Abstract

Magenkrebs gehört zu den häufigsten bösartigen Tumoren des Verdauungstrakts. Die Etablierung eines robusten und zuverlässigen Tiermodells ist die Grundlage für die Erforschung der Pathogenese von Krebs. In der vorliegenden Studie wurde ein Mausmodell des Magenkarzinoms etabliert, indem immunkompetente Mäuse mit MKN45-Zellen mittels Microcarrier beimpft wurden. Sechzig männliche C57BL/6-Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt: eine 2D-Gruppe, eine leere Trägergruppe und eine 3D-Gruppe, entsprechend dem Kokultursystem von MKN45 und dem Mikrocarrier. Die Mausmodelle wurden durch subkutane Injektion hergestellt. Die Zeit bis zur Tumorbildung, die Tumorbildungsrate und die pathologischen Merkmale wurden in jeder Gruppe beobachtet. In der 3D-Gruppe war die Tumorentstehungszeit kurz, während die Tumorbildungsrate hoch war (75 %). Weder in der 2D- noch in der Leerträgergruppe war eine Tumorbildung nachweisbar. Sowohl die H&E- als auch die immunhistochemische Färbung des Tumor-Xenograft zeigten charakteristische Anzeichen von menschlichen Magenneoplasmen. In der vorliegenden Studie wurde erfolgreich ein menschliches Magenkarzinom-Modell in immunkompetenten Mäusen etabliert, das ein neuartiges und wertvolles Tiermodell für die Krebsforschung und die Entwicklung von Krebsmedikamenten darstellt.

1. Einleitung

Mit jährlich etwa einer Million neu diagnostizierter Fälle stellt Magenkrebs eine ernsthafte Bedrohung für die Gesundheit und das Leben der Menschen weltweit dar. Die Pathogenese und die Mechanismen der Metastasierung von Magenkrebs sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. In-vivo-Modelle von Magenkrebs sind wichtige Instrumente zur Erforschung der biologischen Merkmale dieses Krebses und möglicher neuer Behandlungsoptionen. Xenotransplantationsmodelle für menschlichen Magenkrebs wurden in immundefizienten Mäusen, wie Nacktmäusen und Mäusen mit schwerer kombinierter Immunschwäche, entwickelt. Immundefiziente Mäuse lassen sich jedoch nicht leicht züchten und sind kostspielig. Außerdem spiegeln immundefiziente Mäuse nicht die wichtige Rolle des Immunsystems bei der Tumorentwicklung und -progression wider. Daher ist die Etablierung eines neuartigen humanen Magenkrebs-Xenograft-Modells in Mäusen mit einem normalen Immunsystem von großer Bedeutung. In der vorliegenden Studie wurden MKN45, menschliche Magenkrebszellen und der Mikroträger kokultiviert, und immunkompetente Mäuse wurden anschließend mit der Suspension geimpft, wodurch ein neuartiges menschliches Magenkrebs-Xenograft erfolgreich etabliert wurde.

2. Materialien und Methoden

2.1. Materialien

Roswell Park Memorial Institute- (RPMI-) 1640 Kulturmedium, Trypsin, fötales Rinderserum und Penicillin wurden von Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bezogen. Monoklonale Kaninchen-Antikörper gegen das humane Kohlenhydrat-Antigen 199 (CA199), Cytokeratin 7 (CK-7) und Caudal Type Homeobox 2 (CDX-2) wurden von Abcam (Cambridge, UK) erworben. Der Mikrocarrier-6 wurde von Elyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, USA) erworben.

2.2. Versuchstiere

Sechzig 6-8 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 22-25 g wurden von Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. (Lizenznummer: SCXK 20140007, Provinz Shandong, China) erworben und in einem speziellen pathogenfreien Tierzentrum am Affiliated Hospital of Jining Medical College (Provinz Shandong, China) untergebracht. Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee des Affiliated Hospital of Jining Medical University durchgeführt und in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien durchgeführt.

