WOX är lokaliserad på kromosom 16:s långa arm, på en känd bräcklig plats. Det består av nio exoner och är >1 Mb stort.1 Det kanoniska transkriptet (ENST00000566780.5, NM_016373.3) kodar för ett allestädes närvarande protein med 414 aminosyror (aa) som uttrycks i hög grad i prostata, gonader, bröst, lunga, endokrina vävnader och hjärna.21,22 Alternativ splicing av WWOX under bearbetning av pre-mRNA (pre-mRNA) genererar åtta transkript som endast har observerats i cancer; huruvida varje avvikande WWOX mRNA översätts till protein är okänt.23 Det WW-domäninnehållande oxidoreduktaset är det enda protein som kopplar ihop två distinkta domäner med höga homologier med både WW-domänfamiljen och SRD-superfamiljen. WWOX har två WW-domäner vid aminoterminen, ett NLS-motiv (nuclear localization signal) och en C-terminal SDR-domän (short-chain dehydrogenase reductase) (fig. 1b). Ett mitokondriellt målsekvensmotiv (MTS) har också kartlagts inom SDR-domänen mellan aa 209 och aa 273 (ref. 24). WWOX innehåller också både en bindningsplats för koenzym, NAD(H) eller NADP(h) (GANSGIG, aa 131-137) och en potentiell bindningsplats för substrat (YNRSK, aa 293-297) (ref. 1). Den C-terminala domänen av WWOX (aa 125-414) liknar en MAPT-interaktionsregion (http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZC7).

WWOX germline patogena varianter som identifierats hos patienter med konstitutionella WWOX-relaterade störningar (SCAR12, WOREE-syndromet och DSD). a Kopieringsnummervariationer (n = 12). DSD könsutvecklingsstörning, IF in frame, OOF out of frame, WOREE WWOX-relaterad epileptisk encefalopati. b Variationer i enskilda nukleotider (n = 23). MTS mitokondriell målsekvens, NLS nukleär lokaliseringssignal, SRD kortkedjedehydrogenasreduktas.

WWOX är tolerant mot missense-variationer med en missense-bindningsmetrik Z = -3,19 (Exome Aggregation Consortium).20 Många heterozygota CNV:er som påverkar hela eller delar av denna gen observeras i friska kontrollprov (Database of Genomic Variants).25 Det höga antalet patogena/förmodligen patogena variationer i offentliga databaser är inte förvånande med tanke på ett autosomalt recessivt arvsätt för WWOX-relaterad encefalopati.

WOX uttrycks i musens nervsystem under utveckling, inklusive hjärnbarken och lillhjärnan, från in utero stadier till vuxen ålder.26 Djurmodeller visade epilepsi och ataxi som orsakades av förlust av WWOX,3,27 vilket tyder på en neurodegenerativ process. I en detaljerad genomgång av litteraturen visade Aldaz och medarbetare tydligt att WWOX befinner sig i korsningen mellan cancer, metaboliskt syndrom och encefalopati.28

Kliniska och molekylära data för alla patienter från litteraturen med antingen SCAR12- eller WOREE-fenotyper beskrivs i tilläggstabell 3 (ref. 3,4,5,6,6,7,8,29,30). Ytterligare två patienter, systrar från en konsanguin arabisk familj med en homozygot variant av WWOX (c.1228G>T; p.Gly410Cys), rapporterades också av Alkhateeb et al. 2016 (ref. 9), men det råder tvivel om patogeniteten hos den variant som identifierats i dessa fall. Båda presenterades med försenat tal och en hade epilepsi från 2 års ålder. Den kliniska presentationen i denna familj är mycket mild jämfört med det WOREE-syndrom som observerats hos patienter med bialleliska germlinepatogena varianter i WWOX. Denna förändring från glycin till cystein i position 410 påverkar en aminosyra i slutet av proteinets karboxylterminalsida. Dessutom förekommer denna aminosyraförändring i homozygot form hos två individer i gnomAD-databasen. Även om in silico-prediktioner talar för att denna missense-patogena variant är patogen (möjligen skadlig genom PolyPhen-2), är dess kausala roll tveksam i denna familj. Vi har därför beslutat att utesluta dessa patienter från vår litteraturgenomgång.

