Messbare Auswirkungen von Wnt3a auf die Proliferation von HEK293T-Zellen hängen vom verwendeten Assay ab
Abstract
Der Wnt-Signalweg wird mit vielen wichtigen Zellprozessen in Verbindung gebracht. In dieser Studie werden die Auswirkungen des Wnt-Signalwegs auf die Proliferation von kultivierten HEK293T-Zellen untersucht. Die Zellen wurden mit Wnt3a inkubiert, und die Aktivierung des Wnt-Signalwegs wurde durch die Analyse der Konzentration des β-Catenin-Proteins und der Expressionsniveaus der Zielgene MYC und CCND1 verfolgt. Der Spiegel des β-Catenin-Proteins stieg um das Vierfache an. Während die mRNA-Werte von c-Myc und Cyclin D1 nur geringfügig zunahmen, stiegen die Proteinwerte bis zum Faktor 1,5. Bemerkenswerterweise zeigten MTT- und BrdU-Assays unterschiedliche Ergebnisse bei der Messung der Proliferationsrate von Wnt3a-stimulierten HEK293T-Zellen. In den BrdU-Assays konnte ein Anstieg der Proliferationsrate festgestellt werden, der mit der applizierten Wnt3a-Konzentration korrelierte. In den MTT-Assays konnte diese Korrelation hingegen nicht nachgewiesen werden. Die MTT-Ergebnisse, die auf der mitochondrialen Aktivität beruhen, wurden durch die Analyse des Succinatdehydrogenase-Komplexes mittels Immunfluoreszenz und Western Blotting bestätigt. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass Wnt3a die Proliferation von HEK293-Zellen aktiviert. Diese Effekte können durch die Messung der DNA-Synthese und nicht durch die Messung von Veränderungen der mitochondrialen Aktivität nachgewiesen werden.
1. Einleitung
Der Wnt-Signalweg spielt bekanntermaßen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der zellulären Differenzierung, Proliferation, des Überlebens und der Apoptose. Wnt-Proteine sind eine hochkonservierte Familie von sekretierten, lipidmodifizierten, cysteinreichen Glykoproteinen, die Signalkaskaden innerhalb der Zelle aktivieren, indem sie an ein Mitglied der Frizzled (Fz)-Familie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren auf der extrazellulären Matrix binden. Es gibt 19 Mitglieder von Wnts bei Vertebraten, die aufgrund ihrer Fähigkeit, das zytosolische β-Catenin zu stabilisieren, in zwei Hauptklassen eingeteilt werden können: den kanonischen und den nicht-kanonischen Weg. Neuere Arbeiten haben auch gezeigt, dass bestimmte Wnt-Liganden wie Wnt5a in der Lage sind, mehr als nur einen Wnt-Signalweg zu aktivieren, so dass die streng binäre Klassifizierung immer mehr überholt ist. Eine Fehlfunktion des Wnt-Signalwegs steht im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten wie Osteoporose, Morbus Crohn, Alzheimer, Schizophrenie und insbesondere Krebs.
Der Ligand Wnt3a gehört zum β-Catenin-abhängigen (kanonischen) Wnt-Signalweg, der an Frizzled-Transmembranrezeptoren bindet. Anschließend aktiviert der Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-Related-Protein 5 (LRP5) oder LRP6-Rezeptorkomplex zytoplasmatische Disheveled-Proteine, die die Hemmung der Glykogensynthase-Kinase 3β (GSK-3β) auslösen. Das Protoonkoprotein β-Catenin akkumuliert im Zytoplasma als Folge des Abbaus des Zerstörungskomplexes, der von Adenomatosis polyposis coli (APC), AXIN und GSK-3β gebildet wird. So kann β-Catenin in den Zellkern verlagert werden, wo es die Transkription von Zielgenen aktiviert, die durch den T-Zell-spezifischen Transkriptionsfaktor (TCF)/Lymphoid-enhancing factor (LEF) vermittelt wird. Diese Gene sind für die Regulierung wesentlicher physiologischer Prozesse in der Embryonal- und Erwachsenenentwicklung verantwortlich, wie z.B. Zellproliferation, Differenzierung, Morphogenese und Zelladhäsion.
