Isolation, Kultur und funktionelle Charakterisierung menschlicher embryonaler Stammzellen: Aktuelle Trends und Herausforderungen
Abstract
Humane embryonale Stammzellen (hESCs) besitzen ein großes Potenzial für die Behandlung verschiedener degenerativer Krankheiten. Pluripotente hESCs haben die große Fähigkeit, sich in Kultur unbegrenzt zu erneuern und sich in alle Zelltypen des Körpers zu differenzieren. Der Weg der hESC-Forschung ist nicht ganz reibungslos verlaufen, da sie mit mehreren Herausforderungen konfrontiert war, die sich nicht nur auf die Tumorbildung und die Immunabwehr beschränken, sondern auch soziale, ethische und politische Aspekte betreffen. Die Isolierung von hESCs aus dem menschlichen Embryo wird als höchst bedenklich angesehen, da sie die Zerstörung des menschlichen Embryos erfordert. Das Thema wurde sowohl in der Öffentlichkeit als auch auf Regierungsebene debattiert und diskutiert, was in vielen Ländern der Welt zu einem Verbot der hESC-Forschung führte. Das Verbot wirkte sich negativ auf den Fortschritt der hESC-Forschung aus, da viele Bundesregierungen auf der ganzen Welt die Finanzierung der Forschung einstellten. Später hoben einige Länder das Verbot auf und erlaubten die Finanzierung der hESC-Forschung, aber der Schaden für den Fortschritt der Forschung war bereits angerichtet. Unter diesen ungünstigen Bedingungen wurden dennoch einige Fortschritte bei der Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von hESCs mithilfe verschiedener Strategien erzielt. In dieser Übersicht haben wir verschiedene Strategien zusammengefasst, die zur erfolgreichen Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von hESCs eingesetzt werden. Schließlich versprechen hESCs ein großes Potenzial für klinische Anwendungen, wenn geeignete Strategien zur Minimierung der Teratombildung und der Immunabwehr sowie bessere Zelltransplantationsstrategien angewandt werden.
1. Embryonic Stem Cells: Frühe Entdeckung und Isolierungsverfahren
Embryonale Stammzellen (ESC) wurden erstmals 1981 aus Mäuseembryonen isoliert, und der Begriff „embryonale Stammzellen“ wurde erstmals von Gail R. Martin geprägt. Doch erst mit der bahnbrechenden Entdeckung im Jahr 1998, als Thomson und sein Team zum ersten Mal eine Technik zur Isolierung von hESC aus menschlichen Embryonen vorstellten, wurde die Welt auf ESC aufmerksam. Danach haben Forscher nachgewiesen, dass hESCs die Fähigkeit besitzen, sich in alle Körperzellen zu differenzieren, einschließlich der Betazellen der Langerhans-Inseln, Nervenzellen, Kardiomyozyten und hepatozytenähnlichen Zellen. Die pluripotenten Fähigkeiten von hESCs haben Millionen von Patienten, die an Diabetes, Parkinson, Herz-Kreislauf- und Lebererkrankungen leiden, Hoffnung gegeben. In Anbetracht des großen therapeutischen Potenzials von hESCs wurden weltweit mehrere hESC-Linien erzeugt. Eine der Herausforderungen im Zusammenhang mit hESC war die Methode zur Isolierung von Stammzellen aus dem menschlichen Embryo, da hESC nur aus der inneren Zellmasse (ICM) menschlicher Embryonen gewonnen werden können. Die Forscher berichteten, dass die innere Zellmasse entweder aus frischen oder gefrorenen menschlichen Embryonen gewonnen werden kann. Danach wurden mehrere Methoden entwickelt, um die ICM aus einem einzelnen menschlichen Embryo zu isolieren, darunter die mechanische Dissektion, bei der die ICM durch mechanischen Druck isoliert wird. Die ICM kann auch durch Laser-Dissektion und durch immunchirurgische Verfahren isoliert werden. Die Anwendung eines immunchirurgischen Verfahrens zur Isolierung der ICM hat verschiedene Vorteile, bringt aber auch einige