Vi rapporterar här om den största kohorten av individer med en WOREE-fenotyp som består av ytterligare 20 patienter med bialleliska patogena varianter i WWOX som ärvts från friska föräldrar (kompletterande tabell 1). Molekylära diagnoser erhölls genom en kombination av olika tekniker (array-CGH, qPCR/MLPA, riktad Sanger-sekvensering, ES och WGS). Genom att sammanföra våra patienter med alla fall som hittills rapporterats i litteraturen är 37 patienter från 27 familjer med ett WOREE-syndrom och bialleliska WWOX-patogena varianter kända. Sammanlagt har 29 olika patogena/sannolikt patogena alleler (10 CNVs och 19 SNVs) identifierats (fig. 1a, b). Intron 5 och 8 i WWOX-genen är mycket stora med en storlek på 220 respektive 780 Kb. De täcker 90 % av den genomiska WWOX-sekvensen och innehåller translokationsbrottpunkter för multipelt myelom,28 i enlighet med det faktum att stora introniska regioner ofta är rekombinogena och benägna till kromosomala brottpunkter. Följaktligen är duplikation (en allel) och deletion (fem alleler) som omfattar exon 6-8 de mest frekventa patogena CNV som observerats hos patienter med WWOX-relaterade sjukdomar (tilläggstabellerna 1 och 3). Alla patienter från familjer med blodsband (10/27; 37 %) visade sig vara homozygota för samma deleterösa allel, en vanlig förekomst vid autosomalt recessiva sjukdomar med låg prevalens. Den höga andelen familjer med en genotyp som omfattar en eller två patogena CNVs (14/27; 52 %) belyser behovet av ett kvantitativt tillvägagångssätt för screening av WWOX-locus hos patienter med allvarliga sjukdomar i centrala nervsystemet. Hos patienter som är heterozygota för en CNV som påverkar flera exoner är det viktigt att söka efter (1) en möjlig sammansatt heterozygot genotyp för två små CNV:er och behovet av en andra kvantitativ analys genom MLPA eller qPCR hos båda föräldrarna och (2) en SNV på den andra allelen genom riktad Sanger-sekvensering. På samma sätt är sökandet efter CNV:er väsentligt i denna stora gen som är benägen för deletioner och duplikationer och som involverar hela eller delar av de kodande sekvenserna när ES- eller riktad genpanelsekvensering utförs som en förstahandsutredning.

