Abstract

Serumproben von 474 Wildvögeln, 378 Pferden und 42 Menschen mit Meningitis und lymphozytärer Meningitis wurden zwischen 2010 und 2014 aus verschiedenen Gebieten Polens gesammelt. Antikörper gegen das West-Nil-Virus (WNV) wurden mit Hilfe von konkurrierenden enzymatischen Immunosorbent-Assays nachgewiesen: ELISA-1 ID Screen West Nile Competition, IDvet, ELISA-2 ID Screen West Nile IgM Capture, und ELISA-3 Ingezim West Nile Compac. Die Antikörper wurden in 63 (13,29 %) von 474 Wildvogel-Serumproben und in einer (0,26 %) von 378 Pferde-Serumproben gefunden. Vierzehn (33,33 %) von 42 Patientenseren waren positiv gegen das WNV-Antigen, ein Serum war zweifelhaft. Positive Proben von Vögeln wurden anschließend mit dem Virus-Mikroneutralisationstest erneut getestet, um positive Ergebnisse und Kreuzreaktionen mit anderen Antigenen des japanischen Enzephalitis-Komplexes zu bestätigen. Wir vermuten, dass positive serologische Ergebnisse bei Menschen, Vögeln und Pferden darauf hindeuten, dass WNV in irgendeiner Weise eng mit dem Ökosystem in Polen verbunden sein kann.

1. Einleitung

Das West-Nil-Virus (WNV) kann ein breites Spektrum von Vogelarten, Pferden und Menschen befallen. Das Virus ist ein neu auftretender Erreger, der weltweit für Krankheiten bei diesen Tieren und Menschen verantwortlich ist. Die Hauptüberträger des WNV sind verschiedene Arten blutsaugender Insekten, die das Virus auf Vögel, Pferde und Menschen übertragen können.

Die Infektionen sind durch starke Fieberschübe, Lähmungen und Morbidität gekennzeichnet, die durch Faktoren verursacht werden, die bisher nur bei Tieren als pathogen anerkannt waren. Häufiger sind die Infektionen durch milde klinische Symptome gekennzeichnet.

WNV steht auf der Liste der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) als meldepflichtiger neurotroper Faktor, der die Krankheit verursacht. Das durch das Virus verursachte West-Nil-Fieber (WNF) ist eine Zoonose, die in den USA das größte Problem für die öffentliche Gesundheit darstellt.

WNV ist ein Arbovirus aus der Familie der Flaviviridae, Gattung Flavivirus, das zum Antigenkomplex der Japanischen Enzephalitis gehört, der durch das antigenisch verwandte Japanische Enzephalitis-Virus (JEV), das St. Louis Enzephalitis-Virus (SLEV), das Murray Valley Enzephalitis-Virus (MVEV) und das Usutu-Virus (USUV) hervorgerufen wird. Das ssRNA+-Genom des Virus enthält ein einziges offenes Leseraster von 11.000 bis 12.000 Nukleotiden. Das Genom des Virus besteht aus sieben Nichtstrukturproteinen, NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b und NS5, und drei Strukturproteinen: Glykoprotein E, Kernprotein C und Prämembranprotein prM.

Tropische Vögel und Zugvögel, die zu verschiedenen Arten gehören, sind das Hauptreservoir des Virus. Die Linie 1 des WNV ist eine weltweit isolierte Linie, aber die Linie 2 wurde nur in Afrika und Madagaskar isoliert, bis zu den ungarischen Ausbrüchen von WNV, die durch eine neue Linie 2 verursacht wurden, die wahrscheinlich durch Zugvögel aus Afrika im Jahr 2004 nach Ungarn eingeschleppt wurde. Derselbe Stamm 2 verursachte im Sommer 2010 eine endemische neuroinvasive Krankheit (WNND) beim Menschen in Griechenland mit 262 bestätigten Fällen und 35 Todesfällen. Im Jahr 2011 breitete sich das Virus nach Zentralgriechenland aus, allerdings mit weniger Fällen, nämlich 101 diagnostizierten Fällen und 9 Todesfällen. Die Gesamtzahl der mit dem Virus infizierten Menschen in Griechenland wird auf 18000 geschätzt.

Über 300 verschiedene Vogelarten wurden mit dem WNV infiziert. Normalerweise zirkuliert das Virus zwischen Wildvögeln und Stechmücken in einem geschlossenen Kreislauf und kann von den Vögeln während ihrer Wanderungen in die verschiedenen Regionen getragen werden.

