Um die Rolle des IRE1a-XBP1-Signalwegs zu verstehen, haben wir in dieser Studie ein in vitro Th2-Differenzierungsmodell verwendet (Abb. 1b). 1b). Naive T-Helferzellen wurden durch TCR-Aktivierung in Anti-CD3e/CD28-beschichteten Platten unter Th2-Differenzierungsbedingungen 72 Stunden lang aktiviert, ruhten 42 Stunden lang und wurden durch TCR-Aktivierung mit Anti-CD3e/CD28-beschichteten Platten restimuliert. Um den IRE1a-XBP1-Signalweg zu stören, verwendeten wir das bekannte Medikament 4μ8c, das diesen Signalweg durch Hemmung der IRE1a-Endonuklease-Aktivität spezifisch blockiert. Das Medikament wurde dem Kulturmedium zu Beginn der Kultur und während des Übergangs von der Aktivierungsplatte zur Ruheplatte in einer Konzentration von 15 μM zugesetzt. Die Wahl der Wirkstoffkonzentration richtete sich nach der höchsten IRE1a-Inhibitionseffizienz bei geringster Zelltoxizität (Additional file 1: Abbildung S1). Wir verglichen die Transkriptome von naiven und restimulierten Th2-Lymphozyten (medikamentenbehandelt und unbehandelt) durch RNA-Sequenzierung, identifizierten XBP1-Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in reaktivierten Th2 durch ChIP-Segmentierung (ChIP-Sequenzierung) und integrierten die genomweiten Daten, um direkte Targets und ihre regulatorische Rolle vorherzusagen.

T-Helferzellen schalten den IRE1a-XBP1-Signalweg während der In-vitro-Aktivierung ein

Aktivierte und differenzierte T-Helferzellen sezernieren eine Fülle von Zytokinen. Daher ist eine gut entwickelte Sekretionsmaschinerie eine Voraussetzung dafür, dass sich die Zellen an diesen Sekretionsstress anpassen können. Um die Beteiligung des ER-Stress/UPR-Signalwegs während der Aktivierung von T-Helferzellen vorherzusagen, verglichen wir das Transkriptom von naiven und differenzierten Th2-Zellen (restimulierte Th2). Die aus diesem Vergleich gewonnenen differenziell exprimierten Gene wurden in den KEGG-Pfad „Protein Processing in the Endoplasmic Reticulum“ integriert, um die hoch- oder herunterregulierten Komponenten sichtbar zu machen. Die Analyse zeigt, dass naive T-Helferzellen, wenn sie aktiviert und zu Th2-Zellen differenziert werden, die Expression von Genen hochregulieren, die am ER-Stress-Signalweg beteiligt sind (Additional file 1: Abbildung S2). Mehrere Faktoren, die zuvor als Kontrolleure der Proteinfaltung und -sekretion charakterisiert wurden, einschließlich XBP1 selbst, werden während der T-Helferzelldifferenzierung hochreguliert.

Um diese Vorhersage zu bestätigen und speziell die Beteiligung des IRE1a-XBP1-Signalwegs zu untersuchen, haben wir die mRNA- und Proteinexpression von IRE1a in differenzierten und reaktivierten Th2-Lymphozyten in vitro gemessen (Abb. 1b). Die Zellen wurden mittels qPCR und Western Blot analysiert, um die mRNA bzw. das Protein zu vergleichen. Es zeigte sich, dass sowohl die mRNA- als auch die Proteinkonzentration in aktivierten T-Helferzellen hochreguliert war (Abb. 1c, linke und mittlere Tafel). Es ist bekannt, dass die Phosphorylierung von IRE1a seinen Funktionszustand kennzeichnet. Wir beobachteten, dass das Protein in aktivierten Th2-Lymphozyten phosphoryliert ist (Abb. 1c, rechte Seite). Diese erhöhte Phospho-IRE1a-Konzentration kann durch die erhöhte Synthese des Proteins erklärt werden, obwohl wir die Möglichkeit einer erhöhten Kinaseaktivität und Autophosphorylierung nicht ausschließen können. Die densitometrische Analyse der Western-Blot-Bande deutet darauf hin, dass beide Mechanismen, die Hochregulierung der Proteinsynthese und die erhöhte Phosphorylierung, beteiligt sind. Die Protein-Hochregulierung stieg um das Dreifache, aber das Phospho-Protein stieg um das 4,5-fache (Abb. 1c).