Bei der Proliferation gibt es ein komplexes Zusammenspiel zwischen der kanonischen Wnt-Signalgebung und dem Zellzyklus. Der Wnt/β-Catenin-Signalweg ist maßgeblich an der Stimulierung der Progression der G1-Phase beteiligt, indem er GSK-3β hemmt, das Effektoren des Zellzyklus und Wachstumsregulatoren reguliert.
Ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs ist das Protoonkogen MYC, das als Wnt-Ziel in Dickdarmkrebszellen identifiziert wurde. Der Transkriptionsregulator c-Myc steuert viele Zellfunktionen, insbesondere die Regulierung der Zellzyklusprogression. Das Cyclin D1 kodierende Gen CCND1 ist ebenfalls ein Zielgen des Wnt/β-Catenin-Wegs, das in Dickdarmkrebszellen beschrieben wurde. Cyclin D1 steuert als Aktivator der Cyclin-abhängigen Kinase (cdk) 4 oder cdk 6 den G1/S-Phasenübergang.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, die durch Wnt3a induzierte Zellproliferation zu messen. Eine nicht-radioaktive Methode ist ein Immunoassay, der auf dem Einbau von 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) in die DNA basiert, um die DNA-Synthese zu bestimmen, die mit dem Übergang in die S-Phase und damit mit der Zellproliferation korreliert. Eine weitere Methode ist die Messung der mitochondrialen Aktivität lebensfähiger Zellen. Beim MTT-Assay wird durch mitochondriale Dehydrogenasen durch Reduktion von MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) ein unlösliches blaues Formazanprodukt erzeugt.
In dieser Studie untersuchten wir die Proliferation von HEK293T-Zellen unter dem Einfluss von Wnt3a-Liganden sowohl mit dem MTT- als auch mit dem BrdU-Assay. Außerdem vergleichen wir die Ergebnisse dieser Assays mit der mitochondrialen Aktivität der mit Wnt3a behandelten Zellen, die durch Immunfärbung des Elektronentransportkettenproteins SDHA (Succinatdehydrogenase-Komplex-Untereinheit A) gemessen wurde.
2. Materialien und Methoden
2.1. Zellen und Zellkultivierung
Die humanen embryonalen Nierenzellen HEK293T wurden in Dulbecco’s modifiziertem Eagle’s Medium (DMEM) kultiviert, das mit 10% fötalem Rinderserum (PAN Biotech, Aidenbach, Deutschland), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren und 1% Penicillin/Streptomycin (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) bei 37°C und 5% CO2 ergänzt wurde.
2.2. Proliferationsassays
MTT- und BrdU-Assays wurden auf 96-Well-Platten durchgeführt. Zehntausend Zellen wurden pro Vertiefung ausgesät, und die Zellen wurden mit steigenden Dosen von Wnt3a (R&D Systems, Minneapolis, USA), nämlich 0, 10, 50, 100, 150 und 200 ng/mL, für 24, 48 und 72 Stunden stimuliert. MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) wurde in PBS zu 5 mg/mL gelöst, und 20 μL der MTT-Lösung wurden in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer dreistündigen Inkubation bei 37°C und 5% CO2. Anschließend wurde das Medium mit MTT herausgeschnippt und 200 μl DMSO hinzugefügt. Um die Kristalle aufzulösen, wurden die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Platten wurden mit einem ELISA-Lesegerät (Tecan Group Ltd., Männedorf, Schweiz) bei 590 nm ausgelesen. Für den BrdU-Assay wurde ein kommerzieller Kit „Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric“ (Roche, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Nach Zugabe der BrdU-Markierungslösung wurden die Zellen drei Stunden lang bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach dem letzten Waschschritt wurden 100 μl/Vertiefung Substratlösung zu den Zellen gegeben, und die Reaktion wurde nach 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur mit Schwefelsäure gestoppt. Die Platten wurden sofort mit einem ELISA-Lesegerät bei 450 nm ausgelesen. Alle Assays wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt (). Zur Kalibrierung wurden die Zellen in unterschiedlicher Anzahl (0,1 × 104 bis 3 × 104) ausgesät.
2.3. Immunzytochemie und Fluoreszenzmikroskopie
HEK293T-Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät und bei einer Konfluenz von 30 % mit 0-200 ng/mL Wnt3a behandelt und nach 24, 48 und 72 h in 4 % Formaldehyd fixiert. Der SDHA-Antikörper (Abcam, Cambridge, UK) in einer Verdünnung von 1 : 200 wurde zugegeben und die Zellen wurden eine Stunde lang inkubiert. Die Zellkerne wurden 5 Minuten lang mit DAPI gegengefärbt. Die Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie (Observer. Z1 von Zeiss, Jena, Deutschland) und der zugehörigen Software AxioVision 4.7.
