizamos al azar 1 × 108 células Hap1 con baja multiplicidad de infección con un vector retroviral de trampa génica16 y cultivamos la población mutagenizada en medio deficiente de glucosa durante 12 días. Después de que la mayoría (>99%) de las células murieran, se recuperaron las células resistentes a la depleción de glucosa y se expandieron en medio rico en nutrientes. Los sitios de inserción de genes de la población resistente se identificaron mediante secuenciación Illumina basada en PCR inversa17. En la población seleccionada, los genes SLC3A2/4F2hc (399 inserciones distintas) y xCT/SLC7A11 (39 inserciones) fueron interrumpidos con alta frecuencia por integración retroviral (Fig. 1a). Sorprendentemente, se sabe que los productos proteicos de estos genes interactúan físicamente, con la subunidad SLC3A2 denominada cadena pesada y la subunidad SLC7A11 denominada cadena ligera, para formar el antiportador de aminoácidos conocido como sistema xc- o antiportador xCT18. El antiportador xCT es un transportador de aminoácidos de la superficie celular que exporta glutamato a cambio de cistina. Este intercambio es importante para la defensa contra las especies reactivas de oxígeno (ROS) celulares, porque la cistina es el dímero oxidado de la cisteína, un precursor crítico para la síntesis de glutatión (GSH), un importante antioxidante19. Para mayor claridad, nos referimos al transportador funcional como «sistema xc-» o el «antiportador xCT», y a la subunidad de la cadena ligera como SLC7A11.

(a) Representación de las inserciones de trampas genéticas encontradas en los genes SLC3A2 y SLC7A11, en células Hap1 que sobreviven a la depleción de glucosa. Los rectángulos negros representan exones y las marcas azules representan eventos de inserción. El número de inserciones de trampas genéticas de las poblaciones no seleccionadas y seleccionadas se analizó mediante la prueba exacta de Fisher de un solo lado para calcular los valores P. (b) Análisis de Western blot de los niveles de SLC3A2 y SLC7A11 en células WT Hap1 (WT), AC6 (clon con trampa genética SLC7A11) y AC24 (clon con trampa genética SLC3A2). (c) Cuantificación de la liberación de glutamato en el medio. Los valores se normalizaron con respecto a WT. Los datos representan las medias±d (n=3); **P<0,01; prueba t de Student no apareada. (d,e) Imágenes representativas (d) y cuantificación (e) de la viabilidad celular a las 24 h de la retirada de la glucosa, con vehículo (DMSO) o 500 μM de sulfasalazina (SASP). Barra de escala, 200 μm. Los datos representan las medias±d (n=3).

Para caracterizar las consecuencias celulares de estas interrupciones genéticas, aislamos clones Hap1 con inserciones de trampas genéticas SLC3A2 y SLC7A11. El mutante SLC3A2, denominado AC24, tiene una inserción de trampa genética en el segundo intrón de SLC3A2 en la orientación esperada para la interrupción del gen y no muestra expresión de SLC3A2. Además, tiene una expresión sustancialmente menor de SLC7A11, lo que se espera porque SLC3A2 debe asociarse con SLC7A11 para formar un complejo estable (Fig. 1b). El mutante de SLC7A11, denominado AC6, tiene una inserción genética en la región no traducida 5′ del primer exón de SLC7A11 y muestra una expresión de SLC7A11 muy reducida a nivel de proteína (Fig. 1b) y de ARNm (Fig. 1 suplementaria). Los niveles de SLC3A2 no se ven afectados en gran medida en AC6, probablemente porque la subunidad SLC3A2 es compartida por varios transportadores de aminoácidos18. Ambos clones muestran una menor liberación de glutamato en el medio (Fig. 1c), confirmando que el sistema xc- está funcionalmente alterado. Es importante destacar que ambos clones muestran una viabilidad muy mejorada en condiciones de deficiencia de glucosa (Fig. 1d,e). Tras 24 horas de privación de glucosa, >70% de las células de ambos clones permanecen viables, mientras que sólo sobrevive el 10% de las células Hap1 parentales. En consonancia con este resultado, el tratamiento de las células Hap1 con sulfasalazina (SASP)20, un inhibidor del sistema xc-, mejoró la viabilidad de las células WT Hap1 tras la retirada de la glucosa (Fig. 1d,e).

