Einführung

Alle Mikroskoptechniken, bei denen die gesamte Probe dem Licht ausgesetzt ist, werden als „Widefield“-Bildgebung bezeichnet. Das Gegenstück zum Widefield ist das konfokale Verfahren, bei dem Nadellöcher verwendet werden, um den größten Teil des Lichts zur und von der Probe zu blockieren. In diesem Artikel werden das Widefield-Imaging und die in der Mikroskopie am häufigsten verwendeten Widefield-Techniken erörtert.

Widefield-Mikroskope

Beim Widefield-Imaging wird die gesamte Probe von einer Lampenlichtquelle entweder von unten (aufrechtes Mikroskop) oder von oben (inverses Mikroskop) beleuchtet. Aufrechte Mikroskope werden häufig für fixierte Proben wie behandelte und auf Objektträger montierte Zellen oder Gewebe verwendet, während inverse Mikroskope oft besser geeignet sind, um eine in Flüssigkeit eingetauchte Probe abzubilden, da sie in der Regel auf den Boden sinkt und mit den Objektiven des Mikroskops leichter von unten zu sehen ist. Dies ermöglicht die Abbildung von Suspensionszellen, da Zellen, die in den Biowissenschaften untersucht werden, in der Regel entweder adhärent (an einer Oberfläche haftend) oder in Suspension (in einer Flüssigkeit suspendierte Zellen) wachsen. Beispiele für ein aufrechtes und ein inverses Mikroskop sind in Abbildung 1 zu sehen.

Bei Weitfeldmikroskopen reicht in der Regel eine weiße Lichtquelle (z. B. eine Lampe) mit einigen Filtern für Fluoreszenzarbeiten aus. Dadurch wird auch die Bildgebung einfacher und die Bilddateigröße kleiner, was die Arbeit mit dem Weitfeld für Anwendungen wie die Zelldokumentation erleichtert.

Weitfeldtechniken

Beispiele für Weitfeldmikroskopietechniken sind Hellfeld, differentieller Interferenzkontrast (DIC), Phasenkontrast und Weitfeldfluoreszenz.

Die Hellfeldmikroskopie ist eine zugängliche Form der Mikroskopie, bei der die gesamte Probe mit einem hellen Licht beleuchtet wird. Diese Methode erfordert nur wenig Probenvorbereitung und kann zur schnellen und einfachen Überprüfung lebender Zellen oder zur Erstellung zusätzlicher Daten verwendet werden. Es wird jedoch dringend empfohlen, ein Kontrastmittel zu verwenden, da die meisten Zellproben durchsichtig sind und ohne einen Farbstoff nur schwer aufgelöst werden können. Zellen bestehen größtenteils aus Wasser, und wenn sie auf klarem Glas oder Kunststoff abgebildet werden, kann es schwierig sein, kleinere Strukturen ohne zusätzlichen Kontrast zu erkennen.

Beim differentiellen Interferenzkontrast (DIC) wird die Probe mit Licht beleuchtet, das in zwei polarisierte Lichtstrahlen aufgespalten wird; wenn sich diese Strahlen rekombinieren, erscheinen die Unterschiede in der Phasenverschiebung als Kontrast im endgültigen Bild. Ähnlich wie der Phasenkontrast ist diese Technik nicht für dickere Proben geeignet und erfordert einen größeren technischen Aufwand als andere Techniken.

Die Phasenkontrastmikroskopie bietet einen besseren Kontrast als das Hellfeld, indem sie das Streulicht der Probe nutzt. Durch die Beleuchtung der Probe mit einem Lichtring und einem weiteren Ring vor dem Sucher des Mikroskops erscheinen die Teile der Probe, die das Licht unterschiedlich streuen, auf dem Bild dunkler oder heller, so dass der Kontrast höher ist als bei der normalen Hellfeldmikroskopie. Dieser verbesserte Kontrast ist bei dickeren Proben nicht zu sehen, da er Artefakte erzeugt, funktioniert aber gut bei Zellkulturen. Ein Beispiel für diese Ringe ist in Abb. 2 zu sehen.

Die Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie ähnelt der Hellfeldmikroskopie, aber es werden spezifische Lichtwellenlängen verwendet, um fluoreszierende Moleküle anzuregen, mit denen die Probe vorbehandelt wurde (obwohl einige Proben von Natur aus auto-fluoreszierend sind). Die Proben können mit Fluoreszenzmarkern für bestimmte Proteine oder Zellbestandteile angefärbt werden, und das von diesen Markern emittierte Fluoreszenzlicht bildet dann ein Bild. Das Fluoreszenzsignal bedeutet, dass im Vergleich zu anderen Techniken ein besserer Kontrast erzielt wird, da durch die Verwendung spezifischer Lichtwellenlängen nur die fluoreszierenden Moleküle Licht emittieren, während nicht das gesamte Bild beleuchtet wird. Da jedoch die gesamte Probe mit diesem Licht beleuchtet wird, können die Fluoreszenzsignale von außerhalb des Betrachtungsbereichs zu Hintergrundfluoreszenz und unscharfen Bildern führen.

Out-of-Focus Light

Der größte Nachteil besteht darin, dass bei der Beleuchtung der gesamten Probe zwar die Fokusebene Licht empfängt und ein Bild erzeugen kann, aber auch die Ebenen über und unter der Fokusebene Licht empfangen, was zu unscharfem Licht und damit zu einer Bildverschlechterung führt. Insbesondere bei der Fluoreszenzanregung ist die Auflösung eines Weitfeldsystems begrenzt, da die Hintergrundfluoreszenz ebenfalls von der Kamera erfasst wird und das Signal-Rausch-Verhältnis verschlechtert.

Bestimmte Weitfeldtechniken umgehen dieses Problem, wie z. B. die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), bei der Lichtmuster verwendet werden, um ein komplexes Muster zu erzeugen. Die Bildgebung auf der Grundlage von Interferenzmustern ermöglicht ein hohes Maß an Detailgenauigkeit und löst Objekte mit einer Größe von nur 200 nm auf. Mehr über SIM erfahren Sie in der SIM-App auf unserer Website.

Zusammenfassung

Die Weitfeld-Bildgebung ist die Grundlage der meisten zellulären Studien und ermöglicht es den Forschern, Proben schnell und einfach abzubilden, ohne dass eine Probenvorbereitung oder technisches Fachwissen erforderlich ist. Von der Hellfeld- bis zur Fluoreszenz-Bildgebung ist die Weitfeld-Bildgebung eine leistungsstarke und vielseitige Technik, mit der viele Forscher vertraut sind. Auch wenn die Technik im Vergleich zu konfokalen oder anderen fortschrittlichen Mikroskopieanwendungen eine geringere Auflösung aufweist, hat die Weitfeld-Bildgebung einen festen Platz in der Forschung und wird sich im Laufe der Zeit weiterentwickeln.