B Photorezeptoren

Photorezeptorendegenerationen sind die häufigste Form der Erblindung in der westlichen Welt und beinhalten den Verlust des Sehvermögens aufgrund der Dystrophie und/oder des Absterbens von retinalen Photorezeptoren. Diese Pathologien lassen sich grob unterteilen in solche, die zunächst die Stäbchenphotorezeptoren betreffen, wie Retinitis pigmentosa (RP), und solche, die zunächst die Zapfenphotorezeptoren betreffen, wie die Makuladegeneration.141 Die Degeneration der Photorezeptoren kann zwar auch indirekt durch primäre Defekte im RPE verursacht werden, das eine wichtige Funktion für die Gesundheit und Homöostase der Photorezeptoren hat, aber dieses Thema wird in einem späteren Abschnitt behandelt (siehe Abschnitt II.C).

Photorezeptoren sind stark polarisierte Sinneszellen, die aus einem inneren Segment (IS) bestehen, das durch ein stark modifiziertes Cilium mit einem äußeren Segment (OS) verbunden ist (Abb. 5).189 In reifen Photorezeptoren werden Proteine, die für das Wachstum und die Aufrechterhaltung der Photorezeptor-OS sowie für die Phototransduktion erforderlich sind, entlang polarisierter Mikrotubuli vom basalen IS zum apikalen OS transportiert. Photorezeptoren ähneln Epithelzellen insofern, als ihre Oberfläche durch Zellverbindungen in apikale und basolaterale Bereiche unterteilt ist. Ihre Zentrosomen befinden sich an der apikalen Oberfläche, während ihre Kerne basal liegen.190 Die korrekte Entwicklung und anschließende Aufrechterhaltung der Photorezeptoren von Wirbeltieren hängt von der Etablierung der korrekten apikal-basalen Polarität sowie von der Funktion der Transportmaschinerie ab. Es überrascht daher nicht, dass von den mehr als 100 genetischen Loci, von denen bekannt ist, dass sie Photorezeptorendegenerationen bei Wirbeltieren verursachen, die meisten die Struktur und Funktion des OS beeinflussen.191

Abbildung 5. Struktur der Stäbchen- und Zapfenphotorezeptoren. Photorezeptorzellen bestehen aus einem äußeren Segment, das an Sehpigment gebundene Membranscheiben enthält. Das innere Segment ist der polarisierte Zellkörper des Photorezeptors, in dem der Kern basal liegt und das Cilium apikal entspringt und sich in das OS erstreckt. Das synaptische Terminal bildet synaptische Verbindungen zu den Interneuronen der Retina und leitet den visuellen Input weiter.161,188

Genetische Screens in Zebrafischen haben Licht auf die molekularen Grundlagen dieser zellulären Funktionen geworfen, indem Mutanten isoliert wurden, bei denen die Photorezeptorenentwicklung und/oder -erhaltung defekt ist.24,192,193 Eine solche Mutante, Mosaikaugen (moe), weist erweiterte apikale Merkmale in den Photorezeptoren auf.20,21 Der moe-Locus kodiert für ein FERM-Domäne enthaltendes Protein, das einen Komplex mit Crumbs-Proteinen bildet, die sich wiederum als entscheidend für die apikal-basale Polarität in Drosophila und Wirbeltieren erwiesen haben.194-196 Interessanterweise werden Mutationen im menschlichen Ortholog von Crumbs, CRB1, mit retinalen Photorezeptordystrophien wie RP 12197 und der Leberschen kongenitalen Amaurose (LCA1; Ref. 198,199) in Verbindung gebracht. Andere Zebrafischmutanten wie nagie oko (nok) und heart and soul (has) kopieren nicht nur den Phänotyp der Moe-Mutante, sondern die von ihnen kodierten Proteine (Pals1 bzw. PKCi) interagieren auch biochemisch mit Moe.20 Darüber hinaus führt die Ausschaltung von crb2b, einem Zebrafisch-Crumbs-Paralogon, zu einer Verringerung der IS-Größe.14 Diese Studien haben daher begonnen, die Rolle des Crumbs-Komplexes bei der Entwicklung und Erkrankung von Photorezeptoren bei Wirbeltieren aufzudecken.