2.3. Zelllinien

Die MKN45-Zelllinie des menschlichen Magenkrebses wurde von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben und in RPMI-1640-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum und 100 U/mL Penicillin bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Das Kulturmedium wurde alle 24 Stunden gewechselt, und die Zellen wurden durch Verdauung mit 0,25% Trypsin geerntet.

2.4. Etablierung eines dreidimensionalen (3D) Tumorzellkulturmodells

Der Mikrocarrier-6 wurde 24 Stunden lang in 75%igem Ethanol getränkt, dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und 24 Stunden lang in RPMI-1640-Medium inkubiert. Anschließend wurde der Mikrocarrier-6 durch eine 3-stündige Inkubation mit Stromazell-abgeleitetem Faktor-1 alpha (SDF-1α) und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) modifiziert, beide in einer Konzentration von 100 ng/mL. Die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden nach der Trypanblau-Färbung gezählt und auf eine Konzentration von >95% Lebensfähigkeit eingestellt. Die MKN45-Zellsuspension wurde mit dem modifizierten Mikrocarrier-6 gemischt und weitere 24 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 bebrütet, um die Zellen mit dem Mikrocarrier zu sättigen, wie mikroskopisch beobachtet (Abbildungen 1(c) und 1(d)).

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2.5. Gruppierung der Tiere

Die 60 C57BL/6-Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen (20 Mäuse pro Gruppe) eingeteilt: die zweidimensionale (2D) Gruppe (Tiere, die mit containing geimpft wurden), die leere Trägergruppe (Tiere, die mit containing 30 μg Microcarrier-6 geimpft wurden), und die 3D-Gruppe (Tiere, die mit containing und 30 μg Microcarrier-6 geimpft wurden).

2.6. Erzeugung des Tiermodells

Das 3D-Tumorzellkulturmodell wurde am ersten Tag des Experiments etabliert und 24 Stunden lang inkubiert. Am zweiten Tag wurden die kultivierten Zell-Microcarrier-Komplexe dreimal gewaschen und vorsichtig gemischt, um die Konzentration auf Zellen und 300 μg Microcarrier-6 pro 1 ml Suspension einzustellen, und für die spätere Verwendung auf Eis gelegt. MKN45-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden geerntet, trypsinisiert, dreimal mit gewaschen und in einer Konzentration von resuspendiert, die zur späteren Verwendung auf Eis gelegt wurde. Der modifizierte Mikrocarrier-6 wurde dreimal mit gewaschen, in einer Konzentration von 300 μg/ml resuspendiert und für die spätere Verwendung auf Eis gelegt. Jede Maus in allen drei Versuchsgruppen wurde mit 100 μl der entsprechenden Lösung unter dem rechten Achselkamm geimpft.

2.7. Indikatordetektion und pathologische Untersuchung

Nach der Inokulation wurden die Mäuse nach Gruppen getrennt untergebracht, und täglich wurden Appetit, Aktivitäten und Gewicht überwacht. Die Zeit bis zur lokalen Tumorbildung und das Tumorvolumen wurden bei jeder Maus aufgezeichnet. Sobald Tumore sichtbar waren, wurden täglich der lange Durchmesser (a) und der kurze Durchmesser (b) jedes Tumors gemessen und das Tumorvolumen nach der Formel für das Tumorvolumen berechnet: . Die tumortragenden Mäuse wurden in drei Chargen geopfert: 10, 20 und 30 Tage nach der Inokulation. Das Tumorgewebe wurde jeder Maus vollständig entnommen, und die Tumorqualität, die Textur sowie der Grad der Infiltration und Nekrose wurden erfasst. Das Tumorgewebe wurde anschließend in 4 % neutral gepuffertem Formaldehyd fixiert und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Für die Immunhistochemie wurde die zweistufige EnVision-Färbetechnik verwendet. Die Färbeergebnisse wurden anhand der positiven granularen zytoplasmatischen Färbung des Tumors bestimmt. Negative (-ve) Färbung wurde definiert als <5% positiv gefärbte Zellen, und positive (+ve) Färbung wurde definiert als ≥5% positiv gefärbte Zellen.