El sistema xc- regula la viabilidad celular durante la retirada de la glucosa

Para confirmar de forma independiente los resultados del cribado genético, utilizamos ARNs de horquilla corta (shRNAs) para derribar de forma estable el sistema xc- en las células Hap1 (Fig. 2a). Dado que SLC3A2 tiene funciones pleiotrópicas como cadena pesada común para varios transportadores de aminoácidos18 , centramos nuestros esfuerzos de knockdown en la subunidad SLC7A11. Las células que contenían cualquiera de los dos shRNAs independientes de SLC7A11 liberaban sustancialmente menos glutamato en el medio (Fig. 2b). Mostraron una viabilidad muy mejorada tras la retirada de la glucosa (Fig. 2c). Sin embargo, no hubo ningún cambio en la tasa de proliferación en los medios que contenían glucosa (Fig. 2a suplementaria).

(a) Análisis de Western blot de los niveles de proteína SLC7A11 en células Hap1 knockdown de SLC7A11 y en células HeLa que sobreexpresan SLC7A11. (b) Cuantificación de la liberación de glutamato en el medio. Los datos representan las medias±d (n=4); **P<0,01; prueba t de Student no emparejada; scr, shRNA revuelto. (c,d) Viabilidad celular a las 24 horas de la retirada de la glucosa. Las células Hap1 con SLC7A11 eliminado (c) y las células HeLa con SLC7A11 sobreexpresado (d) se cultivaron en medio deficiente de glucosa con vehículo (DMSO), 500 μM SASP o 4 mM dm-αKG durante 24 h. Los datos representan las medias±d. (n=3); vector: vector vacío.

A la inversa, nos preguntamos si aumentar el nivel del sistema xc- en una línea celular con bajo nivel de SLC7A11 endógeno sensibilizaría a las células a la retirada de la glucosa. En comparación con las células Hap1, las células HeLa expresaron niveles casi indetectables de la subunidad SLC7A11 (Fig. 2a) y mostraron una baja liberación de glutamato en el medio (Fig. 2b). Curiosamente, las células HeLa de control mostraron una alta viabilidad frente a la eliminación de glucosa (Fig. 2d). La sobreexpresión de la subunidad SLC7A11 provocó un gran aumento de la liberación de glutamato (Fig. 2a,b) y aumentó en gran medida la muerte celular durante la eliminación de la glucosa (Fig. 2d). Sin embargo, en medios que contenían glucosa, no hubo ningún cambio en la tasa de proliferación de las células HeLa que sobreexpresaban SLC7A11 en comparación con el control (Fig. 2a suplementaria). Por tanto, la sobreexpresión de SLC7A11 es suficiente para provocar la adicción a la glucosa. Se obtuvieron resultados similares utilizando condiciones de cultivo con poca glucosa (frente a la ausencia de glucosa en los experimentos anteriores) (Fig. suplementaria 2b). Además, ni el knockdown ni la sobreexpresión de SLC7A11 cambiaron significativamente la viabilidad de las células tras el agotamiento de la glutamina (Fig. Suplementaria 2c). En conjunto, estos resultados indican que el nivel de actividad del sistema xc- controla la sensibilidad de las células a la retirada de glucosa.

Los beneficios de la depleción de xCT requieren el metabolismo de la glutamina

Al retirar la glucosa, la glutamina se convierte en la principal fuente de carbono y su metabolismo es crítico para la supervivencia celular6,7,8. Una vez importada, la glutamina intracelular se convierte en glutamato y posteriormente en α-cetoglutarato, un intermediario del ciclo TCA. Por lo tanto, especulamos que las células con una baja actividad del sistema xc- pueden ser más capaces de mantener los niveles de glutamato intracelular y su metabolismo en el ciclo TCA. Para comprobar esta idea, medimos directamente los niveles de glutamato intracelular 1 hora después de la retirada de la glucosa. Las células con SLC7A11 eliminado (Fig. 3a) y los mutantes con trampa genética SLC3A2 o SLC7A11 (Fig. 3a suplementaria) mantuvieron su nivel de glutamato intracelular tras la retirada de la glucosa mucho mejor que las células control. Por el contrario, las células HeLa que sobreexpresan SLC7A11 tenían niveles más bajos de glutamato intracelular que las células de control (Fig. 3b). En consonancia con el conocido papel del sistema xc- para la síntesis de GSH, el knockdown de SLC7A11 redujo el nivel de GSH intracelular en las células Hap1, mientras que las células HeLa que sobreexpresan SLC7A11 mostraron mayores niveles de GSH que las células de control (Fig. 3b suplementaria).