I den här studien rapporterar vi åtta nya patogena missense-varianter (kompletterande tabell 2). Bland resultaten från exom- och riktade genpaneler med höggenomsekvensering är WWOX missense-varianter talrika. Deras patogenicitet är svår att fastställa eftersom WWOX har många funktioner och proteinpartners. Vi följde American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) riktlinjer31 för tolkning och annotering av missense-varianter i WWOX-data för att klassificera dem som patogena, sannolikt patogena, varianter av okänd betydelse (VUS), sannolikt godartade eller godartade. För att underlätta vår tolkningsprocess av varianter använde vi ett öppet tillgängligt online-verktyg (http://www.medschool.umaryland.edu/Genetic_Variant_Interpretation_Tool1.html/) för att effektivt klassificera varianter utifrån de beviskategorier som anges i ACMG-riktlinjerna.31 Fyra aa-förändringar (p., p., p., p., p., p.) är i trans förknippade med nollvarianter i en gen där förlust av funktion är en känd sjukdomsmekanism. Alla missense-varianter som identifierats hos individer med WWOX-relaterad encefalopati (11 aa-förändringar i 12 familjer, kompletterande tabell 2) förutspås vara sjukdomsorsakande genom en kombination av webbaserade programvaror. Ännu viktigare är att ingen av dem förekommer i homozygot tillstånd i gnomAD.20 Alla missense-varianter klassificeras som patogena eller sannolikt patogena enligt ACMG:s rekommendationer. En patient (P19) är bärare av tre olika missense-patogena varianter: p.; (kompletterande tabell 1). P.(Lys200Glu) och p.(Thr358Ile) är belägna i cis; båda aminosyraförändringarna förutsägs vara sannolikt patogena även om threoninet i position 358 inte är beläget i en känd funktionell domän. Det är inte möjligt att avgöra om en eller båda dessa varianter är den sjukdomsorsakande missensevarianten i P19. I de flesta fall som rapporterats här och som publicerats i den medicinska litteraturen beskrivs WWOX-sekvensvariationer på grundläggande DNA-nivå. Alla sjukdomsframkallande missense-varianter utom en (P3; s.) tolkas utifrån in silico-studier utan experimentella bevis (ingen analyserad RNA- eller proteinsekvens). I P3 misslyckades total RNA-analys genom Sanger-sekvensering av produkter från omvänd transkription av PCR (RT-PCR) med att påvisa någon splicing-anomali i leukocyter. RNA-studier utfördes inte för övriga patienter eftersom lämpliga blodprover inte fanns tillgängliga vid tidpunkten för den molekylära diagnosen. Exoniska SNV:er skulle kunna påverka fysiologiska acceptor/donor-splejsningsställen, men även exoniska splicing enhancer (ESE) och exoniska splicing silencer (ESS). Dessutom är aktivering av kryptiska skarvplatser genom SNV:er en välförstådd patologisk mekanism i många genetiska sjukdomar; ett bra exempel på detta är Hutchinson-Gilfordprogeriasyndromet.32 Missensevarianter kan också påverka mRNA-stabiliteten.33 Upp till 10 % av kända sjukdomsassocierade missensevarianter, men endast 3 % av vanliga SNP:er, förändrar pre-mRNA-splicing.33 Det är troligt att en bråkdel av de förutspådda missensevarianter som identifierats hos patienter med WWOX-relaterad encefalopati resulterar i uttryckssvårigheter på grund av onormal splicing. Detta är desto mer troligt för en gen med patogena förlust av funktionsalleler. När det gäller patogena missense-varianter i SRD-domänen gör avsaknaden av identifierade substrat det svårt att utvärdera deras inverkan på WWOX:s katalytiska aktivitet. Karakterisering av knock-in djurmodeller som zebrafisk skulle ge ledtrådar om patogeniciteten hos WWOX missense-varianter.

I en patient som inte ingick i den här studien misstänktes ursprungligen en molekylär diagnos av WWOX-relaterad encefalopati inför en biallelisk genotyp som bestod av två SNV:er i trans: en nonsensvariant (ENST00000566780.5:p.Gln72*) och en missense-variant (ENST00000402655:c.600T>A, p.Ser200Arg). aa-förändringen på position 200 påverkar endast ett icke-RefSeq WWOX-protein på 311 rester. Hittills har alla patogena aa-förändringar beskrivits enligt det kanoniska WWOX-proteinet (414 aa), som är resultatet av översättningen av ett 9-exon-transkript (ENST00000566780.5, isoform 1). Det är okänt om den WWOX-proteinisoform som består av 311 rester är relevant för WWOX-relaterade sjukdomar. Dessutom var fenotypen hos den här patienten mild jämfört med WOREE-syndromet. Av dessa skäl beslutade vi att inte betrakta denna genotyp som orsakande för encefalopatin hos denna patient.

WWOX, cancer och lungsjukdom?

