Allgemeine Beschreibung

Gebrauchsfertige dCas9-VP64 lentivirale Partikel ermöglichen die sofortige Transduktion einer breiten Palette von Zelllinien. dCas9-VP64 lentivirale Partikel integrieren effizient und stabil dCas9-VP64 und eine Blasticidin-Resistenzkassette, die durch ein 2A-Peptid verknüpft ist und durch den EF1-alpha-Promotor (EF1a-dCas9-VP64-2A-Blasticidin) angetrieben wird, für eine starke Expression sowohl in sich teilenden als auch in sich nicht teilenden Zelllinien. Sie sind ideal, um den langwierigen Prozess der Lentivirus-Produktion zu vermeiden und sind Teil eines dreiteiligen CRISPR-Systems mit individuellem dCas9-VP64. MS2-p65-HSF1 und gRNA-Expressionsvektoren.
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Anwendung

Funktionelle Genomik/Zielvalidierung
– Unvoreingenommenes vorwärtsgenetisches Screening
– Starke Transkriptionsaktivierung in mehreren Zelllinien
– Erstellung von Zelllinien, die dCas9-VP64 stabil exprimieren.

Eigenschaften und Vorteile

– Hochspezifisch und hochaktiv
– Sequenzgeprüfte, hochreine, hochtitrige lentivirale Partikel
– Aktiviert Gene durch Transkriptionsaktivierung anstatt durch cDNA-basierte Überexpression
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Prinzip

CRISPR/Cas-Systeme werden von Bakterien und Archaeen zur Abwehr von eindringenden Viren und Plasmiden eingesetzt. Kürzlich wurde das Typ-II-CRISPR/Cas-System aus dem Bakterium Streptococcus pyogenes so verändert, dass es in eukaryotischen Systemen funktioniert, wobei zwei molekulare Komponenten verwendet werden: ein einzelnes Cas9-Protein und eine nicht-kodierende Leit-RNA (gRNA). Die Cas9-Endonuklease kann durch Mutationen in den beiden Proteindomänen RuvC und HnH (D10A bzw. H840A), die für die Nukleaseaktivität verantwortlich sind, inaktiviert werden (dCas9). Das Nuklease-defiziente Protein kann dann mit dem Transkriptionsaktivator VP64 fusioniert und in Verbindung mit einer mit MS2-RNA-Aptameren modifizierten Leit-RNA verwendet werden, die die zusätzlichen Transkriptions-Koaktivatoren p65 und HSF1 rekrutiert. Der zusammengesetzte SAM-Komplex wird dann als Ladungstransportsystem für Zielgenpromotoren verwendet und ermöglicht eine ortsspezifische Transkriptionsaktivierung des gewünschten Gens.

Einheit Definition

VP/mL ist die Konzentrationseinheit für den durch den p24-Assay geschätzten viralen Titer.