(a,b) Cuantificación del glutamato intracelular en las células Hap1 con depleción de SLC7A11 (a) y en las células HeLa con sobreexpresión de SLC7A11 (b) antes y 1 h después de la eliminación de la glucosa. Los datos representan las medias±d (n=3); **P<0,01; prueba t de Student no apareada. (c) Enzimas e inhibidores implicados en el metabolismo de la glutamina/glutamato. (d,e) Viabilidad de las células Hap1 a las 24 horas de la retirada de la glucosa. Se añadieron los siguientes fármacos según se indica: 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES o 4 mM dm-αKG. Los datos representan las medias±d (n=3). (f) Consumo de oxígeno en condiciones de falta de glucosa. Las células se incubaron durante 3 h en medio deficiente en glucosa (1 mM de glutamina) y se midió el OCR. Los datos representan las medias±d (n=4); *P<0,05. **P<0,01; prueba t de Student no apareada. (g) Patrones de etiquetado isotópico de los intermediarios del TCA. Las células se incubaron durante 8 horas en un medio sin glucosa que contenía U-13C5-glutamina antes de extraer los metabolitos. Los datos representan las medias±d (n=3).

A continuación nos preguntamos si el metabolismo de la glutamina/glutamato es importante para la mayor supervivencia celular de las células deficientes del sistema xc durante la retirada de la glucosa. Probamos tres compuestos, aminooxiacetato (AOA, inhibidor de la aminotransferasa) y galato de epigalocatequina (EGCG, inhibidor de la glutamato deshidrogenasa)21 que inhiben las enzimas implicadas en la conversión de la glutamina en glutamato y luego en α-cetoglutarato (Fig. 3c). Tras el tratamiento con EGCG, las células Hap1 alteradas para SLC7A11 (Fig. 3d; Fig. 3c suplementaria) o SLC3A2 (Fig. 3c suplementaria) ya no muestran una mayor viabilidad bajo la privación de glucosa, lo que sugiere que la glutamato deshidrogenasa (GDH) es fundamental para el efecto. Dado que la GDH convierte el glutamato en α-cetoglutarato, nos preguntamos si el α-cetoglutarato podría revertir el efecto inhibidor de la EGCG. Efectivamente, el efecto inhibidor de la EGCG fue completamente rescatado por la suplementación con dimetil α-cetoglutarato (dm-αKG), una forma de α-cetoglutarato permeable a la célula, (Fig. 3e; Fig. Suplementaria 3d). Además, la suplementación de dm-αKG durante la retirada de glucosa mejoró en gran medida la viabilidad celular en las células Hap1 de tipo salvaje (WT) y de ARNhc de control (Fig. 3e; Fig. 3d suplementaria) y en las células HeLa que sobreexpresan SLC7A11 (Fig. 2d), mientras que la suplementación adicional de glutamina en el medio no mejoró significativamente la viabilidad celular (Fig. 3e suplementaria). Por lo tanto, estos resultados sugieren que la conversión de glutamato en α-cetoglutarato subyace al efecto protector de la disrupción del sistema xc- en condiciones de deficiencia de glucosa. La falta de efecto de BPTES o AOA sugiere que GLS1 no es la glutaminasa principal en las células Hap1, y que la GDH, más que la aminotransferasa, es importante para la conversión de glutamato en α-cetoglutarato.

En ausencia de glucosa, la OXPHOS mitocondrial (como principal fuente de síntesis de ATP) se vuelve esencial para la supervivencia. A través de la anaplerosis, el α-cetoglutarato derivado de la glutamina repone los intermediarios del ciclo TCA, lo que genera sustratos para impulsar la OXPHOS21. Por lo tanto, probamos si los niveles del sistema xc- pueden regular la respiración mitocondrial. En presencia de glucosa, la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de las células Hap1 knockdown de SLC7A11 o de las células HeLa sobreexpresadas es comparable a la de las células de control (Fig. Suplementaria 3f). Sin embargo, las células SLC7A11 knockdown muestran una mayor respiración mitocondrial después de 3 h de agotamiento de la glucosa, mientras que la OCR de las células HeLa que sobreexpresan SLC7A11 es menor que la de las células de control bajo la retirada de la glucosa (Fig. 3f).

