Principles of whole genome bisulfite sequencing

Epigenetische Studien haben bestätigt, dass die DNA-Methylierungsmodifikation bestimmter Genregionen eine wichtige Rolle bei der Chromosomenkonformation und der Regulierung der Genexpression spielt. Die Methylierung von DNA-Cytosinresten am C5 (5meC) ist eine häufige epigenetische Markierung in vielen Eukaryonten und kommt häufig in CpG oder CpHpG (H=A, T, C) vor. Es gibt hauptsächlich drei Ansätze, darunter Endonuklease-Verdau, Affinitätsanreicherung und Bisulfit-Umwandlung (Tabelle 1). Fast alle sequenzspezifischen DNA-Methylierungsanalyseverfahren erfordern eine methylierungsabhängige Behandlung vor der Amplifikation oder Hybridisierung, um die Zuverlässigkeit zu gewährleisten. Anschließend werden verschiedene molekularbiologische Techniken wie die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) durchgeführt, um 5meC-Reste nachzuweisen.

Tabelle 1. Hauptprinzipien der NGS-basierten Methylierungsanalyse.

*MCA: Methylated CpG Island Amplification; *HELP: HpaII tiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR; *MSCC: methylation-sensitive cut counting; *MeDIP-seq: methylated DNA immunoprecipitation; *MIRA: methylated CpG island recovery assay; *RRBS: reduced representation bisulfite sequencing; *WGBS: whole genome bisulfite sequencing; *BSPP: bisulfite padlock probes.

Die Bisulfit-Umwandlung löste in den 1990er Jahren eine Revolution in der Methylierungsanalyse des Genoms aus. Da Bisulfit unmethylierte Cytosine im Genom in Uracil umwandeln kann, die dann während der PCR-Amplifikation durch Thymin ersetzt werden, können diese von den ursprünglich durch Methylierung modifizierten Cytosinen unterschieden werden, indem Cytosine und Thymine für jede Position nach der Sequenzierung gezählt werden (Abbildung 1). Die Ganzgenom-Bisulfit-Sequenzierung (WGBS), eine Forschungsmethode von großer Bedeutung auf diesem Gebiet, wendet eine Kombination aus Bisulfit-Behandlung und Sequenzierungstechnologien der nächsten/dritten Generation (meist Shotgun-Sequenzierung) an, um die DNA-Methylierung auf genomischer Ebene zu untersuchen.

Abbildung 1. Bisulfit-Konvertierung und PCR-Amplifikation vor der DNA-Sequenzierung.

Vorteile der Ganzgenom-Bisulfit-Sequenzierung

• Ermöglicht genomweite Methylierungsprofile auf Einzelbasenebene.
• Messung des Methylierungsstatus fast aller CpG-Loci, einschließlich intergenischer „Genwüsten“, partieller Methylierungsdomänen und entfernter regulatorischer Elemente.
• Aufdeckung der absoluten DNA-Methylierungsgrade und des Methylierungssequenzhintergrunds

Arbeitsablauf der Ganzgenom-Bisulfit-Sequenzierung

Kurz gesagt, umfassen die grundlegenden Schritte der Ganzgenom-Bisulfit-Sequenzierung (WGBS) die DNA-Extraktion, die Bisulfit-Konvertierung, die Bibliotheksvorbereitung, die Sequenzierung und die bioinformatische Analyse. Hier verwenden wir Illumina HiSeq als Beispiel, um den Arbeitsablauf der WGBS zu veranschaulichen.

Abbildung 2. Der Arbeitsablauf der Ganzgenom-Bisulfit-Sequenzierung (Khanna et al. 2013).

• DNA-Extraktion

Zunächst werden ca. 1-5 mg Gewebeproben, die von Menschen, Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen gesammelt wurden, für die DNA aufbereitet. Im Allgemeinen müssen die Proben für die Ganzgenom-Bisulfit-Sequenzierung die folgenden vier Merkmale erfüllen:

i. Eukaryoten;

ii. Hypomethylierung (wie in Abbildung 3 dargestellt, haben Studien gezeigt, dass die Sequenzierdaten von WGBS abzunehmen beginnen, sobald die Anzahl der CpG-Stellen in einer Region zunimmt);

iii. Das Referenzgenom wurde mindestens bis zur Gerüstebene assembliert;

iv. Relativ vollständige Genomannotationen. Anschließend wird ein geeignetes Kit zur Extraktion hochreiner und hochmolekularer DNA verwendet. Die extrahierte DNA sollte eine Masse von nicht weniger als 5 μg, eine Konzentration von nicht weniger als 50 ng/ul und eine OD260/280 von 1,8 bis 2,0 aufweisen.

