3.06.4.1.1 Saccharomyces-Hefe

Frühe Studien hatten gezeigt, dass die Saccharomyces-Hefe Xylulose zu Ethanol vergären kann, wenn auch nicht effizient. Theoretisch fehlt der Saccharomyces-Hefe also nur das Enzym bzw. die Enzyme zur Umwandlung von Xylose in Xylulose. Wie oben beschrieben, wandeln Bakterien Xylose mit einem einzigen Enzym in Xylulose um, das keine Kofaktoren benötigt (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu benötigt das Xylose-Xylulose-System der Hefe zwei Enzyme, die, wie oben beschrieben, metabolisch nicht ideal sind. Zunächst versuchten fast 10 verschiedene Labors weltweit, ein bakterielles Xylose-Isomerase-Gen in Hefe zu klonen. Ho et al. an der Purdue University waren die erste Gruppe, der es gelang, das Xylose-Isomerase-Gen aus Escherichia coli zu klonen. Das in Hefe durch das klonierte bakterielle Gen synthetisierte Protein hatte jedoch keine Xylose-Isomerase-Aktivität.

Ein zweiter Ansatz bestand darin, die XR- und XD-Gene aus P. stipitis in die Saccharomyces-Hefe zu klonieren. Die Kinetik dieser Enzyme und das thermodynamische Gleichgewicht der Reaktion begünstigen jedoch die Produktion von Xylitol anstelle von Ethanol. Anfang der 90er Jahre berichteten drei Gruppen (Kotter, Ciriacy und Kollegen an der Universität Düsseldorf, Tantirungkij und Kollegen an der Universität Osaka sowie Hahn-Hägerdal und Kollegen an der Universität Lund) über die erfolgreiche Klonierung der XR- und XD-Gene in die Saccharomyces-Hefe, um diese zur Fermentierung von Xylose zu befähigen. Die rekombinante Hefe, die von diesen Gruppen entwickelt wurde, vergärte Xylose jedoch extrem langsam und produzierte nur wenig Ethanol; das wichtigste Stoffwechselprodukt war Xylitol.

Die Ho-Gruppe stellte die Hypothese auf, dass eine Überexpression der nativen Xylulokinase (XK) zusammen mit XR und XD aus P. stipitis den Fluss von Xylose durch den Stoffwechsel zu Ethanol verbessern würde, indem die intrazelluläre Konzentration von Xylulose gesenkt wird. Da Xylulokinase eine irreversible Reaktion zur Ethanolproduktion katalysiert (Abbildung 3), führt eine hohe Xylulokinase-Aktivität zu niedrigen Xylulose-Konzentrationen. Dies ist wünschenswert, da das Gleichgewicht der XD-katalysierten Reaktion Xylitol begünstigt und niedrige stationäre Xylulosekonzentrationen erforderlich sind, um den Stoffwechselfluss in Richtung Ethanolproduktion zu lenken. Darüber hinaus ermöglichte die Klonierung dieser drei Gene die Kontrolle ihrer Expression in der Zelle. Im Rahmen des nativen Expressionskontrollsystems der Zelle wird ihre Expression durch die Anwesenheit von Xylose induziert und durch Glukose gehemmt. Die daraus resultierende rekombinante Hefe könnte in der Lage sein, Glukose und Xylose gleichzeitig zu Ethanol zu vergären, ohne die lange Verzögerungszeit zwischen der Fermentation von Glukose und Xylose, was für die industrielle Produktion von Ethanol äußerst wünschenswert wäre.