Aktiviertes IRE1a spleißt die ungespleißte XBP1 (XBP1u) mRNA und produziert eine gespleißte XBP1 (XBP1s) mRNA-Isoform. Wir beobachteten einen Anstieg der gespleißten Form von XBP1 (XBP1s), sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene, bei der Aktivierung von T-Helferzellen (Abb. 1d, e). Tunicamycin wurde als Positivkontrolle verwendet. Tunicamycin ist ein Medikament, das die N-gebundene Glykosylierung hemmt und dadurch die Anhäufung ungefalteter Proteine (d. h. Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER)) verursacht und XBP1s durch Verstärkung der IRE1a-Aktivität erhöht. Die spezifische Hemmung der IRE1a-Endonukleaseaktivität durch Behandlung der Zellen mit 4μ8c beseitigte sowohl die XBP1s-mRNA- als auch die XBP1s-Protein-Isoformen, was bestätigt, dass die Bildung der gespleißten Form von der IRE1a-Aktivität abhängt (Abb. 1d, e).

Diese Ergebnisse bestätigen, dass der IRE1a-XBP1-Weg in Th2-Lymphozyten konserviert und während der In-vitro-T-Helferzellaktivierung hochreguliert wird. Als nächstes untersuchten wir, ob dies auch in vivo zutrifft.

In vivo aktivierte T-Helferzellen regulieren den IRE1a-XBP1-Signalweg hoch

Um zu testen, ob der IRE1a-XBP1-Signalweg in CD4+ T-Zellen in vivo funktionsfähig ist, infizierten wir C57BL/6-Mäuse mit dem Helminthenparasiten Nippostrongylus brasiliensis, einem etablierten Modell für Th2-gesteuerte Immunantworten. Nach 7 Tagen nach der Infektion analysierten wir die XBP1s-Proteinexpression in T-Helferzellen mittels Durchflusszytometrie. Wir fanden heraus, dass T-Helferzellen von wurminfizierten Mäusen im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollmäusen signifikant mehr XBP1s exprimieren, was auf eine Hochregulierung des Signalwegs hindeutet (Abb. 2).

T-Helferzellen regulieren während der Infektion den IRE1a-XBP1-Signalweg in vivo hoch. Splenozyten von mit dem Nematoden (Nippostrongylus brasiliensis) infizierten Mäusen (7 Tage nach der Infektion) wurden mit einem PE-konjugierten Anti-XBP1s-Antikörper angefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert (Gating-Strategie: Singlet > lebende Zellen > CD4+CD3e+ > XBP1s+). Ein repräsentatives FACS-Profil ist abgebildet (linkes Feld), und das Diagramm mit allen Ergebnissen (n = 4) ist im „rechten Feld“ zu sehen.

Diese Ergebnisse bestätigen, dass der Signalweg in vivo aktiv ist.

Die genomweite transkriptomische Analyse der differentiellen Genexpression zeigt IRE1a-XBP1-regulierte Gene

Um eine globale genregulatorische Rolle des IRE1a-XBP1-Signalwegs zu erfassen, verglichen wir in vitro aktivierte Th2-Zellen mit Zellen, deren IRE1a-Endonukleaseaktivität durch Zugabe von 4μ8c in die Zellkulturmedien gehemmt wurde. Anschließend verglichen wir die Transkriptome von aktivierten Th2-Lymphozyten mit und ohne Hemmung des IRE1a-XBP1-Signalwegs. Die Transkriptome von 4μ8c-behandelten und unbehandelten Th2-Zellen wurden durch mRNA-Sequenzierung (RNA-seq) gewonnen. Die Qualitätskontrolle der RNA-Sequenzierungsdaten ist in Zusatzdatei 1 dargestellt: Abbildung S3. Der Vergleich der Transkriptome von naiven und aktivierten Th2-Lymphozyten ergab, dass 10995 Gene bei der Th2-Aktivierung unterschiedlich reguliert wurden. Die Hemmung des IRE1a-XBP1-Signalwegs durch 4μ8c-Behandlung führte zu einer unterschiedlichen Expression von 3144 Genen im Vergleich zur unbehandelten Th2-Kontrolle (Abb. 3a, Zusatzdatei 1: Abbildung S3, rechtes Feld). Zweitausendsechshundertsiebzig dieser Gene waren an der Th2-Differenzierung beteiligt (Abb. 3a). Die hierarchische Clusterung der Gene zeigt die Gruppen von Genen, die bei der Behandlung mit 4μ8c hoch- und herunterreguliert wurden (Additional file 1: Abbildung S3, rechts). Eine detaillierte Untersuchung dieser Gene ergab, dass viele mit der Reaktion auf ungefaltete Proteine und ER-Stress in Verbindung stehen, was auf einen großen Einfluss des IRE1a-XBP1-Signalwegs (Abb. 3b) auf diese biologischen Prozesse hinweist. Die vollständige Liste der differenziell exprimierten Gene ist in Zusatzdatei 2: Tabelle S1 zu finden. Die Gene Ontology (GO)-Analyse dieser nach der 4μ8c-Behandlung von Th2-Zellen unterschiedlich exprimierten Gene (d. h. die durch den IRE1a-XBP1-Signalweg regulierten Gene) zeigte, dass sie in den folgenden biologischen Prozessen angereichert sind: „Reaktion auf ER-Stress“ (GO:0006950), „Regulation der Signaltransduktion“ (GO:0009966), „Zytokinproduktion“ (GO:0001816), „Zellproliferation“ (GO:0008283), „Zellzyklus“ (GO:0007049) und Immunantwort (GO:0006955) (Abb. 3c). Diese Veränderungen in den Genexpressionsmustern nach IRE1a-Hemmung deuten auf eine umfassende Beteiligung des Transkriptionsfaktors XBP1 an der Th2-Aktivierung und -Proliferation sowie an der Differenzierung hin. Daher untersuchten wir die genomweiten Chromatinbesetzungsmuster des XBP1-Transkriptionsfaktors.