2.8. Statistische Analyse

Für die statistische Analyse wurde die Software SPSS 13.0 (IBM SPSS, Chicago, IL, USA) verwendet. Die Messdaten werden als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben. Die Unterschiede zwischen den Mittelwerten der einzelnen Gruppen wurden mit Hilfe der einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) bzw. des Kruskal-Wallis-Tests verglichen. wird als statistisch signifikanter Unterschied angesehen.

3. Ergebnisse

3.1. Etablierung des In-vitro-MKN45-3D-Tumorkultursystems unter Verwendung des Microcarrier-6

Der Microcarrier-6 ist ein neuartiger Mikrocarrier, der aus positiv elektrifizierbaren organischen Polymeren mit einer mehrschichtigen porösen Struktur besteht. Die Porengröße, die positive Oberflächenladungsdichte und die Größe des Microcarrier-6 können durch chemische Synthese eingestellt werden. Mikrocarrier-6 des Typs C, mit kleinem Volumen, großer Porengröße und mehrfacher Raumfaltung, wird hauptsächlich für 3D-Zellkulturen und Experimente zur Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteln verwendet (Abbildungen 2(a) und 2(b)). Mikrocarrier-6 des Typs M, mit großem Volumen, kleiner Porengröße und geringer interner Faltungszeit, wird hauptsächlich für Tissue-Engineering-Forschung verwendet (Abbildungen 2(c) und 2(d)). In unserer Studie wurde Mikrocarrier-6 vom Typ C verwendet. Der Mikrocarrier-6 ist eine reine organische Verbindung, die nicht anfällig für Verunreinigungen ist, keine Verunreinigungen aufweist, eine geringe Immunogenität und einen geringen Stoffwechsel aufweist und sehr biokompatibel ist und eine stabile Mikroumgebung für das Zellwachstum bietet (Abbildungen 2(a)-2(d)). Darüber hinaus wird der Mikrocarrier-6 direkt in die Haut von Mäusen eingebettet, wodurch das Einwachsen von Blutgefäßen induziert wird (Abbildungen 2(e) und 2(f)), die eine ausreichende Blutversorgung für das Wachstum von Tumorzellen gewährleisten können. MKN45-Zellen adhärierten schnell in der 2D-Umgebung, und die Zellmorphologie, die nach 24 Stunden Kultur mikroskopisch beobachtet wurde, zeigte eine unregelmäßige Polygonform (Abbildung 1(a)). Der Mikrocarrier-6 wies eine unregelmäßige oder lange Spindelform und eine lockere Textur auf (Abbildung 1(b)). Nach einer 24-stündigen Kokultur von MKN45 und dem modifizierten Mikrocarrier-6 hafteten die MKN45-Zellen gut am Mikrocarrier und erreichten die Konfluenz. Darüber hinaus wurden unregelmäßige Zellcluster um die MKN45-Zellen herum beobachtet, die an dem Mikrocarrier-6 hafteten (Abbildung 1(c)). Die MKN45-Zell-Mikroträger-Komplexe wurden mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)-Lösung angefärbt, was eine große Anzahl von MKN45-Zellen zeigte, die an dem Mikrocarrier-6-Gerüst hafteten (Abbildung 1(d)). Die mehrschichtige poröse Struktur der Mikroträger kann unter dem Rasterelektronenmikroskop beobachtet werden (Abbildung 1(e)). MKN45-Zellen haften an den Mikroträgern, und die an der Oberfläche haftenden Zellen bilden Zellcluster (Abbildung 1(f)).

