Abstract

Wnt5a ist an der Aktivierung verschiedener nicht-kanonischer Wnt-Signalwege beteiligt, die den kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalweg in Abhängigkeit vom Rezeptorkontext hemmen oder aktivieren können. Die Wnt5a-Signalübertragung ist entscheidend für die Regulierung normaler Entwicklungsprozesse, einschließlich der Selbsterneuerung von Stammzellen, Proliferation, Differenzierung, Migration, Adhäsion und Polarität. Darüber hinaus erweist sich die abnorme Aktivierung oder Hemmung der Wnt5a-Signalübertragung als wichtiges Ereignis bei der Krebsentstehung, das sowohl onkogene als auch tumorsuppressive Wirkungen hat. Jüngste Studien zeigen, dass der Wnt5a-Signalweg an der Regulierung der Selbsterneuerung von normalen und Krebsstammzellen sowie der Proliferation, Migration und Invasion von Krebszellen beteiligt ist. In diesem Artikel werden die neuesten Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen und die Rolle der Wnt5a-Signalübertragung in Stammzellen in der Embryogenese und in der normalen oder neoplastischen Brust oder im Eierstock vorgestellt, wobei hervorgehoben wird, dass Wnt5a je nach den von der Zielzelle exprimierten Oberflächenrezeptoren unterschiedliche Auswirkungen auf die Zielzellen haben kann.

1. Einleitung

Stammzellen, einschließlich embryonaler Stammzellen und in adultem Gewebe identifizierter Stammzellen, besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und zur Erzeugung differenzierterer Nachkommen. Die embryonale Stammzelle wird aus der inneren Zellmasse der Blastozyste gewonnen, ist pluripotent und kann daher alle Gewebe des Körpers bilden. Stammzellen in adulten Geweben befinden sich in spezialisierten Nischen, wo sie verschiedene umweltbedingte und intrinsische Signale integrieren, die das Zellschicksal bestimmen und die Gewebehomöostase aufrechterhalten.

Wnt-Faktoren sind eine Gruppe dieser Signalmoleküle, die auf Stammzellen in der Stammzellnische einwirken, um ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu erhalten. Es ist bekannt, dass Wnt-Faktoren an verschiedene Rezeptoren binden, um den kanonischen Signalweg oder nicht-kanonische Signalwege weiterzuleiten, die verschiedene biologische Aktivitäten regulieren. Der kanonische Wnt-Signalweg wird durch die Bindung von Wnt-Faktoren an Rezeptoren der Frizzled-Familie (Fzd) und Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-verwandte Protein-5/6-Korezeptoren (LRP5/6) zur Bildung von Komplexen eingeleitet. Dies führt zur Rekrutierung von Axin und Dishevelled (Dvl) an der Plasmamembran und zur Unterbrechung des β-Catenin-Abbaukomplexes, was zur Akkumulation von β-Catenin im Zytoplasma führt, das dann in den Zellkern wandert, wo es an die T-Zell-Faktor (TCF)/Lymphoid-Enhancer-Faktor (LEF)-Familie bindet und die Transkription von kanonischen Wnt-Zielgenen aktiviert. Im Gegensatz dazu aktivieren mehrere Wnt-Faktoren β-Catenin-unabhängige Wege (nicht-kanonische Wnt-Signalwege), die als Wnt-Ca2+-Weg oder planarer Zellpolaritätsweg (PCP) bekannt sind und die Zellmigration während der Embryogenese steuern.