Differenzielle Genexpression in Th2 aufgrund der Hemmung von IRE1a-XBP1 durch 4μ8c. Naive T-Helferzellen wurden unter Th2-Differenzierungsbedingungen in An- oder Abwesenheit von 4μ8c aktiviert. Die Zellen wurden 3 Tage lang in mit Anti-CD3e- und Anti-CD28-Antikörpern beschichteten Platten aktiviert, ruhten 2 Tage lang und wurden 6 Stunden lang in beschichteten Platten reaktiviert. Die RNAseq-Daten wurden auf differentielle Genexpression analysiert. a Venn-Diagramm, das die Anzahl der differentiell exprimierten Gene unter verschiedenen Versuchsbedingungen zeigt. „Naïve → Th2“ zeigt die differentiell exprimierten Gene zwischen naiven T-Helfern und Th2-Zellen an. „Th2 → Th2+4μ8c“ zeigt die unterschiedlich exprimierten Gene zwischen unbehandelten und mit 4μ8c behandelten Th2-Zellen an. b Heatmap mit den unterschiedlich exprimierten Genen, von denen bekannt ist, dass sie an der Beseitigung des ER-Stresses durch die „Unfolded Protein Response“ beteiligt sind. Die Heatmap zeigt skalierte Expressionswerte als Z-Score in einer rot-blauen Farbskala, wobei Rot für eine erhöhte Expression und Blau für eine verringerte Expression steht. c Gene Ontology (GO)-Analyse der unterschiedlich exprimierten Gene zwischen Th2 und 4μ8c-behandeltem Th2

XBP1 ChIPmentation zeigt direkte Zielgene von XBP1 in Th2-Zellen

Um die genomweite Chromatinbesetzung von XBP1 zu ermitteln, führten wir eine kürzlich durchgeführte ChIPmentation durch, führten wir die ChIPmentation durch, eine kürzlich entwickelte Methode, die sich als schneller, empfindlicher und robuster als herkömmliche ChIP-seq-Ansätze erwiesen hat, wobei ein ChIP-Antikörper gegen XBP1 verwendet wurde. Für das XBP1-ChIP wurden in vitro differenzierte und reaktivierte Th2-Zellen verwendet. Es wurden zwei unabhängige biologische Wiederholungen durchgeführt. Wir erhielten 19,3 Millionen bzw. 22,4 Millionen pair-end reads für jedes Replikat. Unter Verwendung von MACS2 mit einem q-Wert von weniger als 0,01 und einer Faltenanreicherung von über 5 identifizierten wir 9031 bzw. 7662 Peaks in den beiden Replikaten. Die Überschneidungsanalyse mit bedtools ergab, dass 5892 Peaks in beiden Replikaten vorhanden waren. Daher konzentrierten wir uns für die nachgeschaltete Analyse nur auf diese 5892 Peaks.

Wie erwartet, wurden Bindungspeaks um Promotorregionen in bekannten XBP1-Zielgenen identifiziert, wie z. B. Hspa5, das für das ER-Chaperonprotein BiP, auch bekannt als Grp78, kodiert; ein Bindungsereignis wurde auch um den Promotor von XBP1 selbst beobachtet (Abb. 4a), was auf eine mögliche Autoregulation von XBP1 hinweist. Um herauszufinden, welche genomischen Merkmale mit den XBP1-Bindungsstellen verbunden sind, verglichen wir die Lage der Peaks mit den RefSeq-Genen unter Verwendung von HOMER. Die Mehrzahl der XBP1-Bindungsspitzen befand sich innerhalb des Promotors (definiert als stromaufwärts 1000 bp und stromabwärts 500 bp relativ zu den annotierten Transkriptionsstartstellen) (36 %) und in intronischen (35 %) Regionen, und auch distale intergene Bindungsstellen (25 %) wurden häufig beobachtet (Abb. 4b). Die genomische Verteilung der XBP1-Peaks deutet darauf hin, dass er sowohl Promotoren als auch potenzielle Enhancer bindet.