Trabajos recientes han descubierto que el α-cetoglutarato generado a partir de la glutamina consumida puede someterse a un metabolismo oxidativo a través del ciclo TCA «directo», en el sentido de las agujas del reloj, o a una carboxilación reductora a través de una reacción TCA «inversa» en el sentido contrario a las agujas del reloj22,23,24. El flujo relativo a través del ciclo de la TCA directo frente al inverso puede determinarse utilizando el etiquetado estable con isótopos 13C (C5) de la glutamina extracelular y midiendo la incorporación de la etiqueta en los intermediarios del ciclo de la TCA22,23,25. Para determinar si la modulación del sistema xc- altera el flujo del ciclo del TCA hacia delante o hacia atrás, se cultivaron células Hap1 con SLC7A11 eliminado o células HeLa sobreexpresadas en ausencia de glucosa y con U-13C5-glutamina (ver Métodos). La exposición a la U-13C5-glutamina extracelular dio lugar a un etiquetado casi completo (M+5) de la glutamina y el glutamato intracelulares (Fig. suplementaria 3g). El glutamato marcado entró en el TCA a través de una reacción anaplerótica a α-cetoglutarato con un marcado M+4 de los intermediarios del TCA succinato, fumarato, malato y citrato (Fig. 3g). La etiqueta M+5 del citrato (producto reductor del TCA) se observó en un grado mucho menor (∼8:1 M+4:M+5 del citrato), lo que indica un bajo flujo inverso del TCA. Es importante destacar que el grado relativo de flujo directo frente al inverso no se vio alterado ni con el knockdown ni con la sobreexpresión de SLC7A11.

xCT regula la dependencia de las células de cáncer de mama de la glucosa

Para ampliar nuestras observaciones sobre el efecto negativo del sistema xc- en el metabolismo de la glutamina y la respiración, analizamos los datos de expresión génica de 947 líneas celulares de cáncer del proyecto Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)26. Para cada tipo de cáncer, clasificamos 15-20 líneas celulares de cáncer como de alta y baja expresión de SLC7A11 y realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes entre estos dos grupos. Encontramos que los genes relacionados con la OXPHOS estaban enriquecidos en los grupos de baja expresión de SLC7A11, especialmente en las líneas celulares de cáncer de pulmón (valor P=0,018) y de mama (valor P=0,039). Además, el análisis de 59 células de cáncer de mama mostró una correlación negativa marcada y selectiva entre la expresión de SLC7A11 y los genes de OXPHOS mitocondrial (Fig. suplementaria 4a,b). Esta observación sugiere que la mayoría de las células de cáncer de mama con baja expresión de SLC7A11 tienen un perfil de expresión consistente con la regulación al alza de la maquinaria OXPHOS, y viceversa.

Elegimos dos líneas celulares de cáncer de mama, Hs578T y SK-BR-3, como representativas de líneas celulares con alta y baja expresión de SLC7A11, respectivamente (Fig. Suplementaria 4a). En consonancia con los datos de expresión del CCLE, las células Hs578T mostraron un alto nivel de expresión de SLC7A11 y una liberación activa de glutamato en el medio, mientras que las células SK-BR-3 mostraron una baja expresión de SLC7A11 y una liberación no detectable de glutamato (Fig. 4a; Fig. Suplementaria 5a). También determinamos el estado metabólico de las células Hs578T y SK-BR-3 midiendo las actividades de OCR y glucólisis (tasa de acidificación extracelular (ECAR)). Las células Hs578T mostraron una menor OCR y una menor relación OCR/ECAR que las SK-BR-3 (Fig. 4b,c), lo que sugiere que las células Hs578T son más dependientes de la glucólisis que las SK-BR-3. La mayoría de las células Hs578T, al igual que las células Hap1, murieron al retirar la glucosa (Fig. 4d), mientras que las células SK-BR-3 fueron resistentes (Fig. 4e). Las células Hs578T con depleción de SLC7A11 mostraron una menor liberación de glutamato en el medio (Fig. 5a) y mantuvieron más eficazmente los niveles de glutamato intracelular bajo la depleción de glucosa (Fig. 5b). Es importante destacar que el knockdown de SLC7A11 mejoró en gran medida la viabilidad de las células Hs578T durante la retirada de la glucosa (Fig. 4d). Sin embargo, las células Hs578T que carecían de SLC7A11 presentaban niveles celulares de ROS más elevados que las células de control, lo que concuerda con su papel en la defensa antioxidante (Fig. suplementaria 5c). Por el contrario, las células que sobreexpresan SLC7A11 tenían niveles de ROS más bajos (Fig. 5c). La supervivencia de las células Hs578T con SLC7A11 eliminado durante la retirada de la glucosa fue abolida por EGCG y BPTES, lo que implica de nuevo que la producción de α-cetoglutarato a partir del glutamato es crítica (Fig. 4d). Como se esperaba, los efectos perjudiciales del tratamiento con EGCG o BPTES fueron totalmente revertidos por la suplementación con dm-αKG (Fig. 4d). El efecto diferencial de BPTES (comparar la Fig. 4d con la Fig. 3d) implica que GLS1 es la glutaminasa primaria en las células Hs578T pero no en las células Hap1.