Das Virus kommt in vielen Ländern der Welt und auch in 20 europäischen Ländern vor, darunter auch in Ländern, die enge Nachbarn Polens sind, in denen das Auftreten des Virus bestätigt wurde. Das Vorhandensein von WNV-Antikörpern wurde auch in Serumproben von Wildvögeln und Menschen in Polen bestätigt.

Im Jahr 2010 wurden durch WNV-Infektionen verursachte menschliche Morbidität und Mortalität in Griechenland, Russland, Rumänien, Italien und Israel gemeldet.Die Zirkulation des Usutu-Virus wurde auch in Polen bestätigt. Über die Verbreitung anderer Viren, die für den Japanischen Enzephalitis-Komplex in Polen verantwortlich sind, wurden keine weiteren Studien veröffentlicht.

Ziel der Studie war der Nachweis von WNV-Antikörpern in Serumproben von verschiedenen Wildvögeln, Pferden und hospitalisierten Patienten mit neurologischen Symptomen.

2. Material und Methoden

Vögel. Serumproben von 474 Wildvögeln, 400 Weißstörchen (Ciconia ciconia), 21 Fasanen (Phasianus colchicus), 19 Buchfinken (Fringilla coelebs), neun Wildenten (Anas platyrhynchos), vier Seeadler (Haliaeetus albicilla), zwei Westliche Auerhähne (Tetrao urogallus), sechs Reisetauben (Ectopistes migratorius), drei Habichte (Accipiter gentilis) zwei Nebelkrähen (Corvus cornix), drei Habichte (Accipiter gentilis) sowie ein Mauersegler (Apus apus), eine Amsel (Turdus merula), ein Star (Sturnus vulgaris), ein Kolkrabe (Corvus corax) und ein Mäusebussard (Buteo buteo) wurden an verschiedenen Orten in Polen (Zoologische Gärten, Rehabilitationszentrum für geschützte Tiere) gesammelt. Die meisten Proben stammen jedoch aus dem Rehabilitationszentrum für Wildvögel der Albatros-Stiftung. Die Proben wurden von März bis Oktober 2010-2014 gesammelt, als die Aktivität der Mücken am höchsten war (Abbildung 1).

Abbildung 1

Karte von Polen. Gebiete, in denen die Proben gesammelt wurden.

Pferde. 378 Serumproben wurden von gesunden domestizierten Pferden aus einigen Ranches in vier Bezirken entnommen. Die Serumproben wurden auch von Rennpferden entnommen (Abbildung 1).

Mensch. Serumproben von 42 Patienten (17 Männer und 25 Frauen) aus der Abteilung für Infektionskrankheiten und Neuroinfektionen der Medizinischen Universität von Bialystok. Die Patienten wiesen neurologische Symptome auf, die für Meningitis, lymphozytäre Meningitis und durch Zecken übertragene Enzephalitis charakteristisch sind. Sie wurden zwischen Mai und September 2010 ins Krankenhaus eingeliefert. Alle Patienten wurden mit Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens, auf Antikörper gegen das Zeckenenzephalitis-Virus getestet. Die Proben wurden bei -20°C aufbewahrt.

Alle untersuchten Proben wurden doppelt geprüft und unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe 3+ getestet.

ELISA-1. Die serologische Untersuchung wurde mit dem handelsüblichen ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, Frankreich) zum Nachweis von West-Nil-Virus-Antikörpern gegen die pr-E- und pr-M-Hüllproteine, die ein dem Japanischen Enzephalitis-Virus gemeinsames Epitop enthalten, gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Alle Proben wurden zweimal untersucht. Die Mikrotiterplatten wurden bei 450 nm abgelesen. Der ELISA wurde validiert, indem die Restbindungsraten (S/N%) berechnet wurden. Serumproben mit einem S/N-Verhältnis von 40 % oder weniger wurden als positiv eingestuft; Proben mit einem Verhältnis von über 50 % galten als negativ. S/N-Werte zwischen 40% und 50% galten als zweifelhaft.

Der ELISA-2 wurde mit ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, Frankreich) durchgeführt. Die Vertiefungen wurden mit polyklonalen IgM-Antikörpern beschichtet. Bei positiven Ergebnissen wurde das Vorhandensein von Antikörpern durch eine blaue Lösung angezeigt, und nach Zugabe der Stopplösung wurde diese gelb. In Abwesenheit von Antikörpern trat keine Färbung auf. Die Platten wurden bei 450 nm abgelesen.