Im Jahr 1989 berichtete die Ho-Gruppe in Purdue erstmals über die Klonierung des Xylulokinase-Gens aus der Saccharomyces-Hefe. Anschließend ersetzte die Ho-Gruppe die DNA-Sequenzen stromaufwärts der XR-, XD- und XK-Strukturgene durch stromaufwärts liegende Sequenzen der glykolytischen Gene, die wirksame konstitutive Promotoren enthalten. Die so entstandenen XR-, XD- und XK-Gene wurden auf ein 2μ-Plasmid mit hoher Kopienzahl kloniert, und das resultierende Plasmid, pLNH32, wurde zur Transformation eines Stammes der industriellen Wildtyp-Saccharomyces-Hefe verwendet, von der bekannt ist, dass sie für die Ethanolproduktion unter Verwendung von Stärke (Glukose) als Ausgangsmaterial besser geeignet ist. 1993 berichtete dieselbe Gruppe über die erfolgreiche Entwicklung der rekombinanten Saccharomyces-Hefe 1400 (pLNH32), die hohe Konzentrationen von Xylose fast vollständig zu Ethanol vergären kann, wobei nur sehr wenig Xylitol als Nebenprodukt anfällt. Darüber hinaus konnte die resultierende Hefe Glukose und Xylose gemeinsam zu Ethanol vergären, ohne dass es zu einer größeren Verzögerung zwischen der Fermentation dieser beiden Zucker kam, obwohl die Fermentationsrate von Xylose langsamer ist als die von Glukose (Abbildung 4). Anschließend wurde über die Einzelheiten der Konstruktion und Entwicklung des 1400 (pLNH 32) berichtet. Seitdem hat die Ho-Gruppe die Hefe mit verschiedenen neuen Ansätzen, wie unten beschrieben, weiter verbessert.

Abbildung 4. (Links) Saccharomyces-Hefestamm 1400, transformiert mit dem Elternplasmid von pLNH32, das entweder keine XR-, XD- oder XK-Gene enthält oder nur XR und XD, aber nicht XK enthält, verwendet zur Fermentation einer Mischung aus Glucose und Xylose. (Rechts) 1400 Hefe, transformiert mit dem Plasmid pLNH32, das klonierte XR-, XD- und XK-Gene enthält. Die Hefe wurde zur Fermentierung von Glukose und Xylose unter denselben Bedingungen verwendet wie die in der linken Abbildung beschriebenen Ergebnisse. Die in diesen Plasmiden klonierten Gene wurden modifiziert und konstruiert wie in Referenz 9 beschrieben.

Das 2 μ-Plasmid, pLNH32, das das klonierte XR-XD-XK-Gen enthält, ist ein breit angelegtes Wirtsplasmid, das so konzipiert ist, dass es in der Lage ist, alle Saccharomyces-Hefestämme zu transformieren, einschließlich der industriellen Wildtyp-Saccharomyces-Hefe. Ein solches Plasmid kann zum Screening besserer Wirte für die Zellulose-Ethanolproduktion verwendet werden. Die Ho-Gruppe entwickelte auch eine einzigartige neue Gen-Integrationstechnik, die die effektive Integration mehrerer Gene in das Hefe-Chromosom in mehreren Kopien ermöglicht. Diese Technik ist einfach durchzuführen und garantiert nahezu, dass die auf dem Integrationsplasmid klonierten und in die Wirtshefezellen transformierten Gene in so vielen Kopien wie gewünscht in das Wirtsgenom integriert werden können, um die besten Aktivitäten zu erzielen (Abbildung 5). Diese Integrationstechnik wurde zur Entwicklung des stabilen xylosefermentierenden 1400er-Stammes 1400 (LNH-ST) verwendet, indem zunächst die XR-XD-XK-Gene zusammen als Kassette in das Hefechromosom in ausreichender Anzahl von Kopien integriert wurden, bis die resultierende Hefe Xylose mit der höchsten Effizienz fermentierte (Abbildung 6). Der derzeit beste von der Ho-Gruppe entwickelte Stamm, 424A (LNH-ST), wurde aus 10 verschiedenen Saccharomyces-Hefestämmen ausgewählt, indem zunächst jeder Stamm mit dem 2 μ-Plasmid pLNH32 transformiert wurde, um sicherzustellen, dass diese Stämme in der Lage waren, sowohl Xylose als auch Glukose/Xylose in Gegenwart von pLNH32 effektiv zu fermentieren, und anschließend Gene in die Chromosomen der ausgewählten Hefestämme integriert wurden, um die „stabile Hefe“ durch diese neue Integrationstechnik zu entwickeln. Die Co-Fermentation von Glucose/Xylose durch 424A (LNH-ST) ist in Abbildung 7 dargestellt.