2.4 analysiert. Protein-Gelelektrophorese und Western Blot
Mit Hilfe des Bradford-Assays wurden die Proteinkonzentrationen in Ganzzell-Lysaten bestimmt. Gleiche Proteinmengen wurden auf SDS-Polyacrylamid-Gele (NuPAGE, 4-12%, Life Technologies, Carlsbad, USA) geladen. Die Gele wurden 1 Stunde lang bei 150 V betrieben und mit dem iBlot System (Life Technologies) auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden mit primären Antikörpern gegen SDHA, β-Catenin, c-Myc, Cyclin D1 und β-Actin (Cell Signaling, Cambridge, UK), verdünnt im Verhältnis 1:1000 in TBS-Tween mit 3% Milch, analysiert, gefolgt von einer Inkubation mit einem geeigneten Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörper (Verdünnung 1:2000). Die Proteinbanden wurden mit ECL-Detektion sichtbar gemacht.
2.5. RNA-Isolierung und RT-PCR
Total RNA wurde mit NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) isoliert und 1 μg RNA wurde mit Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland) in einem Volumen von 40 μL revers transkribiert. Die Sequenzen der für die semiquantitative reverse Transkriptase-PCR verwendeten Primer (MWG, München, Deutschland) lauten für GAPDH 5′-catggtgctgagatttgccaac-3′ (vorwärts) und 5′-tcaacacacctgaccttctcatcac-3′ (rückwärts), für MYC 5′-ccgagcaaggacgcgactctc-3′ (vorwärts) und 5′-gcctttcagagaagcgggtcct-3′ (rückwärts), und für CCND1 5′-gcctgaacctgaggagcccca-3′ (vorwärts) und 5′-gtcacacttgatcactgg-3′ (rückwärts). Die PCR-Amplifikation wurde mit My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Deutschland) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Reaktion wurde mit einer einleitenden Denaturierung für 2 Minuten bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen mit Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Annealing bei 55°C (CCND1), 57°C (GAPDH) oder 60°C (MYC) für 30 Sekunden und Verlängerung bei 72°C für 1 Minute. Der letzte Verlängerungsschritt dauerte 10 Minuten bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 1,5%igen Agarosegel analysiert.
2.6. Datenanalyse
Microsoft Excel Software wurde für das Datenmanagement verwendet, einschließlich der Berechnung der Standardabweichungen. Western Blots und Agarosegele wurden mit dem Gel-Dokumentationssystem Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Deutschland) gescannt. Die Banden wurden mit der Software ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, USA) quantifiziert.
3. Ergebnisse
3.1. Auswirkungen von Wnt3a auf die Induktion von β-Catenin und typischen Wnt-Zielgenen
Um die Aktivierung des Wnt-Signalwegs nachzuweisen, haben wir die β-Catenin-Proteinkonzentration in HEK293T-Zellen nach Behandlung mit Wnt3a bestimmt (Abbildung 1). Nach 24-stündiger Behandlung stieg die β-Catenin-Proteinkonzentration mit zunehmender Konzentration von Wnt3a an. Die höchste β-Catenin-Proteinkonzentration wurde nach 24 Stunden bei einer Konzentration von 200 ng/mL Wnt3a festgestellt. Hier zeigte die Quantifizierung einen vierfachen Anstieg im Vergleich zur Kontrolle. Zu den Zeitpunkten 48 und 72 Stunden nach der Behandlung ist der Effekt der β-Catenin-Induktion nicht mehr eindeutig zu erkennen. Weiterhin haben wir die Regulation der Wnt-Zielgene CCND1 und MYC nach Behandlung mit Wnt3a sowohl mittels semiquantitativer RT-PCR als auch mittels Western Blot analysiert (Abbildungen 2 und 3). In unbehandelten Zellen wurde ein basales Niveau von c-Myc und Cyclin D1 festgestellt. Die Ergebnisse der RT-PCR zeigten marginale Veränderungen in der Menge an MYC cDNA und eine Induktion von CCND1 nach 24 und 48 Stunden mit 10 ng/mL Wnt3a sowie nach 72 Stunden mit einer Konzentration von 100-200 ng/mL Wnt3a. Ein leicht erhöhter Proteingehalt von c-Myc wurde bei einer Konzentration von 50 ng/mL nach 24 Stunden beobachtet. Die Western-Blot-Quantifizierung von Cyclin D1 zeigte einen Anstieg um den Faktor 1,5 bei einer Wnt3a-Konzentration von 50 bis 200 ng/mL nach 24 Stunden. Der Proteingehalt von c-Myc stieg in gleicher Weise mit der Konzentration von 50 ng/mL Wnt3a nach 24 Stunden an.