Genomweite Chromatinbesetzung des Transkriptionsfaktors XBP1 in Th2-Lymphozyten. XBP1 ChIPmentation wurde in in vitro differenzierten Th2-Zellen durchgeführt, um eine genomweite XBP1-Chromatinbesetzung zu erhalten. a Schnappschuss der XBP1-Bindungsspitzen um die angegebenen repräsentativen Gene aus dem UCSC-Genombrowser. b Genomische Verteilung der XBP1-Bindungsspitzen. Der Sektor, der dem Promotor entspricht, umfasst Sequenzen bis zu 1 kb stromaufwärts und 100 bp stromabwärts vom TSS. c Vergleich der XBP1-Motive aus der JASPAR-Datenbank (oben), ChIP-seq der menschlichen Brustkrebszelllinien (Mitte) und der Th2-Lymphozyten der Maus (unten). d Motivhäufigkeiten von XPB1 und NF-Y um die Bindungsspitzen von XBP1. e GO-Begriffe für biologische Prozesse, die in den von GREAT analysierten XBP1-Bindungsspitzen angereichert sind

Um das XBP1-Regulom weiter zu charakterisieren, führten wir eine de novo-Motivsuche mit HOMER durch, um angereicherte DNA-Motive in den XBP1-Bindungsregionen zu identifizieren. Das wichtigste identifizierte Motiv ist die Konsensussequenz GCCACGT, die fast identisch mit dem menschlichen XBP1-Bindungsmotiv ist, das in Brustkrebszelllinien definiert wurde (Abb. 4c). Dies deutet auf hoch konservierte Bindungsspezifitäten von XBP1 zwischen Mensch und Maus und über Zelltypen hinweg hin. Das in unseren Mausdaten am stärksten angereicherte Motiv ähnelt auch dem XBP1-Motiv aus der JASPAR-Datenbank, was wiederum die hohe Qualität unserer ChIPmentierungsdaten bestätigt. Das am zweithäufigsten angereicherte Motiv ist das NF-Y-Bindungsmotiv (Zusatzdatei 1: Abbildung S4C). Interessanterweise wurde das NF-Y-Motiv häufig in der Nähe von Promotorregionen von Zellzyklusgenen gefunden, insbesondere von Genen, die an der Regulierung des G2/M-Zellzyklus beteiligt sind. Sowohl das XBP1-Motiv als auch das NF-Y-Motiv treten in der Nähe einer Untergruppe von 258 XBP1-Bindungsspitzen auf (Abb. 4d), was auf eine mögliche Zusammenarbeit zwischen XBP1- und NF-Y-Transkriptionsfaktoren bei der Regulierung einer Untergruppe von Zielgenen hinweist. Die Liste der Zielgene, die möglicherweise von XBP1 und NF-Y gemeinsam reguliert werden, ist in Zusatzdatei 3: Tabelle S2 zu finden, und eine vollständige Liste der XBP1-Zielgene ist ebenfalls in Zusatzdatei 3: Tabelle S2 enthalten. Die fünf am stärksten angereicherten Motive sind in Zusatzdatei 1 dargestellt: Abbildung S4C. Um die Funktionen von XBP1-gebundenen Genen zu untersuchen, verwendeten wir GREAT, um XBP1-Bindungsspitzen zu charakterisieren. Die meisten der signifikanten GO-Terme stehen im Zusammenhang mit Proteinfaltung und ER-Stress (Abb. 4e), was mit der bekannten biologischen Rolle von XBP1 übereinstimmt.

Insgesamt sagen die ChIPmentierungsexperimente eine Rolle von XBP1 bei der Verbesserung der Proteinfaltung und -sekretion sowie der Aktivierung von Th2-Lymphozyten voraus.