WOX är en tumörsuppressorgen som är involverad i moduleringen av cancerrelaterade vägar via protein-proteininteraktioner mellan WW-domänerna och olika onkogena proteiner. Förlust av WWOX-protein har hittats i flera neoplasier.23 Osteosarkomer och lungkarcinom observeras hos Wwox-/-möss22 och tumörigenes är en av konsekvenserna av en hypomorf genotyp av Wwox.34 En funktionell förlust av kopia CNV (67048) i WWOX var signifikant förknippad med en ökad cancerrisk i kinesiska populationer.35,36,37 Nyligen visade sig förlust av WWOX-uttryck i mössens lungor orsaka neutrofil inflammation.38 Överraskande nog rapporterades aldrig någon ökning av antalet cancerfall hos vare sig patienter med bialleliska WWOX germline-patogena varianter eller hos deras heterozygota föräldrar. WOREE-syndromets svårighetsgrad med en hög frekvens av för tidig död under de första levnadsåren skulle kunna förklara frånvaron av cancer. Detta är inte en övertygande förklaring för patienter som är heterozygota för en WWOX-nollallel. Ablation av Wwox är inte tumörframkallande i alla knockout-djursmodeller; denna förmodade tumörsuppressorgen är troligen mer relevant för tumörprogression än för initiering under onkogenes. Denna studie bekräftar att germina WWOX-förändringar inte är drivande patogena varianter som är viktiga för initiering och/eller progression av cancer.

WWOX och DSD

WWOX uttrycks i hög grad i hormonellt reglerade vävnader, t.ex. hypofysen, testiklarna och äggstockarna, och antas spela en roll i biosyntesen av gonadotropiner eller könsteroider.1,39 Den enzymatiska SRD-domänen i WWOX antas ha en roll i steroidmetabolismen med ännu oidentifierade substrat. Dessa observationer och beskrivningen av två olika WWOX knockout-musmodeller med gonadavvikelser34,39 stöder tydligt en roll för WWOX i gonadutvecklingen.

Den första germina rearrangemanget av WWOX hos människor var förknippat med en 46, XY DSD.2 Patienten hade bilateral odifferentierad gonadvävnad och omogna testiklar. Han var heterozygot för en deletion av exon 6 till 8 som ärvdes från hans mor som hade en personlig historia av sen menarche. Denna CNV förutspås resultera i en inframe-deletion, vilket orsakar en förkortad produkt där SRD-domänen till stor del saknas. Nyligen identifierades tre heterozygota VUS i WWOX-genen genom ES hos patienter med DSD (fig. 1) (ref. 40). Såvitt vi vet har DSD inte rapporterats hos heterozygota föräldrar till patienter med WOREE-syndrom och vi anser att det är tveksamt om heterozygota SNVs/CNVs är inblandade i den molekylära etiologin för DSD. Testikelatrofi, minskad fertilitet, gonadala abnormiteter, dysfunktion i Leydigcellerna och försämrad bröstutveckling är en del av de fenotyper som observerats i flera djurmodeller av WWOX-ablation.28 Såvitt vi vet har DSD inte rapporterats i heterozygota knockout-djurmodeller. En möjlighet kvarstår dock att en mildare fenotyp skulle kunna identifieras efter noggrann utvärdering av könsutveckling och gonadfunktion hos patienter som är heterozygota för en WWOX-patogen variant.

SCAR12-fenotyp

2014 identifierades homozygota missense-patogena varianter i WWOX med hjälp av ES hos sex patienter från två konsanguina familjer med autosomalt recessiv spino-cerebellär ataxi (SCAR12). Hittills har detta samband inte bekräftats i ytterligare familjer. De drabbade patienterna uppvisade cerebellär ataxi i barndomen, generaliserad tonisk-klonisk epilepsi, intellektuell funktionsnedsättning och framträdande spasticitet.3 Jämfört med patienter med WOREE-syndromet har patienter med SCAR12-fenotypen en mindre allvarlig utvecklingsfördröjning: alla kunde gå (4/4; 100 %), 3 av 4 kunde tala och ingen för tidig död rapporterades. När det utfördes visade hjärn-MRI mild cerebellär hypoplasi (2/2; 100 %) hos de drabbade patienterna, en egenskap som inte observerades i vår kohort. Även om epilepsi var ett konstant kännetecken hos SCAR12-patienterna reagerade anfallen oftare på antiepileptiska läkemedel (2/4; 50 %). Ögoninblandning förekom också med nystagmus som rapporterades hos fyra patienter. Denna form av WWOX-relaterad autosomalt recessiv cerebellär ataxi verkar vara ett sällsynt genetiskt tillstånd. Svårighetsgraden av WOREE-fenotypen och den förtida döden hos en del av patienterna kan dölja balansproblem relaterade till cerebellär dysfunktion. Ytterligare fall av WWOX-relaterad cerebellär ataxi behövs för att bekräfta dess inblandning i denna neurologiska sjukdom.