3.2. Zellproliferationstests
Um die Auswirkungen von Wnt-Proteinen auf das Zellwachstum zu untersuchen, wurden HEK293T-Zellen 24 Stunden lang in 96-Well-Platten gezüchtet, bevor sie mit Wnt3a-Proteinkonzentrationen von 0, 10, 50, 100, 150 bzw. 200 ng/mL behandelt wurden. Nach 24, 48 und 72 Stunden Inkubation wurden MTT- und BrdU-Assays durchgeführt. Die BrdU-Assays zeigen einen klaren Trend: Mit zunehmender Wnt3a-Konzentration nahm die zugehörige Anzeige zu (Abbildung 4(a)), wobei Wnt3a nach 48 Stunden und einer Konzentration von 200 ng/mL die höchste Wachstumsrate anzeigt.
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(b)
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(b)
Im Gegensatz zu den BrdU-Assays zeigten die MTT-Assays keine Korrelation zwischen Wnt-Konzentrationen und Zellzahlen. Die Zellzahlen blieben alle etwa gleich oder nahmen im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen ab (siehe Abbildung 4(b)).
3.3. Mitochondriale Aktivität
Um die Rolle von Wnt3a in Bezug auf die mitochondriale Aktivität in HEK293T-Zellen weiter zu untermauern, wurden die Mengen an SDHA-Protein durch Western Blot sowie durch immunzytochemische Analyse bestimmt. Succinat-Dehydrogenase (SDH) mit ihrer Untereinheit SDHA ist eine Schlüsselkomponente des Zitronensäurezyklus, die an Komplex II der mitochondrialen Elektronentransportkette beteiligt und für die Übertragung von Elektronen von Succinat auf Ubichinon verantwortlich ist. Die Zellen wurden wie bei den Experimenten zur Proliferationsanalyse behandelt und wie oben beschrieben mit dem SDHA-Antikörper inkubiert. Die Ergebnisse (Abbildung 5) zeigten nach 24 Stunden Wnt3a-Behandlung einen Anstieg des Fluoreszenzsignals und auch ein intensiveres Signal im Western Blot im Vergleich zur Kontrolle. Nach 48 Stunden zeigten die durch Immunfluoreszenzmikroskopie oder Western-Blot-Analyse registrierten Proteinkonzentrationen keine signifikante Veränderung. Nach 72 Stunden Wnt3a-Behandlung wurde in beiden Experimenten sogar ein abnehmendes Signal beobachtet. Das höchste Signal wurde nach 24 Stunden mit 50 ng/mL Wnt3a gemessen.
(a)
(b)
(c)
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4. Diskussion
Wnt-Proteine sind an verschiedenen zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Regulierung der Genexpression für Zellzyklus und Proliferation. Wnt3a ist bekannt als Promotor der Proliferation und Migration menschlicher Linsenepithelzellen, auch für die Proliferation von Fibroblasten oder als Regulator der Proliferation von NIT-1-Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse. MYC und CCND1 sind Zielgene des Wnt-Signalweges in Säugetierzellen. So haben Yoon et al. in einem groß angelegten RNAi-Screening herausgefunden, dass der Wnt-Signalweg die mitochondriale Biogenese aktiviert; sie identifizierten Gene, die die mitochondriale Funktion beeinflussen, darunter auch MYC.
In dieser Arbeit haben wir die Auswirkungen von Wnt3a auf die Proliferation von HEK293T-Zellen bestimmt. Dazu haben wir zwei wichtige Assays verwendet, die für die Analyse der Proliferationsraten von kultivierten Zellen weit verbreitet sind, nämlich den MTT- und den BrdU-Assay. Dabei wurden die spezifischen Wirkungen der Wnt-Liganden auf die DNA-Synthese und die mitochondriale Aktivität direkt nachgewiesen und verglichen.