Nachteile mit sich. So werden für das immunchirurgische Verfahren Kulturmedien benötigt, die Meerschweinchenserum enthalten. Aufgrund der Verwendung von tierischem Serum ist das immunchirurgische Verfahren daher nicht für die Gewinnung von hESC-Linien in klinischer Qualität geeignet. Bei einer anderen Methode können hESC-Linien aus dem ICM durch Mikrodissektion menschlicher Blastozysten mit feinen Nadeln isoliert werden. Die lasergestützte Biopsie ist auch die vielversprechendste Technik für die xenofreie Isolierung des ICM. Nach der ICM-Isolierung werden die Stammzellen gezüchtet, um mit Hilfe von Feederschichten, extrazellulären Matrizen, Proteinen, Peptiden und synthetischen Polymeren die WSZ zu erzeugen. Die Vor- und Nachteile der verschiedenen Methoden der ICM-Isolierung sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
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Die Isolierung von ICM erfordert die Zerstörung menschlicher Embryonen, was zu ernsthaften ethischen Bedenken geführt hat. Um die ethischen Bedenken auszuräumen, haben Forscher einen alternativen Ansatz zur Isolierung von hESCs aus einer einzelnen Blastomere gezeigt, ohne den menschlichen Embryo zu töten oder zu zerstören. So kann beispielsweise bei genetischen Präimplantationstests eine Embryobiopsie mit einer einzigen Blastomere von Patienten entnommen werden (Klimanskaya et al., 2009). Es wurde berichtet, dass 5 hESC-Linien erfolgreich aus einer einzigen Blastomer-Biopsie gewonnen wurden. Der Erfolg der Gewinnung von hESC guter Qualität hängt von der Qualität der Blastozysten, den Isolierungsverfahren und den Kulturbedingungen ab. Es wurde berichtet, dass 2 hESC-Linien aus 4 Blastozysten gewonnen wurden, während nur 3 hESC-Linien aus 13 Blastozysten und in einigen Fällen nur 3 hESC-Linien aus 58 Blastozysten isoliert werden konnten. Diese Unterschiede bei der Isolierung von hESC-Linien aus verschiedenen Blastozysten sind hauptsächlich auf die Qualität der Embryonen zurückzuführen und hängen auch von der Methode der Embryonenisolierung und den Kulturprotokollen ab. Wird ein Embryo beispielsweise durch eine In-vitro-Fertilisationsmethode gewonnen, ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass die Embryonen eine hohe Inzidenz postzygotischer Chromosomenanomalien aufweisen, was schließlich zu einer schlechten Qualität der hESCs führen kann.
Bei Mäusen können pluripotente Stammzellen auch aus dem Epiblast von Embryonen nach dem Implantationsstadium gewonnen werden, die allgemein als Epiblast-Stammzellen bekannt sind. Diese pluripotenten Stammzellen weisen Primed-Eigenschaften auf und sind für ihre Selbsterneuerung in hohem Maße von der Aktivierung der FGF- und Aktivin-Signalwege abhängig. Infolgedessen wurden bei Mäusen drei verschiedene pluripotente Zustände definiert, nämlich naive, primed und ground pluripotency conditions.
2. Kultivierung von hESCs mit oder ohne Feeder-Zellen
Nach der Entnahme der Blastomere wird diese normalerweise mit dem elterlichen Biopsie-Embryo in einem Medium kokultiviert, das Fibronektin und Laminin enthält. Die Zugabe von Laminin in das Kulturmedium ist wichtig für die Bildung von Aggregaten, die embryonalen Stammzellen (ESC) ähneln. Darüber hinaus gibt es Berichte, die darauf hindeuten, dass die Zugabe von serumfreien Medien und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren die Stammzellproliferation fördert und die Differenzierung embryonaler Stammzellen verhindert. Wir haben kurz verschiedene Kulturbedingungen beschrieben, die verwendet wurden, um sowohl die Qualität als auch die Quantität der Generierung von hESCs zu verbessern.