(a) Niveles de proteína de SLC7A11 en las células Hs578T con depleción de SLC7A11 y en las células SK-BR-3 con sobreexpresión de SLC7A11. (b,c) Estado metabólico en condiciones de glucosa completa. El OCR (b) y la relación OCR/ECAR (c) se midieron en presencia de 10 mM de glucosa+2 mM de glutamina. Los datos representan la media±desviación estándar (n=3). (d,e) Viabilidad celular 24 h después de la retirada de la glucosa. Las células Hs578T con SLC7A11 eliminado (d) y las células SK-BR-3 con SLC7A11 sobreexpresado (e) se cultivaron en medio deficiente de glucosa durante 24 h. Se añadieron los siguientes fármacos según se indica: 500 μM SASP, 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES o 4 mM dm-αKG. Los datos representan las medias±d (n=3).

La sobreexpresión de SLC7A11 en las células SK-BR-3 aumentó la liberación de glutamato (Fig. suplementaria 5a) y redujo concomitantemente la capacidad de mantener el glutamato intracelular en condiciones de deficiencia de glucosa (Fig. suplementaria 5b). La sobreexpresión de SLC7A11 provocó la muerte sustancial de las células SK-BR-3 tras la retirada de la glucosa. La muerte celular fue rescatada por la adición de dm-αKG, lo que sugiere que la sobreexpresión de SLC7A11 conduce a una deficiencia de α-cetoglutarato en condiciones de deficiencia de glucosa (Fig. 4e).

Las células Hs578T con SLC7A11 knockdown fueron capaces de mantener su actividad respiratoria durante períodos prolongados después de la retirada de la glucosa (Supplementary Fig. 5d). Por el contrario, las células SK-BR-3 que sobreexpresan SLC7A11 mostraron una fuerte disminución de la OCR bajo el mismo régimen. En conjunto, estos resultados indican que el sistema xc- en las células de cáncer de mama regula el flujo de glutamato intracelular hacia el ciclo del TCA y aumenta la sensibilidad a la retirada de la glucosa.

Nrf2 opera en la parte superior de SLC7A11

Nrf2 (factor nuclear eritroide 2-like 2, NFE2L2) es un factor de transcripción clave que regula muchos genes citoprotectores implicados en el estrés oxidativo27. Dado que SLC7A11 es un conocido gen diana de Nrf2 (ref. 27), examinamos la correlación de la expresión de Nrf2 y SLC7A11 en las células cancerosas. La expresión de Nrf2 está positivamente correlacionada con la expresión de SLC7A11 en 59 líneas celulares de cáncer de mama (R=0,5688), así como en todas las 947 líneas celulares de cáncer (R=0,4306) en los datos de expresión del CCLE. Además, la expresión del gen objetivo Nrf2 muestra una alta correlación con la expresión de SLC7A11 en las 947 líneas celulares de cáncer. Los coeficientes de correlación (R) entre SLC7A11 y los genes diana de NRF2 son NQO1 (+0,4179), GCLC (+0,3283), GCLM (+0,3944) y TXNRD1 (+0,4321).

Estas correlaciones sugieren que Nrf2 apoya la expresión de SLC7A11 en un subconjunto de células cancerosas. Para comprobar esta idea, eliminamos Nrf2 en las células de cáncer de mama Hs578T y MDA-MB-231, dos células altamente expresivas de SLC7A11. La supresión de Nrf2 causó una marcada disminución de la expresión de SLC7A11 (Fig. 5a,b,e) y redujo la liberación de glutamato (Fig. 5c,f). Es importante destacar que las células con Nrf2 desactivado mostraron una gran mejora de la viabilidad durante la retirada de la glucosa (Fig. 5d, g). Una vez más, este cambio en la viabilidad depende del metabolismo del glutamato, ya que el tratamiento con EGCG abolió el efecto pro-supervivencia de la eliminación de Nrf2 (Fig. 5d). Además, el suplemento de α-cetoglutarato fue suficiente para promover la supervivencia de las células, incluso en presencia de EGCG.