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Abbildung 2

Die Merkmale der Mikroträger-6 durch Mikroskopie. (a, b) Mikrocarrier-6 vom Typ C, kleines Volumen, große Apertur. (c, d) Mikrocarrier-6 vom Typ M, großes Volumen, kleine Öffnung. Die Porengröße, die positive Oberflächenladungsdichte und die Größe des Microcarrier-6 können durch chemische Synthese eingestellt werden. Der Mikrocarrier-6 ist mehrschichtig und vernetzt, um eine unregelmäßige „Labyrinth“-ähnliche Struktur mit ausreichend Platz zu bilden (b, d). Der Mikrocarrier-6 wird 5 Wochen lang direkt in die Haut von C57BL/6-Mäusen eingebettet, wodurch das Einwachsen von Blutgefäßen induziert wird (e, f). (e) Optisch sind die roten Flächen Blutgefäße. (f) Unter dem Mikroskop sind die dendritischen Schatten Blutgefäße.

3.2. Überleben der Mäuse und Tumorbildung

Während des Versuchs wurde keine signifikante Veränderung des Appetits, des Fells oder des Körpergewichts zwischen den Gruppen festgestellt (Tabelle 1). Die Mäuse in der 3D-Gruppe zeigten eine Woche nach der Inokulation eine leichte Abnahme der Aktivität. In keiner Gruppe starben Tiere, und in den Gruppen mit leerem Träger oder der 2D-Gruppe wurde während des 30-tägigen Versuchs keine Tumorbildung festgestellt. Bei 15 der 20 Mäuse in der 3D-Gruppe wurden 7-10 Tage nach der Inokulation subkutane Massen durch Abtasten festgestellt, was auf eine Tumorbildungsrate von 75 % schließen lässt (Tabelle 1). Die Tumor-Xenografts wuchsen schnell und wurden etwa 10 Tage nach der Inokulation als subkutane Massen beobachtet (Abbildung 3(a), ergänzende Abbildung 3). Die Tumor-Xenografts wuchsen innerhalb von 2 bis 3 Wochen nach der Inokulation auf eine Größe von 0,5-1,0 cm3 an. Die Tumor-Xenotransplantate ließen sich leicht von den angrenzenden Geweben abgrenzen und wiesen eine relativ gleichmäßige Form auf, waren meist rund oder oval, von grauweißer oder grauroter Farbe und hatten eine reichliche periphere Blutversorgung (Abbildungen 3(b) und 3(c) und ergänzende Abbildung 3). Es gab histologische Veränderungen an der Injektionsstelle in der leeren Trägergruppe, aber keine Veränderungen in der 2D-Gruppe (Abbildungen 3(d) und 3(e)). In der leeren Trägergruppe wurden kleine subkutane Massen mit einer gelben Farbe beobachtet (Abbildung 3(d)).

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Abbildung 3

Histologische Veränderungen an den Injektionsstellen der verschiedenen Gruppen. (a, b, c) Große subkutane Massen wurden 10 Tage nach der Inokulation in der 3D-Gruppe beobachtet. (b, c) Die Xenotransplantate ließen sich leicht von den angrenzenden Geweben abgrenzen und wiesen eine relativ regelmäßige Form auf, waren meist rund oder oval und von grauweißer oder grauroter Farbe. (d) In der leeren Trägergruppe wurden kleine subkutane Massen mit gelber Farbe beobachtet. (e) In der 2D-Gruppe wurde keine subkutane Masse beobachtet.

3.3. H&E-Färbung

Die lichtmikroskopische Histomorphologie zeigte eine große Anzahl ungeordneter und atypischer Zellen in den Tumor-Xenografts von Mäusen aus der 3D-Gruppe (Abbildungen 4(a)-4(c)). 10 Tage nach der Inokulation wurden eine große Anzahl heterotypischer Zellen, restliche Mikroträger und reichlich Blutgefäße beobachtet (Abbildung 4(a)). 20 Tage nach der Inokulation wurden eine geringe Anzahl an verbleibenden Mikroträgern (Abbildung 4(b)) und eine große Anzahl an nekrotischen Läsionen (Abbildung 4(d)) beobachtet. 30 Tage nach der Inokulation waren die Mikrocarrier jedoch weitgehend eliminiert (Abbildung 4(c)). In der leeren Trägergruppe wurden eine große Anzahl von Mikrocarriern und eine geringe Anzahl von Entzündungszellen beobachtet, aber keine Tumorzellen gefunden (Abbildung 4(e)).