Integration von transkriptomischen Daten und ChIP-seq-Daten zur Entschlüsselung des XBP1-gesteuerten Genregulationsnetzes

Um die XBP1-regulierten direkten Zielgene und ihr transkriptionelles Regulationsnetz aufzudecken, haben wir die genomweiten transkriptomischen Daten und die ChIPmentation-Daten integriert. Ein direktes Zielgen wird durch seine unterschiedliche Expression bei IRE1a-Hemmung (d. h. 4μ8c-Behandlung) und die Besetzung des XBP1-Transkriptionsfaktors am Genort definiert. Wir fanden 1143 direkte Zielgene in Th2, von denen 122 Targets zuvor als direkte XBP1-Zielgene in anderen Zelltypen (z. B. Muskel, β-Zelle der Bauchspeicheldrüse und Plasmazelle) gemeldet wurden (Abb. 5a). In diesem Zusammenhang können 1021 Gene als Th2-spezifisch angesehen werden. Die Wirkung von XBP1 auf seine direkten Ziele hat keine definierte Richtung und enthält sowohl hoch- als auch herunterregulierte Gene. Die 38 wichtigsten Gene, die einem dieser beiden Muster folgen, sind in Abb. 5b dargestellt, und die vollständige Liste ist in Zusatzdatei 4: Tabelle S3 zu finden. Die wichtigsten identifizierten biologischen Prozesse und Pfade stehen im Zusammenhang mit der Proteinfaltung und dem ER-Stress (Zusatzdatei 1: Abbildung S5), die mit den bekannten biologischen Funktionen übereinstimmen und auch neuartige Th2-spezifische Targets umfassen.

Die Integration von ChIPmentierungs- und RNA-seq-Daten offenbart direkte XBP1-Zielgene und ihr regulatorisches Netzwerk. a Venn-Diagramm, das zuvor gemeldete XBP1-Zielgene anderer sekretorischer Zelltypen mit den direkten Th2-Zielgenen dieser Studie vergleicht. Die direkten XBP1-Zielgene dieser Studie sind diejenigen, die in den Kategorien „XBP1-besetzte Gene in Th2“ und „Differentiell exprimierte Gene (Th2 → Th2+4μ8c)“ gemeinsam vorkommen. Die direkten XBP1-Zielgene von B-Zellen/Plasmazellen, Skelettmuskelzellen und β-Zellen der Bauchspeicheldrüse wurden von Acosta-Alvear et al. beobachtet und hier zum Vergleich herangezogen. b Heatmap, die das Muster der direkten XBP1-Zielgenexpression zeigt. Die 38 wichtigsten Gene, die einem bestimmten Muster folgen, sind dargestellt. c Transkriptionsregulationsnetzwerk: Transkriptionsfaktoren, die direkte Zielgene von XBP1 sind. Die Gene im Netzwerk werden bei 4μ8c-Behandlung unterschiedlich exprimiert (hochreguliert-rot; herunterreguliert-blau). Die Transkriptionsfaktoren, die nicht unterschiedlich exprimiert werden, aber einen XBP1-ChIPseq-Peak aufweisen, sind in der Liste auf der rechten Seite aufgeführt

Trotz der überwiegenden Rolle von XBP1 bei der Kontrolle dieses Weges sind auch andere Transkriptionsfaktoren beteiligt. Um die regulatorische Kaskade zu untersuchen, die auf die XBP1-Regulierung folgt, erstellten wir ein transkriptionelles regulatorisches Netzwerk, indem wir annotierte Transkriptionsfaktoren mit Promotor- oder exonischen/intronischen ChIP-seq-Peaks extrahierten (Abb. 5c). Die vollständige Liste der Transkriptionsfaktoren ist in Zusatzdatei 5: Tabelle S4 zu finden. Dieses Netzwerk wurde weiter ergänzt, indem differenziell exprimierte Gene hinzugefügt wurden, die in der STRING-Datenbank mit den Ziel-Transkriptionsfaktoren annotiert sind (Zusatzdatei 6: Tabelle S5).

Die Transkriptionsfaktoren, die direkt von XBP1 reguliert werden, können in drei große funktionelle Kategorien eingeteilt werden, die mit den folgenden Aufgaben zu tun haben: Lösung des sekretorischen ER-Stresses, Regulierung des Zellzyklus und der Proliferation sowie Kontrolle der Effektor-Immunzellenfunktion. Die am ER-Stress beteiligten Transkriptionsfaktoren erleichtern wahrscheinlich die Zytokinsekretion in Th2-Lymphozyten. Diese Vorhersage stützt sich auf frühere Berichte über sekretorische Zellen wie Azinuszellen der Bauchspeicheldrüse und Plasmazellen. Diese Transkriptionsfaktoren, nämlich Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4 und Creb3l2, sind nachweislich an der sekretorischen Stressanpassung des ER beteiligt.