2.1. Mouse Feeder Cells to Grow hESCs
Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) Zellen oder Mouse Feeder Cells werden als die wichtigsten Elemente für hESCs angesehen, da MEF günstige Bedingungen für das Wachstum und die Expansion von hESCs bietet (Abbildung 1). Es wurde berichtet, dass MEFs sehr wichtig für die erfolgreiche Generierung von hESC-Linien sind. Darüber hinaus wurden alle frühen hESC-Linien in Medien gezüchtet, die Wachstumsfaktoren und Zytokine enthalten, die von MEF-Zellen sezerniert werden, und diese Wachstumsfaktoren und Zytokine sind notwendig, um die Pluripotenz der Stammzellen zu erhalten. Da MEF-Zellen von Mäusen stammen, stellen sich für hESC-Zellen ernsthafte ethische oder gesundheitliche Fragen. Darüber hinaus können bei der Verwendung von Zellen tierischen Ursprungs infektiöse Erreger aus Tieren auf hESC übertragen werden, so dass diese für die Verwendung beim Menschen nicht geeignet sind. Es wurde berichtet, dass MEF-Zellen virale Partikel enthalten, die hESC während der Kultur infizieren können. Darüber hinaus haben einige Forscher Rinderserum zur Kultivierung von hESCs verwendet, aber die Verwendung von Serum tierischen Ursprungs kann Prionen und tierische Viren in die embryonale Stammzellkultur übertragen. Es wurde berichtet, dass Zellen und Seren tierischen Ursprungs durch Zell-Zell-Interaktion während der In-vitro-Kultur Viren und andere Krankheitserreger in embryonale Stammzellen übertragen können. Außerdem können diese pathogenen Moleküle die gesamte hESC-Kultur kontaminieren. Sind hESC mit solchen Krankheitserregern kontaminiert, kann das Kontaminationsproblem auch dann bestehen bleiben, wenn die hESC später in eine tierfreie Kultur überführt werden. Ein weiteres Problem mit Maus-Feederzellen und aus Tieren gewonnenen Serum/Proteinen besteht darin, dass sie auch nichtmenschliche Sialinsäure (Neu5GC) enthalten, die ebenfalls ein ernsthaftes Kontaminationsproblem für hESC darstellen kann. So wurde beispielsweise berichtet, dass von Tieren stammende Sialinsäure metabolisch auf die Zelloberfläche von hESCs gelangt und embryonale Stammzellen kontaminiert.
2.2. Nicht-tierische Feeder-Zellen für die Kultivierung von hESCs
Um tierische Produkte und artenübergreifende Kontaminationen zu vermeiden, haben Forscher Kulturmedien entwickelt, die keine tierischen Bestandteile enthalten und gleichzeitig das Wachstum und die Expansion von embryonalen Stammzellen unterstützen. Es wurde berichtet, dass menschliche Zellen für die hESC-Kultur verwendet werden können. So wurde beispielsweise berichtet, dass menschliche Eileiterzellen, fetale Vorhaut, fetale Muskeln und Haut, transgene fetale Leberstromazellen, Knochenmark, Nabelschnur, Plazentazellen und Endometriumzellen die Kultur und Expansion von Stammzellen unterstützen. Unter diesen menschlichen Zellen bieten menschliche Stromazellen aus der Nabelschnur eine bessere Quelle für Feeder-Zellen, die auch mit einer nicht-invasiven Methode gewonnen werden können, während die Verwendung von Feeder-Schichten aus Vorhaut, Fötus oder Knochenmark einige ethische Bedenken aufwirft.
Neben Feeder-Zellen bieten auch menschliche Zelllinien eine Alternative zu Feeder-Zellen aus der Maus. Kürzlich wurden mehrere hESC-Linien unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen menschlichen Vorhautfibroblastenlinie abgeleitet und vermehrt. Auch Endometriumzellen erwiesen sich als wirksam für die In-vitro-Kultur von Stammzellen. Eine weitere Möglichkeit, das Risiko einer Kontamination mit tierischen Krankheitserregern auszuschließen, ist die Verwendung von Feederschichten, die von der menschlichen Stammzelllinie stammen. Es hat sich gezeigt, dass der grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) von menschlichen Feeder-Zellen, die in der hESC-Kultur verwendet werden, endogen produziert wird (; Liu et al., 2014). Diese Feeder-Zellen sezernieren auch TGFβ und Activin A, die an der Aufrechterhaltung der Pluripotenz von ICM beteiligt sind. Trotz verschiedener Vorteile hat die feederzellabhängige hESC-Kultur viele Einschränkungen; beispielsweise ist die Aufrechterhaltung der Feederschichten mühsam und die Variation zwischen den Feederzellpopulationen zu groß. Diese Unterschiede können sich negativ auf den Anspruch der hESC für die Anwendung beim Menschen auswirken.