(a) Western blot de los niveles de proteína SLC7A11 en las células Nrf2 y SLC7A11 knockdown Hs578T. (b) Análisis por RT-PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de Nrf2 y SLC7A11 en células MDA-MB-231 con Nrf2 y SLC7A11 eliminado. Las mediciones se normalizaron con respecto a los niveles de ARNr 18 s. Los datos representan las medias±d (n=3); **P<0,01, prueba t de Student no apareada. (c,d) Análisis de las células Hs578T eliminadas de Nrf2 y SLC7A11. (c) Liberación de glutamato en el medio. Los datos representan las medias±d (n=3); **P<0,01; prueba t de Student no apareada. (d) Viabilidad celular 24 h después de la retirada de la glucosa. Se añadieron EGCG (50 μM) y dm-αKG (4 mM) según lo indicado. Los datos representan la media±desviación estándar (n=4). (e-g) Las células MDA-MB-231 se trataron con un vehículo (DMSO) o con 15 μM de DMF durante 24 horas en un medio rico en glucosa. Las manipulaciones adicionales incluyeron la eliminación de SLC7A11 o Nrf2, y la sobreexpresión de SLC7A11. (e) Western blot de los niveles de SLC7A11 tras el tratamiento con DMF. (f) Liberación de glutamato en el medio. Tras el pretratamiento con DMF, las células se incubaron en medio fresco deficiente en glucosa sin DMF, y se midió el glutamato liberado en el medio a las 2 h. Los datos representan las medias±d (n=4). (g) Viabilidad celular 24 h después de la eliminación de la glucosa. Tras el pretratamiento con DMF, las células se incubaron en un medio fresco deficiente en glucosa sin DMF durante 24 horas adicionales antes de medir la viabilidad celular. Los datos representan las medias±d (n=4); NT, sin tratamiento.

Para examinar el efecto de la regulación de Nrf2, tratamos las células con dimetil fumarato (DMF), un activador de Nrf2 permeable a las células28. El tratamiento con DMF hizo que las células MDA-MB-231 indujeran altamente la expresión de SLC7A11 y la liberación de glutamato (Fig. 5e,f). Además, las células pretratadas con DMF mostraron una viabilidad sustancialmente reducida durante el agotamiento de la glucosa en comparación con las células de control (Fig. 5g). Descartamos los efectos fuera del objetivo mostrando que estos resultados del tratamiento con DMF dependían tanto de SLC7A11 como de Nrf2 (Fig. 5f,g). En conjunto, estos resultados indican que el eje Nrf2-SLC7A11 regula el metabolismo del glutamato, la dependencia de las células cancerosas de la glucosa y su capacidad para utilizar la glutamina como fuente alternativa de carbono. Lo que es más importante, sugiere que la adaptación al estrés oxidativo en las células cancerosas puede comprometer la flexibilidad de los nutrientes, particularmente a través de la potenciación de un fenotipo de adicción a la glucosa.

La xCT regula la función mitocondrial en las células mutantes de ADNmt

Nuestros hallazgos anteriores indican que las células con una regulación al alza del sistema xc- debido al estrés oxidativo pueden tener una flexibilidad restringida de los nutrientes debido a la alteración del metabolismo de la glutamina. La inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial puede aumentar las especies reactivas de oxígeno29,30. Encontramos que la expresión de SLC7A11 fue inducida por fármacos que bloquean la función mitocondrial, especialmente la rotenona y la oligomicina, que inhiben el complejo I (NADH deshidrogenasa) y V (ATP sintasa) de la maquinaria OXPHOS, respectivamente (Fig. suplementaria 6a). En consonancia con estos resultados farmacológicos, el SLC7A11 fue regulado al alza en células híbridas que contenían mutaciones homoplásmicas del ADNmt en la subunidad ND1 del complejo I o en la subunidad ATP6 del complejo V (NARP) (Fig. 6a)30,31. La inducción de SLC7A11 fue particularmente marcada en la línea celular NARP, de la que se ha informado que tiene altos niveles de ROS e inducción de la enzima mitocondrial MnSOD30. La inducción de SLC7A11 en las células híbridas NARP era altamente dependiente de los factores de transcripción Nrf2 y Atf4 (Fig. 6b suplementaria) y podía ser suprimida por el tratamiento con el antioxidante N-acetilcisteína (Fig. 6c suplementaria).