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Abbildung 4

H&E und immunhistochemische Färbung eines menschlichen Magenkrebs-Xenograft (200x). (a) 10 Tage nach der Inokulation wurden eine große Anzahl heterotypischer Zellen, restliche Mikroträger und reichlich Blutgefäße beobachtet. (b, d) Eine geringe Anzahl an verbleibenden Mikroträgern (b) und eine große Anzahl nekrotischer Läsionen (d), 20 Tage nach der Inokulation. (c) 30 Tage nach der Inokulation sind fast keine restlichen Mikroträger mehr zu finden. (e) Eine große Anzahl von Mikrocarriern und eine geringe Anzahl von Entzündungszellen wurden in der leeren Carrier-Gruppe gesehen. Blaue Pfeile weisen auf Blutgefäße hin, rote Pfeile auf heterotypische Zellen und schwarze Pfeile auf restliche Mikrocarrier (a, b, c). Graue Pfeile weisen auf nekrotische Läsionen hin (d), und grüne Pfeile auf Entzündungszellen (e). Das menschliche Magenkrebs-Xenotransplantat zeigte eine diffuse und starke Immunreaktivität im Zytoplasma oder in den Kernen der Krebszellen. (f) CA199, (g) CK-7 und (h) CDX-2.

3.4. Immunhistochemie

Die Immunhistochemie wurde an Tieren durchgeführt, die 20 Tage nach der Tumorverpflanzung eingeschläfert wurden. Das Tumor-Xenotransplantat-Gewebe wies eine positive CA199-, CK-7- und CDX-2-Färbung auf (Abbildungen 4(f)-4(h)) und bestätigte damit, dass es sich bei den atypischen Zellen um menschliche Tumorzellen handelte.

4. Diskussion

Tiermodelle wurden ausgiebig verwendet, um die Pathogenese und die metastatischen Mechanismen von Magenkrebs zu untersuchen, und spielen eine äußerst wichtige Rolle bei der Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von therapeutischen Medikamenten. Gegenwärtig werden für Magenkrebs hauptsächlich folgende Tiermodelle verwendet: das Induktionsmodell, das Transplantationsmodell und das gentechnische Modell. Unter den drei Modelltypen ist das Transplantationsmodell leicht zu handhaben und daher weit verbreitet. Die Art der Versuchstiere, die Tumor-Xenografts sowie der Ort und der Weg der Transplantation gelten als Faktoren, die den Erfolg der Xenotransplantationsmodelle beeinflussen. Mäuse mit Defekten in der Immunfunktion, wie z. B. Nacktmäuse und Mäuse mit schwerer kombinierter Immunschwäche (SCID), werden häufig für Xenograft-Modelle verwendet. Aufgrund der vergleichsweise hohen Kosten, der kurzen Lebensdauer und der fehlenden Immunantwort auf Tumore bei Mäusen mit Immundefizienz haben wir für das Xenotransplantationsmodell immunkompetente C57BL/6-Mäuse ausgewählt, um die Nachteile von Mäusen mit Immundefizienz zu vermeiden. Es wird allgemein angenommen, dass das Auftreten von Magenkrebs nicht mit dem Östrogenspiegel zusammenhängt und dass die Inzidenz von Magenkrebs bei Männern höher ist als bei Frauen. Daher haben wir männliche Mäuse als Modelle verwendet. Darüber hinaus wurden in der vorliegenden Studie MKN45-Zellen des menschlichen Magenkrebses für das In-vitro-Modell verwendet, vor allem wegen der starken invasiven und metastatischen Eigenschaften dieser Zelllinie. Darüber hinaus wurden die subkutane Region unter dem Arm und die ektopische Transplantation als Ort bzw. Weg der Tumorzelltransplantation ausgewählt, da dieser Bereich reichlich durchblutet ist und eine lockere Gewebestruktur aufweist, die das Tumorwachstum in Mäusen erleichtert.