2.3. Feeder-freie Kultur zur Züchtung von hESCs
Da sowohl tierische als auch menschliche Feeder-Zellen Einschränkungen aufweisen, haben Forscher chemisch definierte Kulturmedien zur Züchtung von hESCs erforscht und erfolgreich entwickelt, und das Beste an den definierten Medien ist, dass sie keine Feeder-Zellen enthalten. Einer der ersten Ansätze für feederfreie Wachstumsmedien war die Verwendung von extrazellulären Matrixproteinen zusammen mit Wachstumsfaktoren, um eine In-vitro-Kulturbedingung für die Proliferation und Erneuerung von Stammzellen zu schaffen (Abbildung 2). Unter diesen Proteinen wurde Matrigel meist in Kombination mit Wachstumsfaktoren oder konditioniertem Medium zur Kultivierung von hESCs verwendet. Trotz verschiedener Vorteile hat sich herausgestellt, dass Matrigel zu viele Variationen in seiner Zusammensetzung aufweist, was Probleme für die hESC-Kultur mit sich bringt. Die Verwendung von Matrigel wirft auch klinische Fragen auf, da einige Chargen von Matrigel mit dem einzelsträngigen Maus-RNA-Virus-Laktatdehydrogenase-Erhöhungsvirus kontaminiert sein sollen. Neben Matrigel haben sich auch Fibronektin, Laminin und Kollagen Typ IV als gute Kandidaten für die xenofreie hESC-Kultur erwiesen, und die Zellen konnten bis zu 20 Passagen wachsen. In einer Referenz wurde berichtet, dass ICM aus menschlicher Plazenta für die Kultur von hESC verwendet wurde, und es wurde eine hohe genetische Stabilität für 40 Passagen festgestellt. Darüber hinaus wurden hESCs auch in xenofreien Kulturmedien bis zu 80 Passagen kultiviert.
Die Verwendung von chemisch definierten Medien zusammen mit Proteinen hat die Kultur von hESCs zweifellos erheblich verbessert. Darüber hinaus wurden auch verschiedene Proteine und rekombinante Proteine verwendet, um die hESC-Kultur unter xenofreien Bedingungen zu verbessern. Dazu gehörten E-Cadherin, E-Cadherin/Laminin 521 und Kinase-Inhibitoren zusammen mit bFGF, die bekanntermaßen eine starke Proliferation von Stammzellen unter xenofreien Bedingungen bewirken. Synthetisch gestaltete Oberflächen wurden ebenfalls zur Stimulierung der Stammzellkultur verwendet (Melkoumian et al., 2010); so wurde beispielsweise gezeigt, dass Corning Synthemax Surface, eine synthetische Acrylatoberfläche, die mit Vitronectin konjugiert ist, nicht nur die hESC-Kolonien, sondern auch die Expansion der Stammzellen fördert (Kawase et al., 2014). Wu et al. beschrieben kürzlich die Verwendung eines neuartigen synthetischen Materials, das aus Spinnenseidenproteinen isoliert wurde, als geeignetes Substrat zur Stimulation der hESC-Kultur (Wu et al., 2014). Zahlreiche synthetische Oberflächen auf Polymerbasis wurden ebenfalls zur Unterstützung des Wachstums und der Expansion von hESC-Linien eingesetzt (Melkoumian et al., 2010; Brafman et al., 2010; Villa-Diazet al., 2013). Die Liste der verschiedenen Chemikalien, die zur Verbesserung der Kultur von hESC verwendet werden, ist in Tabelle 2 aufgeführt.