WOREE-fenotyp

Snart efter beskrivningen av SCAR12-fenotypen involverades WWOX i en recessiv form av infantila epileptisk encefalopati hos 17 patienter från 9 familjer.4,5,6,7,8,9,30 Vi har mer än fördubblat antalet fall med 20 drabbade patienter i ytterligare 18 familjer. Fenotypen hos våra patienter överensstämmer med tidigare rapporter. Vi observerade en lägre grad av konsanguinitet i vår kohort i enlighet med den högre andelen sammansatta heterozygota genotyper som beskrivs i denna studie. Dessa genotyper kan tidigare ha missats när array-CGH eller höggenomsnittssekvensering utfördes oberoende av varandra. Genomförandet av CNV-prediktion från exomsekvensdata underlättar identifieringen av patienter med WWOX-genotyper som består av både SNV och CNV.

Ett foster med hjärnanomalier och möjliga intrauterina kramper rapporterades 2015 (ref. 7). Minskade fosterrörelser rapporterades ibland i vår serie (3/20) medan ökad nacktransparens var det vanligaste tecknet under graviditeten i tidigare rapporter (4/17). Hand- och fotkontrakturer rapporterades hos 5 patienter i vår kohort och hos 3 patienter från litteraturen4,5,6 under den prenatala eller neonatala perioden. Minskade fosterrörelser, ökad naken genomskinlighet och hand- eller fotanomalier kan vara antenatala tecken på sjukdomen men är varken specifika eller frekventa kliniska kännetecken.

I motsats till litteraturen var tillväxthämning (6 %) och mikrocefali (20 %) inte framträdande kännetecken hos våra patienter som presenterade sig med normal låg medelhöjd (-1,1 SD) och genomsnittlig OFC (-1,4 SD). Dysmorfism rapporterades hos mer än hälften av patienterna. De mest slående dragen var ett runt ansikte med fylliga kinder, en kort hals och ett hypotont ansiktsutseende (fig. 2). Hos patienterna P15 och P16, vid senare ålder, var ansiktshypotonin fortfarande närvarande men ansiktet blev mer triangulärt. Ytterligare medicinska problem var skolios eller kyfos med tidig debut (65 %), vilket kan vara vägledande för diagnosen, liksom matningsproblem som krävde sond hos 70 % av patienterna och andningsproblem (40 %), vilket ses i andra infantila encefalopatier.

Alla patienter hade allvarlig utvecklingsförsening. Ingen av dem kunde sitta, tala eller gå. Neurologisk undersökning visade axial hypotoni och distal hypertoni hos de flesta av patienterna. Dystona rörelser observerades ibland. Som rapporterats i litteraturen hade alla patienter tidig epilepsi (100 %) med dagliga anfall och läkemedelsresistens observerades i de flesta av fallen (95 %). Det fanns ingen större känslighet för feberkramper. Wests syndrom som kännetecknas av spasmer och hypsarytmi registrerad på EEG rapporterades hos 26 % av patienterna. Fokala, generaliserade och kombinerade anfall sågs. Toniska, kloniska, tonisk-kloniska och myokloniska anfall samt infantila spasmer och frånvaro beskrevs. Epilepsin var således mycket allvarlig, med tidig debut och med varierande anfallsfrekvenser. Som tidigare beskrivits verkar synnedsättning vara en del av det kliniska spektrumet av WOREE-syndromet. De flesta av de drabbade patienterna hade ingen ögonkontakt (75 %). Ungefär hälften av dem uppvisade förändrad fundus oculi (47 %) och/eller elektrodiagnostiska tester (45 %) som tyder på optisk atrofi och/eller retinal dystrofi. Tidig oftalmologisk undersökning kan därför ge diagnostiska ledtrådar hos patienter med tidiga anfall och utvecklingsförsening. MRT av hjärnan (fig. 3) var onormal hos 80 % av patienterna och visade främst hypoplasi av corpus callosum (75 %) och cerebral atrofi (55 %). Vi bekräftade i vår kohort att för tidig död är ett kännetecken för WOREE-syndromet som inträffade hos åtta patienter (40 %) med en medelålder vid dödsfallet på 40 månader. Svårighetsgraden av epilepsi och neurologisk funktionsnedsättning kan vara kopplad till tidig död hos drabbade patienter.