Als Brücke zwischen dem 2D-Zellkultursystem und dem Tiermodell simuliert das 3D-Zellkultursystem die Mikroumgebung des Tumorzellwachstums besser und ist zu einem attraktiven Thema in der aktuellen Forschung geworden. Bei der 3D-Kultur von Krebszellen werden Tumororganoide gebildet, und Maus-Tumor-Xenograft-Modelle, die auf Tumororganoiden basieren, werden bereits für das Screening von Krebsmedikamenten eingesetzt. In der vorliegenden Studie wurden die neuartigen Microcarrier-6- und MKN45-Zellen für die Kokulturexperimente verwendet, um erfolgreich ein 3D-Wachstumsmodell zu etablieren. Wir haben den Microcarrier-6 direkt in das subkutane Gewebe von Mäusen eingebettet, damit Blutgefäße in die Microcarrier eindringen können, was einen besonderen Vorteil darstellt, der mit anderen Microcarriern nicht erreicht wird. In Studien wurde über eine milde Immunsuppression von immunkompetenten Mäusen berichtet, um eine Resistenz gegen menschliche Tumorzellen zu erreichen und so ein erfolgreiches Tumormausmodell zu etablieren; bisher gibt es jedoch keine Berichte über eine erfolgreiche ektopische Transplantation eines menschlichen Tumors in normale Mäuse unter nicht immunsuppressiven Bedingungen. Auch als wir die Konzentration der MKN45-Zellen anpassten und jeder Maus sofort 100 μl MKN45-Zellsuspension subkutan injizierten, wurde aufgrund der starken Immunabwehr der ektopisch transplantierten menschlichen Tumorzellen keine stabile Tumorbildung erreicht. Der in der vorliegenden Studie verwendete Mikrocarrier-6 wies eine geringe Immunogenität und eine lockere Textur mit zahlreichen Poren in der Mitte auf, was das Wachstum der Tumorzellen erleichterte. Der Microcarrier-6 fungierte auch als Barriere, die die Immunzellen daran hinderte, die Tumorzellen direkt abzutöten. Der modifizierte Mikrocarrier-6 ermöglichte es den Blutgefäßen, leicht in den Tumor hineinzuwachsen, was geeignete Bedingungen für ein schnelles Wachstum der Tumorzellen bot.

Die zelluläre Immunität ist die wichtigste Waffe gegen das Tumorwachstum; zu den beteiligten Zellen gehören hauptsächlich T-Zellen, natürliche Killerzellen, Makrophagen und dendritische Zellen. Aufgrund der unregelmäßigen „Labyrinth“-ähnlichen Struktur des Microcarrier-6 kann dieser kurzfristig als Barriere wirken und die direkte Abtötung von Tumorzellen durch Immunzellen bis zu einem gewissen Grad blockieren. Darüber hinaus wurde der Microcarrier-6 drei Stunden vor dem Experiment mit SDF-1α und VEGF modifiziert, um die Bildung von Blutgefäßen zu beschleunigen und die Blutversorgung für ein schnelles Tumorwachstum zu gewährleisten, was die antitumorale Immunwirkung der Mäuse übertraf. Gleichzeitig stellten wir fest, dass die Makrophagen im peripheren Blut und im Milzgewebe der Mäuse in der frühen Phase der transplantierten Tumorbildung im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe deutlich reduziert waren (ergänzende Abbildung 1). Die Anzahl der Knochenmarkmakrophagen nahm zwischen der leeren Trägergruppe, der 2D-Gruppe und der 3D-Gruppe allmählich ab, aber es gab keine statistische Signifikanz (ergänzende Abbildung 2A, 2B). Verglichen mit der leeren Trägergruppe war die Anzahl der Milz-T-Lymphozyten in der 2D-Gruppe reduziert, aber es gab keine statistische Signifikanz (ergänzende Abbildung 2C). Die Anzahl der Milz-T-Lymphozyten in der 3D-Gruppe war signifikant geringer als in der 2D-Gruppe (ergänzende Abbildung 2C). Dies deutet darauf hin, dass das Wachstum des Tumors das Immunsystem hemmte, so dass der Tumor schnell wachsen konnte.