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3. Multilineares Potenzial von hESCs
Eine der wichtigsten Eigenschaften von hESCs ist die Differenzierung in alle drei Linien wie Ektoderm, Mesoderm und Endoderm (Abbildung 3). Da es sich bei hESCs um pluripotente Stammzellen handelt, haben sie die einzigartige Fähigkeit, sich in alle Arten von Körperzellen zu differenzieren; so können hESCs beispielsweise in Neuronen, Herzzellen, Hepatozyten und Muskelzellen differenziert werden. Es wurde berichtet, dass hESCs zunächst Embryoidkörper bilden, die im Wesentlichen aus drei Keimschichten bestehen. Diese Embryoidkörper werden von pluripotenten hESC gebildet, die in 3-dimensionaler (3D) Kultur gezüchtet werden und genetische Marker für alle drei Keimschichten exprimieren. Pluripotente hESCs haben eine enorme Fähigkeit zur Differenzierung (Tabelle 3) in Nebennierenzellen und Keratinozyten, insulinproduzierende Zellen, neuronale Zellen, Herzzellen, Leberzellen und inselartige Organoide. Bestimmte Wachstumsfaktoren wie Retinsäure und Nervenwachstumsfaktoren werden verwendet, um hESCs zur Differenzierung in funktionelle Neuronen zu veranlassen. Darüber hinaus werden einige linienspezifische Wachstumsfaktoren für die Differenzierung in Kardiomyozyten, Hepatozyten, Skelettmuskeln, Pankreaszellen und Nierenzellen verwendet. Diese differenzierten Zellen werden auch auf ihre Funktionalität unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen getestet. Dieses Multilinearitätspotenzial von hESCs hat sich als entscheidend für die zellbasierte Therapie zur Behandlung verschiedener degenerativer Erkrankungen erwiesen. Während es einfach ist, verschiedene Zelltypen aus hESCs zu differenzieren, ist es schwierig, eine große Anzahl differenzierter reifer Zellen für therapeutische Anwendungen zu erhalten. Um große, reife und funktionelle differenzierte Zellen zu erhalten, sollten die Kulturmedien linienspezifische Wachstumsfaktoren enthalten. Es ist auch wichtig, große Mengen von Zellen aus hESCs zu erzeugen, da sie für die Zelltransplantation benötigt werden, und dies kann durch Kultivierung der hESCs und differenzierten Zellen in einem Bioreaktor unter kontrollierten Bedingungen erreicht werden.
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4. Prüfung von hESCs anhand von In-vitro- und In-vivo-Modellen
Nach einer erfolgreichen Differenzierung von hESCs in verschiedene Zelltypen besteht der nächste logische Schritt darin, zu untersuchen, ob die daraus gewonnenen differenzierten Zellen eine gewisse Funktionalität aufweisen oder nicht. Die Funktionalität von Stammzellen und differenzierten Vorläufer- oder reifen Zellen wurde sowohl unter in vitro- als auch unter in vivo-Bedingungen eingehend untersucht. Die Funktionalität von differenzierten Neuronen, Kardiomyozyten, Hepatozyten und anderen Zelltypen wurde in verschiedenen Tiermodellen getestet. Es wurde festgestellt, dass die Transplantation von Neuronen im Tiermodell der Parkinsonschen Krankheit eine teilweise Wiederherstellung der Funktion bewirkt. Die Transplantation von hESCs und ihren differenzierten Zellen wurde in Tiermodellen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Schlaganfall, Diabetes und Rückenmarksverletzungen getestet. Unter den Tieren waren kleine Nagetiere wie Ratten und Mäuse die bevorzugte Spezies für die Untersuchung der Zelltransplantation. Außerdem sind kleine Nagetiere leicht zugänglich und lassen sich sowohl chirurgisch als auch genetisch leicht manipulieren. Trotz der zahlreichen Vorteile kleiner Nagetiere ist die Eignung von Maus-/Rattenexperimenten zur Vorhersage der Wirksamkeit stammzellbasierter Therapien nach wie vor umstritten, da viele Maus-/Rattenmodelle nicht den Phänotyp menschlicher Krankheiten abbilden. Um dieses Problem zu überwinden, haben Forscher begonnen, an großen Tieren zu arbeiten, die der menschlichen Anatomie und Physiologie nahe kommen. Unter den großen Tieren gelten Hunde, Ziegen, Schafe und nichtmenschliche Primaten als bessere Modelle für Stammzellentests als Mäuse/Ratten. Einer der Hauptvorteile der Verwendung großer Tiere ist ihre längere Lebensdauer, und viele anatomische und physiologische Parameter sind dem Menschen sehr viel näher. Obwohl diese Tiermodelle zeigen, dass die Stammzellen wirksam in das Wirtsgewebe eingebracht werden können, ist eine vollständige funktionelle und verhaltensmäßige Erholung noch nicht erreicht. Weitere Forschungen sind erforderlich, um Tiermodelle zu entwickeln, die der menschlichen Krankheit sehr nahe kommen.