(a) Western blot de los niveles de SLC7A11 en células 143B e isogénicas ND1 y NARP con mutaciones de ADNmt. (b-e) Análisis de las células ND1 y NARP con SLC7A11 eliminadas o tratadas con erastina (5 μM) cultivadas en presencia de 10 mM de galactosa y 2 mM de glutamina. (b) Cuantificación del glutamato intracelular a las 24 h del cultivo con galactosa. Los datos representan las medias±d (n=4); ** P<0,01; prueba t de Student no apareada. (c) Viabilidad celular en medio de galactosa durante 3 días. Los datos representan las medias±d (n=4). (d) Imágenes representativas y cuantificación de la morfología mitocondrial a las 24 horas del cultivo en galactosa. Los datos representan las medias±desviación estándar (n=3). Barra de escala, 10 μm. (e) Se determinó el consumo de oxígeno a las 24 h del cultivo de galactosa. Los datos representan las medias±d (n=5); **P<0,01; prueba t de Student no apareada. (f) Modelo para los efectos duales del antiportador xCT. El antiportador xCT desvía el metabolismo de la glutamina del ciclo TCA hacia la síntesis de GSH, que es importante para la función antioxidante. En determinadas condiciones celulares, el desvío excesivo de glutamina del ciclo TCA es perjudicial (panel central) y, por tanto, la inhibición del antiportador mejora la supervivencia (panel derecho).

Investigamos si estos cambios compensatorios en la expresión del sistema xc- afectan al metabolismo celular en las células cíbridas. En consonancia con su mayor expresión de SLC7A11, los cíbridos ND1 y NARP tenían menores niveles de glutamato intracelular (Fig. 6b). La inhibición del sistema xc- mediante el knockdown de SLC7A11 o un potente inhibidor, la erastina, aumentó el glutamato intracelular en las células ND1 y NARP. Del mismo modo, el α-cetoglutarato intracelular, un producto del metabolismo del glutamato, también aumentó por la inhibición de SLC7A11 (Fig. 6d suplementaria). Se sabe desde hace tiempo que las células con defectos en la OXPHOS sobreviven mal en medios que contienen galactosa, lo que obliga a una mayor demanda de OXPHOS como fuente de generación de ATP32. Los cíbridos ND1 y NARP-mutantes, a diferencia de las células isogénicas WT 143B, no fueron capaces de sobrevivir en un medio que contuviera galactosa (Fig. 6c; Fig. 6e suplementaria). Sin embargo, el knockdown de SLC7A11 o el tratamiento con erastina rescataron fuertemente la viabilidad de los cíbridos ND1 y NARP en medio con galactosa. El efecto fue más marcado en los cíbridos NARP, que mostraron una inducción mucho mayor de SLC7A11 (Fig. 6c).

Este aumento de la viabilidad celular se correlacionó con una sorprendente normalización de la morfología mitocondrial. Nuestro grupo informó previamente de que las células WT alargan sus mitocondrias en condiciones de medio que requieren una mayor actividad de OXPHOS, mientras que las células con mutaciones de ADNmt en cambio fragmentan sus mitocondrias33. En consonancia con este resultado, los cíbridos ND1 y NARP mostraron una marcada fragmentación mitocondrial tras 24 h de cultivo de galactosa. Por el contrario, los cíbridos con SLC7A11 eliminado o tratados con erastina mostraron una elongación sustancial de las mitocondrias cuando la fuente de carbono en el medio se cambió de glucosa a galactosa (Fig. 6d; Fig. Suplementaria 6f). El knockdown de SLC7A11 no cambió los niveles de varias proteínas de la dinámica mitocondrial, incluyendo Opa1, Mfn1 y Drp1 (Supplementary Fig. 6g). Además, las células con SLC7A11 eliminado mostraron una mayor actividad respiratoria que las células mutantes de control (Fig. 6e). En conjunto, estos resultados sugieren que la inhibición del sistema xc- en los cíbridos mutantes de ADNmt mejora la morfología mitocondrial y la respiración, dando lugar a una supervivencia notablemente mejorada en medio de galactosa.