Neunzehn sezernierte cysteinreiche Glykoproteine der Wnt-Familie wurden bei Mäusen und Menschen identifiziert. Während der frühen Embryogenese von Säugetieren und der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase im Erwachsenenalter werden diese Wnt-Faktoren und ihre Rezeptoren dynamisch exprimiert, um geeignete Signale zu aktivieren und das richtige Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung zu gewährleisten. Eine Störung der Wnt-Signalübertragung durch eine abnorme Expression von Wnt-Faktoren, ihren Rezeptoren oder nachgeschalteten Signalmolekülen kann zur Entwicklung verschiedener menschlicher Krebsarten führen. Da die Fähigkeit zur Tumorentstehung auf eine kleine Population von Tumorzellen beschränkt zu sein scheint, die über die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung verfügen, werden sie oft als Krebsstammzellen (CSCs oder tumorinitiierende Zellen) bezeichnet. Noch wichtiger ist, dass die Biologie von embryonalen Stammzellen, normalen Stammzellen und CSCs eng miteinander verbunden ist. Dies zeigt sich daran, dass molekulare Signale (z. B. Wnt-Signale), die embryonale Stammzellen oder normale adulte Stammzellen definieren und erhalten, in Tumorzellen oft in abnormaler Weise aktiviert werden.

Ein Hauptaugenmerk dieser Übersichtsarbeit liegt auf der Rolle der Wnt5a-Signalübertragung über verschiedene Oberflächenrezeptoren bei der Regulierung von Stammzellen in der Embryogenese und in der normalen oder neoplastischen Brust oder dem Eierstock, da es bereits mehrere ausgezeichnete Übersichtsarbeiten gibt, die Aspekte der Wnt-Signalübertragung bei Darmkrebs behandeln. Wir fassen die neuesten Erkenntnisse über die Signalwege zusammen, die durch Wnt5a aktiviert werden und die ein Rätsel für die rationale Entwicklung von Medikamenten darstellen, die darauf abzielen, die CSCs (oder tumorauslösenden Zellen) in Tumoren zu dezimieren und gleichzeitig die Funktion des normalen Gewebes zu erhalten.

2. Wnt5a-Signalweg

Wnt5a ist ein nicht-kanonischer Wnt-Ligand, der evolutionär konserviert ist und eine wichtige Rolle in der Entwicklung spielt. Homozygote Wnt5a-Knockout-Mäuse weisen aufgrund von Entwicklungsdefekten eine perinatale Letalität auf. Frühere Studien haben gezeigt, dass Wnt5a mit Fzd2 und dem Rezeptor-Tyrosinkinase-ähnlichen Orphan-Rezeptor 2 (ROR2) interagieren kann, um Rac1 in einem β-Catenin-unabhängigen Weg zu aktivieren. Kürzlich haben wir gezeigt, dass Wnt5a die Heterooligmatisierung des Rezeptor-Tyrosinkinase-ähnlichen Waisenrezeptors 1/2 (ROR1/ROR2) induziert, der Guanin-Austauschfaktoren (GEFs) rekrutiert und aktiviert, die wiederum RhoA bzw. Rac1 aktivieren und so die Chemotaxis und Proliferation von Leukämiezellen fördern. Andererseits konkurrierte Wnt5a mit Wnt3a um die Bindung an Fzd2 und hemmte dadurch die Wnt3a-abhängige LRP6-Phosphorylierung und die β-Catenin-Akkumulation in vitro und in intakten Zellen, wodurch die Fähigkeit von Wnt3a, die Akkumulation von β-Catenin zu induzieren, und damit die β-Catenin-abhängige Wnt-Signalisierung gehemmt wurden .

Allerdings konnte Wnt5a auch den β-Catenin-abhängigen Signalweg aktivieren und eine sekundäre Achsenbildung in Xenopus-Embryonen induzieren, die den Fzd5-Rezeptor koexprimierten . In einer weiteren Studie wurde festgestellt, dass Wnt5a die kanonische Wnt/β-Catenin-Signalgebung in Zellen hemmen kann, die ROR2 exprimieren, aber auch die kanonische Wnt/β-Catenin-Signalgebung in Zellen induzieren kann, die Fzd4 und LRP5 exprimieren. Ein einziger Wnt5a-Ligand kann also je nach Verfügbarkeit des Rezeptors unterschiedliche Auswirkungen auf die Zellen haben. Daher bestimmt der zelluläre Kontext die Wirkung von Wnt5a. Dies könnte eine Erklärung für die Beobachtung sein, dass Wnt5a bei verschiedenen Krebsarten entweder onkogene oder tumorsuppressive Wirkungen hat.