Magnetresonansbild av hjärnan (MRT) hos individer med WWOX-relaterad epileptisk encefalopati (WOREE) syndrom. a-j Hypoplastisk corpus callosum på sagittalplan. k-q Cerebral atrofi och förstorade subarachnoidala utrymmen på axialplan (P4, P6, P14) och koronalplan (P3, P7, P17). r-t Symmetrisk vit substans hypersignal på axial T2. u-v Plagiocefali och asymmetrisk lateral ventrikel på axiella T2-plan. w P19 sagittal T1 cirkulära lesioner (hyposignal) i den mediala delen av corpus callosum. m månad, P patient, y år gammal.

De viktigaste kliniska tecknen hos tidigare publicerade patienter med WOREE sammanfattas i kompletterande tabell 4. Från denna genomgång kan vi dra slutsatsen att WOREE är en mycket allvarlig epileptisk encefalopati som kännetecknas av dålig spontan rörlighet, avsaknad av språkutveckling och förvärv av gångförmåga, tidigt insättande av läkemedelsresistenta anfall, oftalmologisk involvering och stor sannolikhet för för tidig död. Dysmorfiska drag (runt hypotont ansikte, fulla kinder och kort hals) och ryggradsdeformitet kan vara tidiga associerade tecken som kan stödja diagnosen.

Fenotyp/genotypkorrelationer

Fenotyp/genotypkorrelationer föreslogs nyligen för WWOX-relaterade neuroutvecklingsstörningar5,7 med en indelning av WWOX-genotyper i tre grupper. Enligt den tentativa klassificeringen var det mer sannolikt att patienter som bär på två förutspådda nollalleler skulle uppvisa den allvarligaste WOREE-fenotypen, medan hypomorfa genotyper med två missense-varianter i stället skulle resultera i spinocerebellär ataxi (SCAR12). Fenotypen hos patienter som bär på en nollallel och en missensepatogen variant skulle vara intermediär.5 Vår stora studie ger en omvärdering av dessa preliminära korrelationer.

Den allvarligaste kliniska presentationen tycks vara förknippad med genotyper som består av tidiga förtida stoppkodoner som motsvarar fullständig knockdown av WWOX. Dessa genotyper observeras hos sju patienter: homozygot deletion av exon 1 till 4 i P10, homozygota stoppkodoner p.(Arg54*) och p.(Trp44*),4,30 homozygot deletion av de första sex exonerna.7 Förtida död före 2 år inträffade i 5/7 fall och hjärnanomalier upptäcktes prenatalt i en familj. Dessutom har för tidig död aldrig beskrivits hos patienter med missense patogen variant-only genotyp (kompletterande tabeller 1 och 3). Den exakta karakteriseringen av missensevarianter och CNVs på proteinnivå med funktionella studier kan ge vissa ledtrådar om hur genotyper kan förklara olika kliniska presentationer, särskilt när det gäller SCAR12/WOREE-fenotyper.

Slutsatsen är att germina patogena varianter i WWOX är tydligt förknippade med en allvarlig epileptisk encefalopati med tidig debut som kallas för WOREE-syndromet, och vi rapporterar här om den största kohorten av individer med denna neurologiska störning. Implikationen av konstitutionella WWOX-varianter i DSD och SCA behöver fortfarande replikeringsstudier.