Der ELISA-3 wurde mit dem enzymatischen Assay Ingezim WNV Compac (Ingenasa, Spanien) auf der Grundlage des Blocking-ELISA durchgeführt, bei dem ein monoklonaler Antikörper (MAb) verwendet wurde, der spezifisch für das Protein E des WNV ist. Wenn Antikörper in den Serumproben vorhanden waren, banden sie an das Antigen. Wurde ein für das Protein E spezifischer MAb hinzugefügt, so band dieser an das Antigen, das nicht durch Antikörper aus der Serumprobe blockiert wurde. Wenn die Antikörper das Antigen blockieren, bindet das Konjugat nicht daran. Der Test wurde durch eine kolorimetrische Reaktion nach Zugabe des Substrats abgelesen. Die Proben galten als positiv, wenn die OD-Werte gleich oder niedriger waren als die der positiven Kontrollseren. Proben galten als negativ, wenn der OD-Wert gleich oder höher als der negative Cut-off-Wert war. Proben mit OD-Werten im Bereich beider Werte wurden als zweifelhaft angesehen.

Virus-Mikroneutralisationstest. Der Virus-Mikroneutralisationstest mit ELISA-positiven Proben von Wildvögeln wurde im Europäischen Referenzlabor, ANSES, Frankreich, durchgeführt. Für den Test wurden Vero-Zellen und das West-Nil-Virus, Stamm IS-98-ST1, verwendet. Der Test basierte auf dem OIE-Standardverfahren.

3. Ergebnisse

Die Bezirke Polens und die Gebiete, in denen die Proben entnommen wurden, sind in Abbildung 1 dargestellt.

Die meisten Proben wurden den Vögeln während der Zuweisung und der tierärztlichen Behandlung entnommen. Einige der Vögel befanden sich nach Unfällen im Rehabilitationszentrum. Die Vögel zeigten keine Symptome neurologischer Erkrankungen und keine Anzeichen für neurologische Infektionen. Jeder Vogel wurde von der Organisation, die die Proben eingesandt hatte, mit Informationen über den Standort, das Geschlecht, das Alter und, wenn möglich, über die Reisegeschichte versorgt.

Die Untersuchungen der Serumproben ergaben spezifische WNV-Antikörper in 63 Proben von Wildvögeln: 62 von Weißstörchen und eine von Buchfinken. Eine positive Serumprobe wurde von einer Stute gewonnen.

Bei den menschlichen Serumproben waren 14 von 42 positiv und eine war zweifelhaft. Alle Patienten hatten eine Vorgeschichte mit Mücken- und Zeckenstichen. Bei 16 Patienten wurde eine durch Zecken übertragene Enzephalitis diagnostiziert.

Um die Ergebnisse zu bestätigen, wurde ein ELISA-2 durchgeführt, um spezifische WNV-IgM-Antikörper im Serum nachzuweisen, die als erste Linie der Immunantwort gelten. Die Ergebnisse waren negativ und bestätigten daher weder das Vorhandensein von IgM-Antikörpern noch einen Hinweis auf eine kürzlich erfolgte Infektion der Tiere.

Zur Überprüfung der mit ELISA-1 erzielten Ergebnisse wurde ELISA-3 durchgeführt, und das Vorhandensein spezifischer WNV-Antikörper wurde in diesen Fällen bestätigt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Zur Bestätigung positiver Ergebnisse wurden die positiven Serumproben von Vögeln erneut mit dem Virus-Mikroneutralisationstest untersucht. Alle 63 Serumproben von Wildvögeln wurden bestätigt und als positiv für WNV-Antikörper mit einem Titer von 10 in 60 Proben und einem Titer von 30 in drei Proben identifiziert. Bei den Untersuchungen auf andere JECV-Vertreter waren die Proben ebenfalls negativ für das Usutu-Virus. Es wurden keine Kreuzreaktivitätsreaktionen beobachtet.

Die Ergebnisse der verschiedenen Diagnosemethoden (ELISAs und Virusmikroneutralisationstests) werden in Tabelle 1 verglichen.

4. Diskussion

In den letzten Jahren wurde festgestellt, dass sich das WNV in Ländern mit gemäßigtem Klima ausbreitet. Mücken aus der Familie der Culicidae sind die häufigsten Überträger des Virus, und heutzutage gibt es sechs dieser Mückenarten in der polnischen Klimazone. In den neunziger Jahren des letzten Jahrhunderts bestätigten Juřicová et al. mit Hilfe des Hämagglutinationshemmungstests WNV-Antikörper bei 12,1 % der Haussperlinge (Passer domesticus) und bei 2,8 % der Feldsperlinge (Passer montanus) im Waldgebiet Campinas in Polen. In den folgenden Jahren wurden WNV-Antikörper bei drei Störchen, einer Krähe (Corvus corone cornix) und einem Höckerschwan (Cygnus olor) im anderen Teil Polens gefunden.