Um unser System zu etablieren und die Wirkung von Wnt3a auf den Wnt-Signalweg in HEK293T-Zellen nachzuweisen, zeigten wir die Induktion von β-Catenin nach 24 Stunden Wnt3a-Behandlung und analysierten die Expressionsniveaus von MYC und CCND1. Das Niveau der beiden Zielgene stieg ebenfalls nach 24 Stunden Wnt3a-Exposition an. C-Myc spielt eine Schlüsselrolle bei der Progression der G1-Phase; es regelt Cyclin D1 hoch und unterdrückt p21 und p27. Cyclin D1 wiederum fördert die Phosphorylierung und Hemmung des Retinoblastom-Komplexes (Rb), der wiederum den Cyclin-E-Spiegel hochreguliert. Die Anreicherung von Cyclin E führt zum Übergang des G1/S-Phasen-Kontrollpunkts.
Während der G1-Phase müssen die Mitochondrien eine große Menge an Energie liefern. Auf diese oxidative Phase folgt eine reduktive Periode während der S-/G2-/M-Phase des Zellzyklus, in der die Replikation der DNA und die Proliferation der Mitochondrien stattfinden.
Die Proliferationsraten der mit Wnt3a behandelten HEK293T waren unterschiedlich, wenn sie mit den beiden in dieser Studie verwendeten Assays gemessen wurden. Wir erklären den Unterschied durch die unterschiedlichen Nachweismechanismen der beiden Methoden. Der MTT-Assay misst die Aktivität der Mitochondrien, während der BrdU-Assay die relative Menge der neu synthetisierten DNA erfasst. Wagner et al. weisen in ihren Ergebnissen zur Proliferation von Hunde-Lymphozyten auf einen hochsignifikanten Zusammenhang zwischen BrdU und MTT hin, wobei sich der BrdU-Assay als empfindlicher erweist als der MTT-Assay. Die scheinbar negative Wirkung von Wnt3a auf die Zellzahl könnte durch einen Rückgang der mitochondrialen Aktivität erklärt werden. Der BrdU-Assay zeigte jedoch eine fördernde Wirkung auf die DNA-Synthese in diesen Zellen. Die Experimente zur mitochondrialen Aktivität zeigten, dass erst nach 24 Stunden Wnt3a-Behandlung der SDHA-Spiegel erhöht war. Die Aktivierung mit rekombinantem Wnt3a hat wahrscheinlich nach 48 Stunden oder später keinen Einfluss mehr auf die mitochondriale Aktivität. Auf diesen zeitlich begrenzten Effekt deutet das abnehmende Signal beim MTT-Test nach 48 und 72 Stunden hin. Dies wird auch durch die abnehmende Akkumulation von β-Catenin durch Wnt3a nach 24 Stunden bestätigt. Andere Publikationen stützen diese Annahme, dass mit Wnt3a behandelte Zellen nur während eines Zeitraums von 24 Stunden einen erhöhten β-Catenin-Spiegel aufweisen. Wir erklären unsere Ergebnisse, die im Gegensatz zur publizierten proliferierenden Wirkung von Wnt3a stehen, damit, dass die meisten Studien Wnt3a-überexprimierte Zellen, Wnt3a-konditioniertes Medium oder serum-starved Zellen mit rekombinantem Wnt-Protein zur Aktivierung des Wnt/β-Actin-Signalwegs verwendet haben.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse von BrdU- und MTT-Assays kaum vergleichbar sind, wenn es darum geht, die Auswirkungen von Wnt3a auf die Proliferationsrate von HEK293T-Zellen zu messen. Die Unterschiede lassen sich durch ihre unterschiedlichen Ansatzpunkte, nämlich die mitochondriale Aktivität und die DNA-Synthese, erklären. Um endgültige Aussagen über die Zellproliferationsrate zu machen, könnte die Interpretation der Ergebnisse einer einzigen Methode irreführend sein. Zur Bewertung der Zellproliferation würde die direkte Zählung der Zellen mit optischen Methoden die reale Situation am besten widerspiegeln. Es wäre interessant, die entsprechenden Ergebnisse mit den Resultaten biochemischer Assays wie BrdU und MTT zu vergleichen.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt in Bezug auf die Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.
Anerkennung
Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) finanziell unterstützt.