In der vorliegenden Studie wurde ein 3D-Wachstumsmodell für MKN45-Zellen entwickelt, in dem erfolgreich ein menschliches Magenkrebs-Xenograft-Modell in immunkompetenten Mäusen in der 3D-Gruppe etabliert wurde, während die Mäuse in der 2D- und leeren Trägergruppe keine Tumore bildeten. Dieses Xenograft-Modell zeichnete sich durch ein schnelles Wachstum der Tumore aus, die 7-10 Tage nach der Inokulation mit der Hand ertastet werden konnten und 10-15 Tage nach der Inokulation ein optimales Wachstum erreichten; das Tumorvolumen betrug etwa 20 Tage nach der Inokulation 0,5-1,0 cm3. Eine große Anzahl von Zellen mit Kernatypien, die Muskel- und Fettgewebe infiltriert hatten, wurden durch H&E-Färbung nachgewiesen. Reste von Microcarrier-6 waren von Entzündungszellen umgeben und bildeten Granulome mit einem großen Nekrosebereich in der Mitte, was wahrscheinlich auf eine unzureichende Blutversorgung aufgrund des schnellen Tumorwachstums zurückzuführen war. Diese Phänomene stimmen mit der Tumorentwicklung beim Menschen überein. Außerdem befanden sich die reichlich vorhandenen Kapillaren hauptsächlich in der Peripherie der Tumore. Derzeit gibt es keinen spezifischen Tumormarker für Magenkrebs; CA199, CK-7 und CDX-2 werden jedoch üblicherweise als Marker für gastrointestinale Tumore verwendet. Daher haben wir diese drei Marker für die Markierung und Identifizierung von menschlichen Magenkrebszellen ausgewählt. Die immunhistochemische Färbung von CA199, CK-7 und CDX-2 war positiv und bestätigte, dass es sich bei den heteromorphen Zellen um menschliche Magenkrebszellen handelte.

5. Schlussfolgerungen

Wir haben erfolgreich ein menschliches Magenkrebs-Xenograft-Modell in immunkompetenten Mäusen etabliert. Dieses Modell kann die Interaktion zwischen dem körpereigenen Immunsystem und Tumoren widerspiegeln und hat breite Anwendungsperspektiven in der zukünftigen Forschung zur Tumorimmunität sowie zur Erforschung und Entwicklung neuer Medikamente.

Datenverfügbarkeit

Die Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Beiträge der Autoren

Yanzhen Bi, Quanyi Wang und Yonghong Yang haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81170395 und 81570556), der Natural Science Foundation of Jilin Province (20180101137JC und 20180101130JC) und des Research Fund for Lin He’s Academician Workstation of New Medicine and Clinical Translation in Jining Medical University (JYHL2019FMS21) unterstützt.

Ergänzende Materialien

Die Veränderungen von Entzündungszellen und andere tumorigene Daten. Ergänzende Abbildung 1: Die Veränderungen der Entzündungszellen in tumortragenden Mäusen während der frühen Phase der transplantierten Tumorbildung. Ergänzende Abbildung 2: die Veränderungen der Entzündungszellen in verschiedenen Gruppen während der frühen Phase der transplantierten Tumorbildung. Ergänzende Abbildung 3: Tumortragende Mäuse und transplantiertes Tumorgewebe. (Ergänzende Materialien)