Der Zweck der zellproliferations- und zellzyklusbezogenen Transkriptionsfaktoren könnte darin bestehen, die kontrollierte schnelle Expansion von aktivierten Th2-Zellen zu erleichtern. Die mit der Immunantwort verbundenen Faktoren sind wahrscheinlich an der Th2-Differenzierung und der Zytokinproduktion beteiligt. Daher wollten wir die Auswirkungen der XBP1-Downregulation auf die Zytokinsekretion, die Zellproliferation und die Zytokinproduktion testen.

Der IRE1a-XBP1-Signalweg steuert die Zytokinsekretion in T-Helferzellen

Der genomweite Vergleich der XBP1s-regulierten Gene sagt voraus, dass der Faktor an der Sekretion von Zytokinen beteiligt ist. Um diese Vorhersage zu überprüfen, blockierten wir die IRE1a-Endonukleaseaktivität in Th2-Zellen und analysierten den Zellkulturüberstand, um den IL4-Spiegel mittels ELISA zu quantifizieren. Wir wählten IL4 als testbares Kandidaten-Zytokin aus, da seine mRNA und sein Protein durch die Herunterregulierung von XBP1 nicht verändert werden (Additional file 1: Abbildung S6A linkes Feld, Abb. 6 linkes und mittleres Feld der oberen Reihe). Wir fanden heraus, dass die Sekretion von IL4 in 4μ8c-behandelten Zellen signifikant gehemmt ist (Abb. 6, rechtes Feld der oberen Reihe). Wie erwartet, unterstützt dieses Ergebnis die Beteiligung des IRE1a-XBP1-Signalwegs an der Erleichterung der Zytokinsekretion in Th2-Zellen. Die Hemmung des Signalwegs während der Restimulationsphase hat keine signifikante hemmende Wirkung auf die IL4-Sekretion (Additional file 1: Abbildung S6B). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der XBP1s-Signalweg während der Th2-Differenzierung erforderlich ist, möglicherweise für die Entwicklung einer effizienten Sekretionsmaschinerie.

IRE1a-XBP1-Signalweg ist für die Zytokinexpression und -sekretion in Th2-Lymphozyten erforderlich. Naive T-Helferzellen wurden nach einer Th2-Aktivierung in Gegenwart des IRE1a-Inhibitors 4μ8c drei Tage lang kultiviert, ruhten zwei Tage lang, wurden mit einer beschichteten Platte reaktiviert und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Expression der intrazellulären Zytokine IL4, IL5 und IL13 zu bestimmen. Repräsentative FACS-Profile sind in den ersten beiden Spalten dargestellt. Die intrazelluläre Zytokinexpression wird in Spalte 3 verglichen, mit drei bis sieben unabhängigen biologischen Wiederholungen. Vierte Spalte: Zellkulturüberstände von 4μ8c-behandelten oder DMSO-behandelten Th2 wurden mittels ELISA zur Messung der Zytokinkonzentration analysiert. FACS-Gating: Lymphozyten > Einzelzellen > lebende Zellen > Zytokine

Der IRE1a-XBP1-Signalweg steuert die Expression der Zytokine IL13 und IL5

IL5 und IL13 sind zwei wichtige Typ-2-Zytokine, die an Eosinophilie, Allergien und Helmintheninfektionen beteiligt sind. Wir fanden heraus, dass die Hemmung des IRE1a-XBP1-Signalwegs die IL5- und IL13-Proteinexpression und -sekretion in das Kulturmedium signifikant unterdrückt (Abb. 6, rechte Felder der mittleren und unteren Reihe). Die bioinformatische Analyse des Th2-Transkriptoms sagt voraus, dass der IRE1a-XBP1-Signalweg die Expression der IL5- und IL13-Gene positiv steuert, da beide Gene nach IRE1a-Hemmung als differenziell exprimierte Gene identifiziert wurden (Additional file 2: Tabelle S1). Wir bestätigten diese Vorhersage durch RT-qPCR-vermittelte Genexpressionsanalysen (Additional file 1: Abbildung S6A, mittleres und rechtes Feld) und Durchflusszytometrie (Abb. 6). Diese Ergebnisse deuten auf eine transkriptionelle Beteiligung des Weges hin, der IL5 und IL13 reguliert. Bemerkenswert ist, dass die mRNA- und Proteinspiegel von IL4 nicht beeinflusst werden, was auf eine spezifische Regulierung von IL5 und IL13 hindeutet.