3. Wnt5a-Signalweg in embryonalen Stammzellen

Der Wnt-Signalweg (ausgelöst entweder durch Wnt3a, Wnt5a oder Wnt6) könnte auch an der kurzfristigen Aufrechterhaltung der Pluripotenz von ES-Zellen sowohl der Maus als auch des Menschen beteiligt sein. Der erste Beweis dafür wurde durch eine Studie über einen pharmakologischen Inhibitor der Glykogensynthase-Kinase-3 (GSK3) erbracht, der die GSK3-Aktivität modulieren konnte, was zur Aktivierung der kanonischen β-Catenin-Signalisierung und einer erhöhten Stabilität von c-Myc führte. In der Folge wurde festgestellt, dass Wnt5a und Wnt6 von embryonalen Fibroblasten-Fütterungszellen produziert werden, die die Differenzierung von ES-Zellen der Maus auf serumabhängige Weise hemmen können. Die direkte Aktivierung von β-Catenin unter Verwendung von konstitutiv aktivem β-Catenin (S33Y) ohne Störung der vorgelagerten Komponenten des Wnt/β-Catenin-Systems rekapitulierte die Wirkung von Wnts auf ES-Zellen vollständig. Wichtig ist, dass Wnt5a auch ein starker Inhibitor der β-Catenin-Phosphorylierung ist und dadurch β-Catenin stabilisiert. Diese Daten deuten darauf hin, dass Wnt5a Signale zur Stabilisierung von β-Catenin sendet, um die kanonische Wnt/β-Catenin-Signalgebung in ES-Zellen der Maus weiter zu aktivieren. Schließlich kann der Wnt/β-Catenin-Signalweg die mRNA für STAT3, einen bekannten Regulator der Selbsterneuerung von ES-Zellen, hochregulieren, was auf einen molekularen Mechanismus hindeutet, durch den der Wnt/β-Catenin-Signalweg die Differenzierung von ES-Zellen durch Konvergenz mit dem LIF/JAK-STAT-Signalweg auf der Ebene von STAT3 verhindert. Welche Oberflächenrezeptoren jedoch an der Aktivierung der Wnt5a/β-Catenin-Signalgebung in ES-Zellen beteiligt sind und ob auch nicht-kanonische Wnt-Signalgebung durch Wnt5a in ES-Zellen aktiviert werden könnte, bleibt unklar.

4. Wnt5a-Signalisierung auf Stammzellen in normalem Brustdrüsen- und Eierstockgewebe

Eine Reihe von Belegen unterstützt die Bedeutung von Wnt für die Aufrechterhaltung der Stammzellen in der Brustdrüse. Wnt5a induziert jedoch keine β-Catenin/TCF-Transaktivierungsaktivität im Brustdrüsengewebe. Die Zellen der Brustdrüse sind bei Wnt5a-Knockout-Mäusen hyperproliferativ, während in Gegenwart von ektopischem Wnt5a die Ausdehnung der Gänge gehemmt ist. Diese Phänotypen sind das Gegenteil der Aktivierung der kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalübertragung. Daher kann Wnt5a das Wachstum der Brustdrüse begrenzen und kontrollieren, indem es die Wnt/β-Catenin-Signalübertragung unterdrückt. Es ist daher rätselhaft, dass diese Hemmung des Brustdrüsenwachstums in transgenen MMTV-Wnt5a-Stämmen nicht beobachtet wurde.

Im Keimblatt von Drosophila kommt es zu einer veränderten Wingless (Wg; das Wnt-Homolog der Fliege) Signalübertragung in ovariellen Keimbahnstammzellen (GSCs) durch die Entfernung ihrer Regulatoren wie Dishevelled, Armadillo, Axin und Shaggy; dies führt zu einem GSC-Verlust, beeinflusst die Follikelzellproliferation und induziert die Differenzierung. Die Anwendung des konditionalen Gen-Targetings für Wnt5a in Granulosazellen der Eierstöcke (GC) führt zu weiblicher Subfertilität, die mit erhöhter Follikelatresie und verringerten Ovulationsraten einhergeht. Eine weitere Studie ergab, dass Wnt5a seine Zielgene nicht über den Wnt/Ca2+-Signalweg oder den Weg der planaren Zellpolarität reguliert, sondern durch die Hemmung des kanonischen Signalwegs, wodurch sowohl die β-Catenin- als auch die CREB-Proteinkonzentration über einen Glykogensynthase-Kinase-3β-abhängigen Weg in den Granulosazellen der Eierstöcke (GC) sinkt. Diese Daten deuten darauf hin, dass Wnt5a für die normale Entwicklung der Ovarialfollikel erforderlich ist und die Gonadotropinreaktion in Granulosazellen durch die Unterdrückung der kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalisierung unterdrücken kann.