Wir haben drei verschiedene ELISAs durchgeführt, um die erhaltenen Ergebnisse zu präsentieren und anschließend zu bestätigen. Der erste ELISA war ID Screen West Nile Competition, ein Test, der spezifisch für WNV ist, der aber auch serologische Kreuzreaktionen unter den JECV-Mitgliedern zeigt. Bei positiven Ergebnissen wurde der ELISA-2 West Nile IgM Capture Test durchgeführt, der nur für WNV spezifisch ist und Kreuzreaktionen ausschließen kann, aber nur IgM nachweist. Das bedeutet, dass wir nur eine kürzlich erfolgte Infektion feststellen können und keine IgG-Antikörper nachweisen können. ELISA-3 wurde verwendet, um die mit ELISA-1 erzielten Ergebnisse zu bestätigen, und die Ergebnisse wurden in 100 % der Fälle bestätigt.

In unserer Studie wurden positive Ergebnisse mit Serumproben von Wildvögeln, die mit den ELISAs gewonnen wurden, durch einen Virus-Mikroneutralisationstest bestätigt. Darüber hinaus wurden im ELISA bei 14 von 42 Serumproben von Patienten mit Symptomen von Meningitis, lymphozytärer Meningitis und zeckenübertragener Enzephalitis WNV-Antikörper nachgewiesen, aber wir konnten die erhaltenen Ergebnisse nicht mit dem Plaquereduktionsneutralisationstest (PRNT) verifizieren. WNV-Infektionen beim Menschen und der Nachweis von WNV in der Zerebrospinalflüssigkeit wurden in der Regel durch RT-PCR, Nested PCR oder in formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem menschlichem Gewebe durch RT-PCR bestätigt. Nach der Studie von Czupryna et al. waren alle Liquorproben von 24 Patienten, die in der Abteilung für Infektionskrankheiten und Neuroinfektionen der Medizinischen Universität Bialystok behandelt wurden, negativ für WNV-RNA.

Serumproben von Menschen, Vögeln und Pferden wurden als geeignete Proben für die Bestimmung spezifischer WNV-Antikörper verwendet. Wurden die spezifischen Antikörper in Serumproben bestätigt, wurde davon ausgegangen, dass das Tier oder der Mensch mit dem Virus in Kontakt gekommen war (in Polen oder außerhalb des Landes). Es wird angenommen, dass positive Wildvögel mit dem Virus außerhalb des Landes in Kontakt gekommen sein könnten. Was die positiven Proben von Menschen betrifft, so haben 11 Patienten das Land nie verlassen, d. h. sie mussten bereits in Polen mit dem Virus in Kontakt gekommen sein. Dasselbe gilt für die Pferde, die laut ihrer Reisegeschichte das Land nie verlassen haben.

Auf der Grundlage der epidemiologischen Situation in Europa, der Rolle von Wildvögeln bei der WNV-Übertragung und der Ergebnisse früherer serologischer Untersuchungen von Menschen und Vögeln ist das Auftreten von WNV in Polen möglich. In Polen wurden WNV-Antikörper bei fiebrigen Frauen und bei gesunden Waldarbeitern aus den Regionen Swietokrzyskie (28,85 %) und Podlaskie (34,14 %) nachgewiesen. Unsere serologischen Ergebnisse lassen darauf schließen, dass das Virus in unserer Klimazone und in unserem Ökosystem bereits vorhanden ist. Die Möglichkeit einer Kreuzreaktion mit Viren der durch Zecken übertragenen Enzephalitis und endemischen Krankheiten sollte in Betracht gezogen werden.

Ethische Genehmigung

Die Studie wurde von der II. lokalen Ethikkommission in Lublin genehmigt (Nummer 92/2010 vom 16. November 2010) und erhielt die Genehmigung des Generaldirektors für Umweltschutz (Nummer DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł).

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung durch das Rahmenprojekt P/020, Freilebende Wasservögel als Reservoir und Vektor bei der Ausbreitung von Viruskrankheiten, und das Rahmenprojekt W/211, Entwicklung von Diagnosemethoden und Risikobewertung des Auftretens von West-Nil-Virus-Infektionen bei Vögeln in Polen (2014-2018).