IRE1a-XBP1-Signalweg erleichtert aktivierungsabhängige T-Helferzellproliferation

Die Zellproliferationsrate ist ein Ergebnis der Interaktion zwischen positiven und negativen Regulatoren. Wir beobachteten, dass Gene, die sowohl für positive als auch für negative Regulatoren der Zellproliferation kodieren, unterschiedlich exprimiert werden, wenn der IRE1a-XBP1-Signalweg durch 4μ8c blockiert wurde (Abb. 7a, linkes Feld, Zusatzdatei 7: Tabelle S6), von denen sich viele Gene als direkte Ziele von XBP1 herausstellten (Abb. 7a, rechtes Feld, Zusatzdatei 8: Tabelle S7). Diese Beobachtung lässt eine Veränderung der Proliferationsrate bei Hemmung von IRE1a erwarten. Daher waren wir daran interessiert, die Wirkung der IRE1a-XBP1-Hemmung auf die Zellproliferation zu überprüfen. Wir führten einen Zellproliferationstest mit Th2-Zellen durch. Naive CD4+ T-Zellen aus der Milz wurden mit CellTrace violet markiert und unter Th2-Differenzierungsbedingungen in Anwesenheit oder Abwesenheit von 4μ8c aktiviert. Der Zerfall des Fluoreszenzfarbstoffs wurde durchflusszytometrisch überwacht. Wir fanden heraus, dass die Herunterregulierung von XBP1s die Zellproliferation signifikant hemmt (Abb. 7b), aber nicht zum Zelltod führt (Additional file 1: Figure S7).

IRE1a-XBP1-Signalweg fördert aktivierungsabhängige Th2-Zellproliferation und Zellzyklus. a Linkes Feld: Hierarchisches Clustering der unterschiedlich exprimierten, mit Zellproliferation assoziierten Gene im 4μ8c-behandelten und unbehandelten Th2-Transkriptom. Rechtes Feld: Hierarchisches Clustering der direkten XBP1-Zielgene, von denen bekannt ist, dass sie an der Zellproliferation beteiligt sind. Die Heatmap zeigt skalierte Expressionswerte als Z-Score in einer rot-blauen Farbskala, wobei Rot eine erhöhte Expression und Blau eine verringerte Expression anzeigt. b Naive T-Helferzellen aus der Milz wurden mit dem Farbstoff CellTrace Violet angefärbt und 72 Stunden lang unter Th2-Differenzierungsbedingungen aktiviert und durchflusszytometrisch analysiert. Generationen von Th2-Zellen sind im Histogramm der Zellproliferation „rot“ und 4μ8c-behandelte Zellen „blau“ dargestellt (linkes Feld, ein repräsentatives Experiment). Grafische Darstellung des Teilungsindexes aus fünf unabhängigen biologischen Wiederholungen (rechtes Feld)

Die Proliferation von T-Helferzellen ist mit Differenzierung und Zytokinproduktion verbunden. Die verringerte IL5- und IL13-Expression (Abb. 6) könnte möglicherweise dadurch erklärt werden, dass die Zellproliferation gebremst ist. Wäre jedoch eine verringerte Proliferation der Hauptgrund für die fehlende Sekretion, würde auch die IL4-Produktion gehemmt werden. Wir konnten jedoch keine signifikante Veränderung der IL4-Expression bei der Hemmung von IRE1a beobachten (Abb. 6, Additional file 1: Abbildung S6A). Um diese Diskrepanz weiter zu untersuchen, führten wir Zellproliferationstests mit IL13-GFP- und IL4-GFP-Reporter-Mauslinien durch. Bei IL4-GFP-exprimierenden Th2-Zellen beobachteten wir eine Hemmung der IL4-Produktion in den ersten Generationen der Zellteilung bis zu 72 Stunden nach der Behandlung mit 4μ8c (Additional file 1: Abbildung S8). Aber nach 96 Stunden wird der Unterschied in der IL4-Expression unbedeutend, unabhängig davon, in welcher Generation der Zellteilung sich die Zellen befinden. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die Verlangsamung der Proliferation durch die IRE1a-Hemmung nicht ausreicht, um die IL4-Expression zu hemmen. Im Gegensatz dazu beobachteten wir bei IL13-GFP eine Abnahme der IL13-Expression bereits in der ersten Generation, die sich auch in den späteren Generationen fortsetzt (Additional file 1: Abbildung S9).