Gesamt ist es sehr wahrscheinlich, dass Wnt5a die β-Catenin-Signalisierung in normalen Stammzellen der Brustdrüse und des Ovarialgewebes unterdrückt, obwohl Wnt5a die β-Catenin-Signalisierung in embryonalen Stammzellen aktivieren kann. Ob dieser Unterschied auf Rezeptoren zurückzuführen ist, die in embryonalen Stammzellen anders exprimiert werden als in Stammzellen der normalen Brustdrüse oder des Eierstocks, muss weiter untersucht werden.

5. Wnt5a Signaling in Breast Cancer Stem Cells

Wnt-Faktoren können verschiedene Brustepithelzellen beeinflussen und eine Expansion von Stammzellen während der Tumorprogression induzieren. Darüber hinaus wurde eine abweichende β-Catenin-Expression mit basalem, dreifach negativem Brustkrebs und einem schlechten klinischen Ergebnis in Verbindung gebracht. Das Auftreten einer abnormen Wnt-Signalübertragung bei bestimmten Brustkrebs-Subtypen ist weniger wahrscheinlich auf eine Aktivierung durch somatische Mutationen zurückzuführen. In CTNNB1, das für β-Catenin kodiert, wurden keine Mutationen festgestellt, und Mutationen in APC wurden bei weniger als 20 % der Brustkrebspatientenproben identifiziert. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um festzustellen, welche Wnt-Liganden und -Rezeptoren diese abweichende Wnt/β-Catenin-Signalübertragung verursachen.

Kürzlich wurde in einer Studie mit primären MMTV-Wnt1-Mauszellen festgestellt, dass sowohl rekombinantes Wnt3a als auch rekombinantes Wnt5a die Bildung von Mammosphären in vitro fördern können. Die Wnt5a-induzierte Bildung von Mammosphären wurde nicht durch eine Zunahme der kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalisierung verursacht, sondern durch nicht-kanonische Wnt-Signalisierung, die die Rezeptortyrosinkinase ROR2 und die Aktivität der Jun N-terminalen Kinase, JNK, in Brustkrebszellen der Maus erfordert. Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass Patientinnen mit Brustkrebs, die ROR2 exprimieren, ein deutlich kürzeres Gesamtüberleben haben als solche mit Tumoren, die ROR2 nicht exprimieren. Das Silencing von ROR2 in menschlichen Brustkrebszelllinien verringerte jedoch sowohl β-Catenin-abhängige als auch β-Catenin-unabhängige Ziele, was darauf hindeutet, dass ROR2 sowohl an β-Catenin-abhängigen als auch an β-Catenin-unabhängigen Wnt-Signalwegen beteiligt sein könnte. ROR1 scheint vor allem von weniger gut differenzierten Tumoren exprimiert zu werden, die ein hohes Potenzial für Rückfälle und Metastasen haben und die auch Marker exprimieren, die mit dem epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) assoziiert sind. Umgekehrt könnte das Ausschalten von ROR1 in menschlichen Brustkrebszelllinien die Expression von Genen, die mit EMT assoziiert sind, abschwächen und ihre Migrations-/Invasionsfähigkeit in vitro sowie ihr metastatisches Potenzial in vivo beeinträchtigen. Vor kurzem berichteten Chien et al., dass die Expression von ROR1 ein unabhängiger negativer Prognosefaktor bei Patientinnen mit dreifach negativem Brustkrebs sein könnte. Ob ROR1 eine ähnliche Wirkung wie ROR2 auf Brustkrebsstammzellen haben kann und welche(r) Signalweg(e) durch ROR1 in Brustkrebsstammzellen aktiviert werden, ist nach wie vor unbekannt.

