Um die große evolutionäre Distanz zwischen den heutigen Wirbeltieren und dem Ur-Chordatier mit einem nicht verdoppelten Genom zu überbrücken, rekonstruierten Sacerdot und Kollegen zunächst das Genom des Ur-Amnioten. Dazu wendeten sie zunächst den Algorithmus AGORA (Algorithm for Gene order Reconstruction in Ancestors), den sie zuvor entwickelt hatten, auf die Genordnungen, Ausrichtungen und Genbäume von 61 Genomen lebender Tiere aus der Ensembl-Datenbank an. Dazu gehörten 40 Säugetiere, 3 Vögel, 2 Reptilien, 1 Amphibie, 8 Teleosteer, 1 Quastenflosser, 2 Manteltiere, 1 Nematode und 1 Fliege. Leider enthält Ensembl nicht das Genom eines Knorpelfisches (z. B. des Elefantenhais, Callorhinchus milii, einer Chimäre, die das sich am langsamsten entwickelnde Wirbeltiergenom besitzt) oder das von Hemichordaten, Stachelhäutern oder Cephalochordaten – wirbellosen Deuterostomiern, deren Genome nicht den beträchtlichen Genverlust und die Verdichtung erfahren haben, die für die Genome von Manteltieren charakteristisch sind.

Sacerdot et al. identifizierten dann mutmaßliche ohnologe Genpaare in diesem Amniotengenom und erstellten Sätze von zusammenhängenden Vorfahrenregionen (CARs). Ohnologe sind homologe Gene innerhalb einer Art, die sich aus WGDs ergeben. Schließlich gruppierten sie diese CARs zu einer Gruppe von 51, die signifikant in 17 Vierergruppen oder Tetraden fielen; das erwartete Ergebnis von zwei Runden WGD. Um das Muster der Chromosomenfusionen und -spaltungen im Laufe der Evolution zu erkennen, wollten sie diese 17 Tetraden mit der Organisation von Genen in einem nicht duplizierten Genom von Prä-Wirbeltieren vergleichen. Die Genome von Manteltieren entwickeln sich jedoch sehr schnell und unterscheiden sich stark von denen anderer wirbelloser Deuterostomier, während das veröffentlichte Genom des Cephalochordaten Branchiostoma floridae für die Analyse zu stark fragmentiert ist. Daher verglichen die Autoren ihre 17 Tetraden von CARs mit den 17 Vorfahren der Chordaten, die zuvor durch einen Vergleich der Syntenie von Genen auf menschlichen Chromosomen und auf Gerüsten des B. floridae-Genoms bestimmt wurden. Bemerkenswerterweise korrelierte jede dieser Chordaten-Bindungsgruppen mit einer vorherrschenden CAR-Tetrade. Aus diesem Vergleich schlossen sie, dass das Genom der Ur-Wirbeltiere aus 17 Chromosomen bestand, die sich dann durch eine Runde WGD (1R) zu 34 Chromosomen verdoppelten. Anschließend gab es 7 Chromosomenfusionen, die zu 27 Chromosomen führten, die sich am Ursprung der Wirbeltiere, vor der Agnathan/Gnathosomenspaltung, erneut zu 54 Chromosomen verdoppelten (2R WGD). Nach der 2R WGD gab es vier weitere Fusionen vor dem Stamm der knöchernen Wirbeltiere, gefolgt von einer fünften Fusion vor der Basis der Amnioten. Somit umfasste der Karyotyp der Knochenwirbeltiere 50 Chromosomen und der der Amnioten 49 Chromosomen (Abb. 1b).

Der AGORA-Algorithmus kann nicht nur Duplikationen, Fusionen und Spaltungen von Chromosomen während der Evolution rekonstruieren, sondern auch die Reihenfolge der Gene auf den Chromosomen des hypothetischen Amniotenvorfahren berechnen, indem er die Reihenfolge der Gene auf den Chromosomen seiner heutigen Nachkommen vergleicht. Dieses rekonstruierte Genom des Amniotenvorfahren enthält 80 % der 15 854 Gene in den CARs. Die ungleiche Verteilung dieser Gene auf die 49 Chromosomen des Ur-Amnioten könnte die Realität widerspiegeln oder auch die Schwierigkeit, die Genreihenfolge auf Chromosomen zu rekonstruieren, die im Laufe der Evolution eine beträchtliche Umlagerung von Genen erfahren haben.

Allerdings fallen bei der Analyse zwei Dinge auf. Die erste ist, dass der Vergleich des Genoms der Ur-Amnioten mit den CARs, die in 17 Tetraden gruppiert sind, mit den Super-Scaffolds des Neunaugen-Genoms (Petromyzon marinus) ein klares 1-zu-4-Muster zeigt, das mit der 2R-WGD vor der Agnathan/Gnathostom-Split übereinstimmt. Dies steht im Widerspruch zu den Ergebnissen von Smith et al., die im Vergleich zum Huhn starke Belege für nur 1R WGD beim Neunauge fanden. Diese Diskrepanz könnte dadurch erklärt werden, dass bei der Rekonstruktion des hypothetischen Vorfahren der Amnioten Genomdaten von mehr Arten einbezogen wurden, ein Prozess, der an sich auch störende Genomumlagerungen eliminiert, die bei Wirbeltieren nach dem Vorfahren der Amnioten aufgetreten sind. Dies ist wahrscheinlich auch auf die Einbeziehung phylogenetischer Daten zur Bestimmung der CAR-Tetrads zurückzuführen, wodurch Ohnologe aufgedeckt werden, die an der Basis der Wirbeltierevolution divergierten.

Das zweite auffällige Ergebnis ist die Übereinstimmung zwischen der Genreihenfolge auf den menschlichen Chromosomen und den 17 Prä-1R-Chromosomen. Wenn man die 17 Prä-1R-Chromosomen farblich kodiert (Abb. 1b) und die Farben der einzelnen Gene auf die Positionen der 8282 menschlichen Gene überträgt, die von den Prä-1R-Genen abstammen, wird das Muster der Genomverdopplungen und Translokationen deutlich. Chromosom 1 im Prä-1R-Genom enthält zum Beispiel Hox-Gene. Ein großer Abschnitt des menschlichen Chromosoms 2 enthält den HoxD-Cluster sowie viele andere Gene, die denen auf dem Prä-1R-Chromosom 1 entsprechen. Die anderen 3 menschlichen Hox-Cluster befinden sich auf den menschlichen Chromosomen 7, 12 und 17. Darüber hinaus befindet sich eine beträchtliche Anzahl von Homologen anderer Gene auf dem Prä-1R-Chromosom 1 auf den menschlichen Chromosomen 1, 3, 10, 16 und 22, was auf Translokationen hinweist.