Die Ausbildung einer korrekten apikal-basalen Polarität hängt nicht nur von der ordnungsgemäßen Funktion der Zellpolaritätsdeterminanten ab, sondern auch von deren Transport und Lokalisierung. Photorezeptoren in der ale oko (ako)-Mutante akkumulieren die apikalen Determinanten Pals1 und PKCλ in ihren Zellkörpern und zeigen ein ausgedehntes Absterben der Photorezeptoren in der Spätphase der Entwicklung.19 Der ako-Locus kodiert für die p50-Untereinheit des Dynactin-Komplexes, der als Teil des Dynein-Motorkomplexes eine wichtige Rolle beim Transport von Ladung entlang der Mikrotubuli spielt.200 Bei einer anderen Mutante, mikre oko (mok), die eine Mutation in Dynactin-1 aufweist, ist die Netzhautdegeneration zumindest teilweise auf eine Fehllokalisierung der Photorezeptorkerne zurückzuführen. Überraschenderweise sind im Gegensatz zu ako-Mutanten apikale Determinanten wie Crumbs und aPKCλ nicht fehlgelagert, was darauf hindeutet, dass die Degeneration in diesen Mutanten nicht auf einen Verlust der Zellpolarität zurückzuführen ist. Eine experimentelle Fehllokalisierung des Zellkerns durch die Überexpression des Dynein-Motors führte zum Absterben von Photorezeptorzellen, was die Rolle der Kernposition für das Überleben der Photorezeptoren untermauert.201 Während Defekte der Kernpositionierung in Mok-Photorezeptoren eine zellautonome Rolle zu haben scheinen, scheinen auch andere, nicht zellautonome Komponenten eine Rolle bei der Mok-Degeneration zu spielen. Mosaikanalysen haben gezeigt, dass mutierte Photorezeptoren eine mehr als 2,5-fache Überlebensrate aufweisen, wenn sie in einer Wildtyp-Umgebung platziert werden.17 Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Gesundheit und das Überleben der Photorezeptoren von Umgebungseinflüssen der umgebenden Zellen abhängen. Diese Ergebnisse stimmen mit den Defekten überein, die bei einigen menschlichen Degenerationen auftreten, wie z. B. bei der RP, bei der ein anfänglicher Defekt im stäbchenspezifischen Rhodopsin schließlich zum Verlust sowohl der Stäbchen als auch der Zapfen führt.202

Der Transport vom Zellkörper zum OS ist auch wichtig, um OS-Komponenten zu ersetzen, die durch die ständige Phagozytose von Photorezeptor-OS durch das darüber liegende RPE verloren gehen.203 In Photorezeptoren, wie auch in Zilien, erfolgt der Transport durch einen Prozess, der als Intraflagellarer Transport (IFT) bekannt ist, und Mutationen in IFT-Komponentengenen wie ift57, ift80, ift88 und ift172 führen zu OS-Atrophie und/oder zum vollständigen Verlust von OS in Zebrafischen.2426 Mutationen im Elipsa-Gen, das für ein Protein kodiert, von dem man annimmt, dass es die IFT erleichtert,35 führen zu einem frühen Verlust der Photorezeptoren,22 während Morpholino-Knockdown mehrerer Untereinheiten des retrograden IFT-Motors Dynein-2 die Bedeutung der IFT für die ordnungsgemäße Dehnung des OS und die Sehfunktion hervorgehoben hat.204 Degenerationen der Photorezeptoren, die mit einer defekten IFT zusammenhängen, sind einige der vielen zilienbezogenen Phänotypen, die mit dem Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) in Verbindung gebracht werden,205 und die weitere Untersuchung der Funktion der IFT-Komponenten im Zebrafisch könnte sich als hilfreich erweisen, um ein besseres Verständnis der molekularen Ursachen zu erlangen, die den mit dem BBS verbundenen Augenpathologien zugrunde liegen.