Eine Studie an einem Mausmodell für ErbB2-induzierten Brustkrebs ergab widersprüchliche Erkenntnisse über die Wirkung von Wnt5a auf menschliche Brustkrebsstammzellen. Während der ErbB2-induzierten Mammatumorigenese verloren basale tumorinitiierende Zellen (TIC), die im Vergleich zu den entsprechenden luminalen Vorläuferzellen eine erhöhte tumorigene Kapazität aufwiesen, bevorzugt die Wnt5a-Expression, wie durch Transkript-Profiling-Analyse festgestellt wurde. Darüber hinaus förderte die Wnt5a-Heterozygotie die Tumormultiplikation und Lungenmetastasierung. Als TGFβ-Substrat induzierte das von luminalen Zellen produzierte Wnt5a eine Feed-Forward-Schleife, die SMAD2 in einer RYK- und TGFβR1-abhängigen Weise aktivierte, um die Expansion der basalen TIC auf parakrine Weise zu begrenzen, was eine mögliche Erklärung für die suppressive Wirkung von Wnt5a auf die Mammatumorigenese darstellt. In diesem Mausmodell bleibt unklar, ob der kanonische Wnt/β-Catenin-Signalweg aktiviert wurde oder ob Wnt5a auch den kanonischen β-Catenin-Signalweg hemmte, um die Ausbreitung der basalen TIC zu unterdrücken.

Das Weinberg-Laboratorium untersuchte immortalisierte humane Brustepithelzellen (mMECs) und stellte fest, dass sowohl der kanonische als auch der nicht-kanonische Wnt-Signalweg mit dem TGFβ-Signalweg nicht nur bei der Aufrechterhaltung, sondern interessanterweise auch bei der Induktion der Stammzelleigenschaften zusammenwirkten. Darüber hinaus wurden nur die nicht-kanonischen Wnt-Liganden Wnt5a und Wnt16 in stammähnlichen Zellen im Vergleich zu nicht-stammähnlichen Zellen hochreguliert. Daher ist es möglich, dass Wnt5a oder Wnt16 in menschlichen Brustkrebsstammzellen entweder den kanonischen oder den nicht-kanonischen Wnt-Signalweg in einer vom Rezeptorkontext abhängigen Weise aktivieren.

6. Wnt5a-Signalübertragung in Ovarialkrebsstammzellen

Gleich wie bei Brustkrebs ist auch die Wirkung von Wnt5a auf Eierstockkrebs umstritten. Eine frühe Studie an primären Ovarialtumoren () zeigte, dass niedrige Wnt5a-Spiegel bei Eierstockkrebs im Vergleich zu normalen Eierstöcken ein Vorzeichen für ein schlechtes Ergebnis sind. Die ektopische Expression von Wnt5a hemmt die Proliferation der menschlichen Eierstockkrebs-Zelllinie OVCAR5 sowohl in vitro als auch in vivo in orthotopen Eierstockkrebs-Mausmodellen. Mechanistisch gesehen hemmt die ektopische Expression von Wnt5a in OVCAR5 die kanonische Wnt/β-Catenin-Signalgebung und induziert die zelluläre Seneszenz durch Aktivierung des Histonrepressors A (HIRA)/Promyelozytenleukämie (PML)-Seneszenzweges.