Trotz dieser Fortschritte in der hESC-Forschung besteht eine wichtige Herausforderung der hESC-basierten Zelltherapie in der allogenen Immunabstoßung von hESC-abgeleiteten Zellen durch die Empfänger. Es wurde festgestellt, dass innerhalb einer Woche alle transplantierten Stammzellen aufgrund der starken Immunreaktion des Wirts im Tier abstarben. Um das Absterben der transplantierten Stammzellen zu verhindern, wurden den Tieren Immunsuppressiva injiziert, um die durch die Stammzelltransplantation ausgelöste Immunität zu unterdrücken. Überraschenderweise konnten die hESC nur 28 Tage lang überleben, wenn den Tieren Immunsuppressiva oder Medikamente wie Tacrolimus und Sirolimus verabreicht wurden, und begannen danach abzusterben. Wir kennen zwar den Grund dafür nicht, aber ein mangelndes Verständnis der Zell-Zell-Interaktion könnte einer der Gründe dafür sein. Es ist wichtig, hESC oder differenzierte Zellen vor der Durchführung von Tierversuchen unter In-vitro-Bedingungen zu testen. In-vitro-Modelle bieten bessere Möglichkeiten, die Zell-Zell-Interaktion, die Zellmigration oder die Zellintegration sehr detailliert zu untersuchen, was im Tierversuch vielleicht sehr schwierig ist. Dieses Problem könnte durch den jüngsten Durchbruch in der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) durch nukleare Reprogrammierung patientenspezifischer somatischer Zellen mit definierten Faktoren entschärft werden, die eine erneuerbare Quelle autologer Zellen für die Zelltherapie werden könnten. Ein entscheidender Vorteil von iPSCs für die Zelltherapie beim Menschen besteht darin, dass patientenspezifische iPSCs autolog sind, so dass man davon ausgeht, dass die daraus gewonnenen Zellen ohne Bedenken hinsichtlich einer Immunabstoßung in denselben Patienten transplantiert werden können. Jüngste Studien, die die abnorme Epigenetik, genomische Stabilität und Immunogenität von iPSCs aufgedeckt haben, haben jedoch Sicherheitsbedenken hinsichtlich der iPSC-basierten Therapie aufkommen lassen.
5. Therapeutische Anwendungen von hESCs
Da hESCs vielversprechend für Patienten sind, die an degenerativen Krankheiten leiden, wurden verschiedene Versuche unternommen, um das therapeutische Potenzial beim Menschen zu erforschen. Das Hauptziel der stammzellbasierten Therapie ist die Wiederherstellung oder Reparatur der verlorenen oder geschädigten Körperzellen oder Gewebe. Um hESCs für klinische Anwendungen geeignet zu machen, müssen die daraus gewonnenen Stammzellen gemäß der United States Food Drug Administration (USFDA), den Current Good Manufacturing Practices (cGMP) und den Richtlinien für die klinische Transplantation von Stammzellen hergestellt werden. Die in der Stammzellkultur verwendeten Chemikalien, Reagenzien, Zellen, Maschinen und Instrumente sollten Sicherheits- und Gesundheitsprüfungen unterzogen werden, und alle Herstellungsprozesse müssen gemäß den cGMP-Richtlinien überwacht und dokumentiert werden. Wenn wir analysieren, wie viele der derzeit verwendeten hESC-Linien den cGMP-Leitlinien entsprechen, werden Sie feststellen, dass viele der hESC-Linien die cGMP-Leitlinien nicht erfüllen, weil viele hESCs während ihrer Isolierung und Vermehrung immunogenen oder pathogenen tierischen Bestandteilen ausgesetzt sind. Ein weiterer Grund für die Nichteinhaltung der cGMP-Richtlinien ist, dass die meisten hESC-Kulturen in Universitätslaboratorien gezüchtet werden, von denen viele die cGMP-Richtlinien nicht einhalten. Bis heute sind nur wenige Forscher in der Lage, hESC-Linien gemäß den cGMP-Richtlinien herzustellen.