Abbildung 5. Demonstration der schrittweisen Integration mehrerer Kopien von XR-XD-XK-Genen in die Chromosomen des Saccharomyces-Hefestamms 259 nach der in Ho et al. beschriebenen Methode. Hefen in verschiedenen Integrationsstadien wurden zur Fermentation von Glukose und Xylose unter identischen Bedingungen verwendet, um den Fortschritt der Integration dieser Gene zu demonstrieren: a) Im Anfangsstadium der Integration, b) 25 % der Integration, c) 50-75 % der Integration, d) nach Abschluss der Integration. Der Abschluss der Integration zeigt sich daran, dass die Zellen aus dem Integrationsprozess über einen ausreichend langen Zeitraum die gleichen Fermentationsergebnisse liefern.

Abbildung 6. Co-Fermentation von Glucose und Xylose mit 1400 (LNH-ST), die mehrere Kopien von XR-XD-XK-Genen enthalten, die nach der Methode von Ho et al. in die Hefechromosomen integriert wurden.

Abbildung 7. Co-Fermentation von Glukose und Xylose mit dem rekombinanten Saccharomyces-Stamm 424A (LNH-ST), der mehrere Kopien von XR-XD-XK-Genen enthält, die in die Hefechromosomen des Saccharomyces-Stammes 424A nach der Methode von Ho et al. integriert sind. Dabei handelt es sich um die beste Ho-Purdue-Hefe, die vor 2007 an der Purdue-Universität entwickelt wurde und derzeit der Industrie für die Zellulose-Ethanolproduktion zur Verfügung gestellt wird.

Wenn ein rekombinanter Mikroorganismus für die industrielle Produktion in großem Maßstab verwendet wird, z. B. für die Herstellung von Ethanol, ist es aus zwei wichtigen Gründen notwendig, die zu klonierenden Gene in die Wirts-Chromosomen zu integrieren. Wenn die geklonten Gene mit einer zuverlässigen Methode in die Wirts-Chromosomen integriert werden, können die geklonten Gene auf dem Wirts-Chromosom erhalten werden, ohne dass spezielle Chemikalien, Medien, Antibiotika und Zusatzstoffe verwendet werden müssen. Der Einsatz von Chemikalien oder Antibiotika zur Aufrechterhaltung der Eigenschaften verursacht nicht nur zusätzliche Kosten, sondern auch Schwierigkeiten bei der behördlichen Zulassung und der Beseitigung von Abwässern. Selbst bei Vorhandensein eines selektiven Mittels sind Plasmide mit hoher Kopienzahl, wie pLNH32, die zum Klonen der Gene in die Wirtszellen verwendet werden, möglicherweise nicht in der Lage, den industriellen Betrieb in großem Maßstab aufrechtzuerhalten. Die Ho-Gruppe zeigte, dass die stabile Hefe 1400 (LNH-ST), die mit dem neuen Integrationssystem entwickelt wurde, in der Lage war, die kontinuierliche Fermentation von Maisstrohhydrolysaten zu Ethanol in einer Pilotanlage aufrechtzuerhalten, während der gleiche Hefestamm, der das Plasmid 1400 (pLNH32) enthielt, dazu nicht in der Lage war.

Der Stamm 424A (LNH-ST) und die anderen stabilen Stämme 1400 (LNH-ST) und 259 (LNH-ST), die durch die neue Integrationstechnik entwickelt wurden, sind alle von anderen validiert worden und haben sich als nachhaltig und effektiv für die Zellulose-Ethanolproduktion mit Hydrolysaten aus verschiedenen Lignozellulose-Rohstoffen erwiesen. Der Stamm 424A (LNH-ST) wird seit 2004 in einer Demonstrationsanlage auch industriell für die Produktion von Zellulose-Ethanol aus landwirtschaftlichen Reststoffen eingesetzt.