Im Gegensatz dazu wurde in Studien mit einer großen Anzahl von Patienten festgestellt, dass die Hochregulierung von Wnt5a mit einer relativ schlechten Prognose verbunden ist. Verglichen mit der Häufigkeit der Wnt1-Expression bei Eierstockkrebs wurde Wnt5a häufiger bei Patientinnen mit bösartigem epithelialem Eierstockkrebs gefunden (80 % von insgesamt 38). Bemerkenswert ist, dass Patientinnen mit Ovarialkarzinomen, die sowohl Wnt1 als auch Wnt5a in hohen Konzentrationen exprimieren, eine signifikant geringere Wahrscheinlichkeit des Langzeitüberlebens hatten als Patientinnen mit Ovarialkarzinomen, die weder Wnt1 noch Wnt5a exprimierten. Außerdem ist Wnt5a in der Aszitesflüssigkeit von Frauen mit Eierstockkrebs weit verbreitet, was darauf hindeutet, dass es zur Mikroumgebung des Eierstocktumors beiträgt. Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass hohe Wnt5a-Konzentrationen mit einem erhöhten Metastasierungsrisiko einhergehen.

Aktivierende Mutationen im kanonischen Wnt-Signalweg sind bei Eierstockkrebs selten, mit Ausnahme von endometrioiden Ovarialkarzinomen. Der Beitrag der kanonischen Wnt-Signalübertragung zum Fortschreiten des Ovarialkarzinoms ist nach wie vor unbekannt. Umgekehrt zeigen Studien zur nicht-kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalgebung, dass Wnt5a die EMT, Migration oder Metastasierung von Eierstockkrebs über nicht-kanonische Signalwege regulieren kann. In Übereinstimmung mit dieser Vorstellung haben neuere Studien herausgefunden, dass die Expression von ROR1, einem Rezeptor von Wnt5a, bei hochgradigen und weniger differenzierten Ovarialkarzinomen hoch exprimiert wurde und mit einem relativ kurzen krankheitsfreien Überleben und Gesamtüberleben im Vergleich zu Ovarialkarzinomen, die ROR1 nicht exprimierten, verbunden war. Ovarialkarzinome, die ROR1 in hohem Maße exprimieren, wiesen Genexpressionssignaturen auf, die mit ovariellen CSCs assoziiert sind. Darüber hinaus korreliert die Expression von ROR1 in den Tumorzellen offenbar mit der Expression von ALDH1 und der Fähigkeit, in vitro Tumor-Sphäroide zu bilden (beides Marker für CSC). Die Behandlung primärer Ovarialtumorzellen (PDX), die ROR1 in hohem Maße exprimieren, mit einem Anti-ROR1-mAbkömmling (UC-961 oder Cirmtuzumab) hemmte die Sphäroidbildung und Migration in vitro sowie die Transplantation und erneute Transplantation in immundefizienten Mäusen, was darauf hindeutet, dass ROR1 die Selbsterneuerung von Eierstockkrebs-Stammzellen beeinflussen kann. Weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob Wnt5a für den Einfluss verantwortlich ist, den ROR1 offenbar auf die Biologie von Eierstockkrebs-Stammzellen hat.

7. Abschließende Bemerkungen

Wnt5a spielt möglicherweise eine wichtige Rolle bei der embryonalen Stammzell- und Organentwicklung. Die Rolle von Wnt5a in Krebsstammzellen ist jedoch vielfältig und komplex. Es kann die Tumorprogression unterdrücken oder fördern. Um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die das veränderte Zellverhalten steuern, sind zusätzliche Forschungsarbeiten zur gewebespezifischen Expression spezifischer Rezeptoren und Korezeptoren erforderlich. Insbesondere bedarf es eines genaueren Verständnisses der komplexen Wechselwirkungen zwischen Wnt5a und spezifischen Rezeptoren, die in embryonalen Stammzellen exprimiert werden und die in Krebsstammzellen reexprimiert oder reaktiviert werden können, nicht aber in normalen somatischen Geweben (z. B., ROR1 und ROR2) können die Entwicklung spezifischer Inhibitoren ermöglichen, die die aberrante Signalübertragung blockieren und dadurch das Überleben der Patienten positiv beeinflussen.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit der Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.

Dankesworte

Diese Studie wurde von der Breast Cancer Research Foundation (NIH Grant P01-CA081534), dem California Institute for Regenerative Medicine, der National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant no. 2016YFC009159) und der Science and Technology Foundation of Shenzhen, China (Shenzhen Peacock Innovation Team Project, Grant no. KQTD20140630100658078) unterstützt.