Während die bisher in diesem Abschnitt beschriebenen Mutanten in genetischen Screens isoliert wurden, bei denen hauptsächlich histologische Methoden zum Nachweis von Photorezeptordefekten eingesetzt wurden, wurden andere in Verhaltens-Screens isoliert.15,82,206,207 Bei einem solchen Screening wurde die Fähigkeit des Zebrafisches ausgenutzt, bereits ab 3 dpf (Tage nach der Befruchtung) ein vom Sehvermögen abhängiges Verhalten zu zeigen. Brockerhoff et al.15 verwendeten zunächst den Optokinetic Response Assay (OKR) an mutierten Embryonen, um Defekte in der Sehfunktion festzustellen. In einem zweiten Test wurden Elektroretinogramm (ERG)-Aufzeichnungen durchgeführt, um festzustellen, ob einzelne Mutationen die Funktion der äußeren Netzhaut beeinträchtigen. Aus diesem Screening wurden 18 Mutanten isoliert, bei denen eine verminderte Sehfunktion festgestellt wurde. Eine davon, no optokinetic response a (noa), wies im Alter von 5 dpf (Tage nach der Befruchtung) keine groben Anomalien der Photorezeptoren auf, war aber blind, lethargisch und starb vorzeitig. Die Analyse der noa-Mutation ergab einen Mangel an einer Untereinheit des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (PDH), der die Energieproduktion in den Zellen steuert. Die Noa-Mutantenlinie wurde als Modell für die Untersuchung des PDH-Mangels (OMIM 245348) verwendet, einer menschlichen Erkrankung, die wie das Zebrafischmodell zu Blindheit, neurologischen Defekten und frühem Tod führt.16 Da die derzeitigen Behandlungen des PDH-Mangels beim Menschen nur begrenzt erfolgreich waren, verwendeten Taylor et al. die Noa-Mutanten, um eine ketogene Diät zu testen, die bei einer begrenzten Anzahl menschlicher Patienten einige Erfolge bei der Linderung der PDH-Mangelsymptome gezeigt hat. Durch die Verabreichung dieser speziellen Diät wurde das normale Verhalten der Noa-Mutanten wiederhergestellt, was das Potenzial der Untersuchung von PDH-Mangel-Therapien in der Noa-Mutantenlinie unterstreicht.

Bei einer anderen Mutante, no optokinetic response f (nof), wurde eine Mutation in der α-Untereinheit des Zapfentransducins (Tcα), einem für die Phototransduktion erforderlichen G-Protein, festgestellt. Bei menschlichen Patienten, die an der so genannten Achromatopsie (OMIM 139340) leiden, sind Mutationen in Tcα für den Verlust des Farbensehens verantwortlich. Bei nof-Mutanten verläuft die Entwicklung der Zapfen normal; sie sind jedoch bis zu 1000-mal weniger lichtempfindlich, wie durch Ableitungen einzelner Photorezeptoren festgestellt wurde. Eine ausführliche Analyse der Lichtreaktionen der Zapfen ergab, dass die restliche Phototransduktion lichtabhängig, aber unabhängig von Transducin ist. Der Ca+ 2 -Einstrom, der für die Lichtanpassung der Photorezeptoren wichtig ist und von dem man bisher annahm, dass er durch Transducin gesteuert wird, war in nof-Mutanten noch nachweisbar. Diese Studie zeigte daher, dass ein Teil des Ca+ 2 -Einstroms in den Zapfenphotorezeptoren möglicherweise unabhängig von Transducin ist.

In einem separaten Screening wurden dominante Mutationen, die eine Degeneration der Photorezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen verursachen, durchgeführt, um genetische Mutanten zu isolieren, die später zur Untersuchung der beim Menschen vererbten Nachtblindheit, wie z. B. der RP, verwendet werden könnten.37,38 Im Falle der RP liegen dieser Gruppe von Störungen viele genetische Loci zugrunde. Allerdings war zum Zeitpunkt der Untersuchung nur etwa die Hälfte der Fälle von dominanter RP mit spezifischen Mutationen verbunden.38 Li et al. untersuchten daher mutierte erwachsene Zebrafische, indem sie eine bekannte Fluchtreaktion der Fische nutzten. Das Ausbleiben einer solchen Reaktion auf einen bedrohlichen Hinweis wurde als Verlust des Sehvermögens interpretiert, was später durch ERG-Aufnahmen bestätigt wurde. Insgesamt wurden sieben heterozygote Mutanten isoliert (Nachtblindheit a, b, c, d, e und f), von denen sechs eine Degeneration der Photorezeptoren aufwiesen.38,39,208,209 Vier der sechs waren als Homozygote embryonal letal, was darauf hindeutet, dass die mutierten Gene, die den Photorezeptor-Phänotypen zugrunde liegen, während der Embryonalentwicklung andere wichtige Funktionen haben. Dieser Befund unterstreicht die Bedeutung solcher Screens für die Identifizierung dominanter Mutationen, die bei herkömmlichen Screenings aufgrund der frühen embryonalen Letalität nicht ohne weiteres isoliert werden könnten.