Die von Hahn-Hägerdal entwickelte rekombinante Hefe wurde durch Klonierung verschiedener zusätzlicher Gene umfassend verbessert, einschließlich der Klonierung des Xylulokinase-Gens, nachdem die Ho-Gruppe an der Purdue-Universität gezeigt hatte, dass eine erhöhte Expression dieses nativen Gens die Ethanolausbeute aus Xylose verbessert.

Die von der Ho-Gruppe an der Purdue-Universität entwickelte Hefe ist für die industrielle Zellulose-Ethanolproduktion verfügbar. Sie wird wahrscheinlich gute Chancen haben, erfolgreich zu sein, da es sich um eine industrielle Ethanol produzierende Hefe handelt, die bereits ausgiebig getestet wurde. In jüngster Zeit hat die Purdue-Gruppe den Stamm weiter verbessert, indem sie ihn dazu brachte, Arabinose mit den anderen vier Zuckern (Glukose, Xylose, Mannose und Galaktose) zu ko-fermentieren, und indem sie ihn resistenter gegen Ethanol und Essigsäure machte.

Auch wenn der frühe Versuch, eine Xylose-Isomerase-basierte Saccharomyces-Xylose-fermentierende Hefe zu entwickeln, nicht erfolgreich war und eine wirksame XR/XD-basierte gentechnisch veränderte Xylose-fermentierende Hefe entwickelt wurde, hat das Interesse an der Entwicklung einer Xylose-Isomerase-basierten Xylose-fermentierenden Hefe über die Jahre hinweg angehalten, zum Teil, weil dieser Stoffwechselweg kein Redox-Ungleichgewicht aufweist. Im Jahr 2009 konstruierten Brat et al. eine Xylose-fermentierende S. cerevisiae unter Verwendung von Xylose-Isomerase aus Closteidium phytofermentans. Ebenfalls 2009 berichtete Cargill über die Entwicklung eines Nicht-Saccharomyces-Hefestamms, der Xylose-Isomerase exprimiert und in der Lage ist, ein Gemisch aus Glucose und Xylose bei niedrigem pH-Wert und in Gegenwart von 1 % Essigsäure effizient zu vergären.

Auch wenn Arabinose in Biomasse aus Gräsern nur in geringen Mengen als Teil der GAX-Hemicellulose vorhanden ist, enthalten einige spezielle Biomassequellen wie Maisfasern relativ große Mengen an Arabinose. Dennoch ist es ideal, wenn die Zellulose-Ethanol produzierenden Mikroben in der Lage sind, alle fünf verschiedenen Zuckermoleküle zu vergären, die in der Zellulose-Biomasse vorhanden sind, da die Wiederverwendung von Prozessströmen innerhalb eines industriellen Prozesses die Konzentration von Nebenkomponenten erhöhen kann.

Der Mechanismus des Arabinose-Stoffwechsels in Mikroorganismen ist ebenso kompliziert wie der Xylose-Stoffwechsel. Auch hier ist der Mechanismus des Arabinose-Stoffwechsels in Hefe anders als in Bakterien. Ähnlich wie beim Xylose-Stoffwechsel bevorzugt der Stoffwechselmechanismus der Hefe keinen anaeroben Stoffwechsel. Kürzlich haben Hahn-Hägerdal und Mitarbeiter ihre Xylose-fermentierende Saccharomyces-Hefe so weiterentwickelt, dass sie Arabinose zusammen mit Xylose und anderen Zuckern über den L-Arabinose-Stoffwechselweg des Pilzes vergärt. Die resultierende gentechnisch veränderte Hefe war jedoch immer noch nicht in der Lage, Arabinose zu einer signifikanten Menge Ethanol zu vergären, konnte aber eine kleine Menge Arabinose in Arabit umwandeln.