Abbildung 3. Die herkömmliche WGBS-Technologie hat eine geringe Abdeckung der Methylierungsstellen (Raine et al. 2016)

• Bisulfit-Konvertierung

Die Isulfit-Konvertierung gilt als „Goldstandard“ für die DNA-Methylierungsanalyse, die Prinzipien sind in Abbildung 4 dargestellt. Bei dieser Methode kann der BS-induzierte DNA-Abbau zu einer Verarmung von genomischen Regionen führen, die mit unmethylierten Cytosinen angereichert sind. Daher ist es wichtig, das Ausmaß des DNA-Abbaus unter den Reaktionsbedingungen zu bewerten, und es sollte auch berücksichtigt werden, wie sich dies auf das gewünschte Amplikon auswirkt. Olova et al. (2018) fanden heraus, dass der DNA-Abbau bei Bisulfit-Konversionsprotokollen, die eine hohe Denaturierung oder eine hohe Bisulfit-Molarität verwenden, stark ist. Es sind mehrere Kits auf dem Markt erhältlich (Tabelle 2).

Abbildung 4. Bisulfit-vermittelte Desaminierung von Cytosin (Hayatsu et al. 2004).

Tabelle 2. Protokolle und Parameter der Bisulfitumwandlung.

• Bibliotheksvorbereitung

Beispielhaft sei hier das EpiGnomeTM Methyl-Seq Kit (Epicentre) genannt (wie in Abbildung 5 dargestellt), Bisulfit-behandelte einzelsträngige DNA wird mit einer Polymerase, die Uracil-Nukleotide lesen kann, random-primed, um DNA zu synthetisieren, die eine spezifische Sequenzmarkierung enthält. Das 3′-Ende des neu synthetisierten DNA-Strangs wird dann selektiv mit einer zweiten spezifischen Sequenz markiert, so dass ein DNA-Molekül mit zwei Markern mit einer bekannten Sequenzmarkierung am 5′- und 3′-Ende erhalten werden kann. Die Illumina P7- und P5-Adapter werden anschließend vor der DNA-Sequenzierung durch PCR am 5′- und 3′-Ende hinzugefügt.

Abbildung 5. Arbeitsablauf für das EpiGnomeTM Methyl-Seq Kit.

• Sequenzierung

Die Hiseq-Sequenzierungstechnologie, eine neuartige Sequenzierungsmethode, die auf Sequenzierung durch Synthese (SBS) basiert, wird häufig für WGBS eingesetzt. Die Brückenamplifikation auf einer Durchflusszelle wird durch die Verwendung eines Einzelmolekül-Arrays erreicht. Da mit der neuen reversiblen Blockierungstechnik jeweils nur eine Base synthetisiert und das Fluorophor markiert werden kann, wird der entsprechende Laser zur Anregung des Fluorophors verwendet, und das Anregungslicht kann zum Auslesen der Baseninformation eingefangen werden. Die Paired-End-Strategie (150 bp) wird in der Regel bei WGBS eingesetzt, um 250-300 bp-Insertions-Bisulfit-behandelte DNA-Bibliotheken zu sequenzieren. Neben Illumina HiSeq werden auch PacBio SMRT, Nanopore, Roche 454 und andere Illumina-Plattformen für diesen Zweck verwendet.

• Datenanalyse

Eine Reihe von Analysen kann für die Sequenzierergebnisse durchgeführt werden. Die fünf wichtigsten Arten der Informationsanalyse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Darüber hinaus können eine Analyse der Methylierungsdichte, eine Analyse der differenziell methylierten Regionen (DMR), eine DMR-Annotation und eine Anreicherungsanalyse (GO/KEGG) sowie eine Clustering-Analyse durchgeführt werden. Zu den gängigen bioinformatischen Ressourcen von WGBS gehören BDPC, CpGcluster, CpGFinder, Epinexus, MethTools, mPod, QUMA und TCGA Data Portal.

Tabelle 3. Haupttypen der WGBS-Datenanalyse.

Dienstleistungen:

Ganzgenom-Bisulfit-Sequenzierung

Gezielte Bisulfit-Sequenzierung

ChIP-seq

Reduced Representation Bisulfite Sequencing

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