In Anbetracht des potenziellen kommerziellen Nutzens von hESCs haben sich auch einige Biotechnologieunternehmen an der Finanzierung der Stammzellenforschung beteiligt, deren einziges Ziel die Vermarktung von Stammzellenprodukten ist. Diese Unternehmen haben mit der Herstellung von hESCs unter cGMP-Bedingungen begonnen und testen Stammzellen unter klinischen Bedingungen. Im Jahr 2009 beantragte die Geron Corporation (ein in Kalifornien ansässiges Biotechnologieunternehmen) bei der FDA die Durchführung ihrer ersten klinischen Studie mit aus hESCs gewonnenen Zellen. Die klinische Studie wurde im Oktober 2010 gestartet, wobei 3 Patienten, die an einer Rückenmarksverletzung litten, 1,5 Millionen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus hESCs injiziert wurden. Die Studie wurde unerwartet abgebrochen, ohne dass wir den Grund dafür kennen, wahrscheinlich weil die vorläufigen Ergebnisse der Studie zeigten, dass die aus hESCs gewonnenen Zellen zu keiner spürbaren Verbesserung der Rückenmarksverletzung führten. Darüber hinaus genehmigte die FDA eine weitere Studie zur Verwendung von hESCs bei Makuladegenerationen. Ein anderes Unternehmen, Advanced Cell Technology mit Sitz in Marlborough, Massachusetts, hat klinische Versuche mit hESCs begonnen. Die Zellen wurden Patienten injiziert, die an der Stargardt-Muskeldystrophie und an altersbedingter trockener Makuladegeneration litten. Die aus hESCs gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) wurden verwendet. In der Studie wurden den Patienten RPE-Zellen verabreicht, und nach einer viermonatigen Posttransplantation wurde festgestellt, dass die Patienten eine geringfügige Verbesserung der Sehfunktion zeigten, ohne Anzeichen einer Immunabstoßung oder einer Teratombildung. Stammzellen wurden auch bei Patienten mit Typ-I-Diabetes getestet, denen Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse verabreicht wurden.
6. Zusammenfassung und Schlussfolgerung
Humane embryonale Stammzellen haben ein großes therapeutisches Potenzial für die Behandlung verschiedener Krankheiten wie Krebs, Parkinson, Alzheimer und Diabetes. Sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Studien deuten darauf hin, dass es noch Hoffnung gibt, dass embryonale Stammzellen in Zukunft Heilmittel für verschiedene Krankheiten liefern werden. Der Erfolg der stammzellbasierten Therapie hängt jedoch davon ab, ob reife und funktionsfähige Zellen zur Verfügung stehen. Um reife und funktionelle Zellen zu erhalten, wäre es besser, wenn die Stammzellen unter dreidimensionalen (3D) Kulturbedingungen gezüchtet würden. Die meisten hESC-Linien werden durch zweidimensionale (2D) Kulturbedingungen gewonnen. Es gibt einige Einschränkungen bei der Verwendung von 2D-Kulturen, da hESCs, die unter 2D-Bedingungen gezüchtet wurden, nicht die menschlichen Zellen des menschlichen Körpers repräsentieren und die meisten der in 2D gezüchteten hESCs Berichten zufolge unmittelbar nach der Zelltransplantation absterben; die Zellen, die überlebt haben, können das Körpergewebe nicht mehr reparieren. Dieses Problem kann durch die Kultivierung von hESCs unter 3D-Bedingungen gelöst werden, wo die Zellen in drei Richtungen wachsen können und die Überlebenschancen der Zellen nach der Zelltransplantation verbessert werden. Ein weiterer wichtiger Punkt, der für eine erfolgreiche Therapie auf der Grundlage von Stammzellen zu berücksichtigen ist, besteht darin, die aus Stammzellen gewonnenen Zellen vor der Erprobung am Menschen in Tiermodellen gründlich zu prüfen. Die Zell-Zell-Integration, die Zell-Zell-Kommunikation, die Zellmigration und die Zellfunktionalität müssen in Tiermodellen sowohl in Kurzzeit- als auch in Langzeitversuchen gründlich untersucht werden. Auch das Problem der Traumabildung und Immunabstoßung muss gelöst werden, indem Stammzelllinien entwickelt werden, die keine Immunabstoßung verursachen und nach der Transplantation keinen Tumor bilden. Dies kann erreicht werden, indem die Gene/Molekülwege, die die Tumorbildung bzw. Immunabstoßung auslösen, ausgeschaltet werden. Außerdem werden für die zellbasierte Therapie viele reife Zellen benötigt, und die Bemühungen sollten auch auf die Isolierung einer großen Menge von Stammzellen und deren Vorläufern gerichtet sein, indem ein neuer innovativer Ansatz und eine neue Methodik entwickelt werden. Schließlich sind humane embryonale Stammzellen nach wie vor vielversprechend für die Behandlung verschiedener degenerativer Erkrankungen sowie für diagnostische Anwendungen.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Beiträge der Autoren
Dieses Manuskript wurde von allen Autoren zur Veröffentlichung freigegeben.
Danksagung
Die Autoren danken der gesamten Leitung des Institute for Research and Medical Consultations (IMRC), Imam Abdulrahman Bin Faisal University, Dammam, Königreich Saudi-Arabien, für ihre Unterstützung und Ermutigung.