IRE1a-Hemmung verzögert die Zellzyklusprogression durch die S- und G2/M-Phase

Die bioinformatische Analyse der unterschiedlich exprimierten Gene (Th2 vs. 4μ8c-behandeltes Th2) und der direkten Zielgene von XBP1 zeigt mehrere Gene, die an der Kontrolle der Zellzyklusprogression durch verschiedene Stadien beteiligt sind (d. h., G1, S, G2/M) beteiligt sind, wurden in zwei Gruppen geclustert, die hoch- oder herunterreguliert wurden (Abb. 8a). Wir nahmen Gene, die in 4μ8c-behandeltem Th2 im Vergleich zu unbehandeltem Th2 differenziell exprimiert wurden (angepasster p-Wert < 0,05) (Abb. 8a, links, Zusatzdatei 9: Tabelle S8), und die Gene, die XBP1 als direkte Zielgene differenziell exprimierten (Abb. 8a, rechts, Zusatzdatei 10: Tabelle S9), und überprüften sie auf bekannte Rollen in verschiedenen Zellzyklusstadien, indem wir entweder eine manuell kuratierte Liste auf der Grundlage von RNA-seq-Daten oder eine veröffentlichte Datenbank verwendeten. Wir fanden heraus, dass viele Gene aus allen Zellzyklusphasen (d. h. G1, S und G2/M) betroffen waren. Zur Identifizierung der Zellzyklusstadien, die durch den IRE1a-XBP1-Signalweg reguliert werden, haben wir einen transgenen FUCCI-Mausstamm (fluoreszierender Ubiquitin-Zellzyklusindikator) entwickelt und verwendet, der mCherry-markiertes Cdt1 und mVenus-markiertes Geminin-Protein exprimiert. Der Stamm ähnelt dem, der in verwendet wurde. Die G1-Zellen sind mCherry+ mVenus- (Q3; Abb. 8b), G1-S-Zellen sind mCherry+ mVenus+ (Q2; Abb. 8b) und SG2M sind mCherry- mVenus+ (Q1; Abb. 8b), während Zellen, die sich in Mitose befinden und in G1 eintreten, mCherry- mVenus- sind (Q4; Abb. 8b). Wir verglichen die Zellzyklusprofile von mit Vehikel und 4μ8c behandelten Th2-Zellen während der T-Zell-Aktivierung. Wir stellten fest, dass die Zellen in der S- und/oder G2/M-Phase akkumulierten, wenn der IRE1a-XBP1-Signalweg blockiert war (Abb. 8b). Ähnliche Ergebnisse wurden in einem anderen Ansatz unter Verwendung des BrdU-Inkorporationsassays mit DAPI-Färbung erzielt (Additional file 1: Figure S10).

IRE1a-Hemmung verzögert die Zellzyklus-Progression durch die S- und G2/M-Phase. a Linke Tafel: Heatmap der unterschiedlich exprimierten, mit dem Zellzyklus-Stadium assoziierten Gene im 4μ8c-behandelten und unbehandelten Th2-Transkriptom. Rechtes Feld: Heatmap der direkten Zielgene von XBP1, von denen bekannt ist, dass sie am Zellzyklus beteiligt sind. Die Heatmap zeigt skalierte Expressionswerte als Z-Score in einer rot-blauen Farbskala, wobei Rot für eine erhöhte Expression und Blau für eine verringerte Expression steht. b Zellzyklusanalyse von Th2-Lymphozyten nach 72-stündiger Aktivierung unter Verwendung der FUCCI-Mauslinie, die mCherry-markiertes CDT1 und Venus-markiertes GEMININ exprimiert. Oben links: Schematische Darstellung der Zellzyklusphasen in der verwendeten FUCCI-Maus. Oben rechts: Vergleich der Zellen (% der Gesamtzahl), die aus verschiedenen Stadien des Zellzyklus in Th2 und 4μ8c-behandelten Th2 (n = 6) stammen. Untere Felder: Ein repräsentatives FACS-Profil von Th2 und 4μ8c-behandeltem Th2 mit CDT1- und GEMININ-exprimierenden Zellen

Transgene Expression von XBP1s ergänzt die 4μ8c-vermittelte Hemmung der IRE1a-Endonukleaseaktivität

Um zu testen, ob die beobachteten 4μ8c-behandelten Phänotypen auf den Verlust von XBP1s zurückzuführen sind, führten wir Komplementationsversuche durch, indem wir einen XBP1s-Expressionsvektor in die Th2-Zellen in vitro transduzierten. Der Vektor kodierte die gespleißte Form von XBP1 (XBP1s), deren Funktion unabhängig von der IRE1a-Funktion ist. Wir fanden heraus, dass die stabile ektopische Expression von XBP1s die Wirkung der 4μ8c-Behandlung aufhebt und dass es keine signifikante Veränderung im Transkriptom nach der 4μ8c-Behandlung gibt, wenn Th2-Zellen XBP1s überexprimieren (Additional file 1: Abbildung S11A). XBP1s überexprimierende Th2-Zellen proliferieren und differenzieren in Gegenwart von 4μ8c normal (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S11B bzw. S11C). Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass die bei der Behandlung mit 4μ8c beobachteten Phänotypen auf den Verlust von XBP1s zurückzuführen sind.