ORIGINAL PAPER

Biochemische und pharmakologische Untersuchung des Giftes der Wolfsspinne Lycosa singoriensis

Liu ZHI; Qian WII; Li JI; Zhang YI; Liang SI

ICollege of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha, China
IIAdministrative Center for Basic Research, Ministry of Science and Technology, China

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ABSTRACT

Die Wolfsspinne Lycosa singoriensis ist eine große und giftige Spinne, die im gesamten Nordwesten Chinas verbreitet ist. Wie andere Spinnengifte ist auch das Wolfsspinnengift ein chemischer Cocktail. Sein Proteingehalt beträgt 0,659 mg Protein/mg Rohgift, bestimmt nach der Lowry-Methode. Die MALDI-TOF-Analyse ergab, dass die Giftpeptide sehr vielfältig sind und in drei Gruppen eingeteilt werden können, die durch drei unabhängige Molekularbereiche gekennzeichnet sind: 2.000 bis 2.500 Da, 4.800 bis 5.500 Da bzw. 7.000 bis 8.000 Da. Diese molekulare Verteilung unterscheidet sich erheblich von der der meisten bisher untersuchten Spinnengifte. Dieses Wolfsspinnengift hat eine geringe neurotoxische Wirkung auf Mäuse, kann aber die Hämolyse menschlicher Erythrozyten auslösen. Darüber hinaus zeigt das Gift antimikrobielle Aktivität gegen prokaryotische und eukaryotische Zellen.

Schlüsselwörter: Spinne, Lycosa singoriensis, Rohgift, MALDI-TOF, antimikrobielle Aktivität.

EINLEITUNG

Es gibt etwa 39.000 beschriebene Spinnenarten, wobei eine noch größere Anzahl auf ihre Charakterisierung wartet. Fast alle Spinnen sind Raubtiere und haben Giftdrüsen. Der Hauptzweck der Spinnengifte besteht darin, die Beute zu töten oder zu lähmen. Spinnengifte sind komplexe chemische Cocktails, bei denen Peptide die Hauptbestandteile der meisten Spinnengifte sind, mit Ausnahme der Gifte der Schwarzen Witwe, die einen hohen Anteil an Proteinen mit mehr als 100 kD enthalten (1-3). Die Spinnengiftpeptide werden auf kombinatorische Weise hergestellt, was zu einer geschätzten Gesamtzahl von etwa 1,5 Millionen Spinnengiftpeptiden führt. Folglich sind Spinnengifte eine reichhaltige Quelle pharmakologisch und agrochemisch interessanter neuer Verbindungen, die in den letzten Jahren von Pharmakologen und Biochemikern zunehmend Beachtung gefunden haben. In den letzten Jahrzehnten wurden jedoch nur wenige Spinnengifte ausreichend detailliert untersucht, so dass bisher weniger als 0,01 % der Spinnengiftpeptide identifiziert wurden (4-7).

Die Wolfsspinne Lycosa singoriensis ist eine große Spinne, die in ganz Nordwestchina verbreitet ist. Die erwachsene weibliche Spinne hat eine Körperlänge von 28 bis 40 mm (35±6 mm) und ein Körpergewicht von 2,6 bis 7 g (Abbildung 1). Diese haarige Spinne lebt in unterirdischen Höhlen. Ihre mit einem Seidenschlauch ausgekleidete Höhle hat einen Durchmesser von 2 bis 4 cm und eine Länge von 30 bis 60 cm, und der Höhleneingang ist oft mit einem Seidennetz bedeckt. Die Spinne verbringt den Tag zusammengekauert am Boden der Höhle, während sie den Seidenschlauch hinaufsteigt und sich in der Nähe des Höhleneingangs versteckt, um in der Nacht auf Beute zu warten. Wenn es ihr gelingt, ein Opfer zu fangen, bringt sie es in die Höhle. In vielen Fällen finden sich am Boden der Höhle Reste von kleinen Insekten. Die Wolfsspinne Lycosa singoriensis ist ebenfalls eine giftige und aggressive Spinne. Im Jahr 2000 wurde über Wolfsspinnenbisse bei Menschen und anderen Tieren in der nördlichen Region der Provinz Xinjiang berichtet. Den klinischen Aufzeichnungen zufolge verursachten die meisten Spinnenbisse sichtbare Auswirkungen, einschließlich roter Flecken und Schmerzen an den Bissstellen (8, 9).

In dieser Studie berichten wir über die biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften des Giftes der Wolfsspinne Lycosa singoriensis. Im Vergleich zu vielen anderen bisher untersuchten Spinnengiften weist dieses Spinnengift einige besondere Eigenschaften auf, die es zu einer nützlichen Quelle für das Screening von Wirkstoffkandidaten und für die Untersuchung der Biodiversität von Spinnengiftpeptiden machen.

MATERIALIEN UND METHODEN

Spinnen und Giftersammlung

Ausgewachsene weibliche Lycosa singoriensis Spinnen wurden in der Provinz Xinjiang, China, gesammelt, in Plastikeimern gehalten, die mit Plastiknetzen abgedeckt waren, und täglich mit Wasser versorgt. Die Tiere wurden mit gehackter Schweineleber und Würmern gefüttert. Wie viele andere große Spinnen (10, 7) werden Lycosa singoriensis leicht aggressiv, wenn sie durch ein Stück Plastikschlauch provoziert werden. Sie packen den Schlauch fest, und dann durchbohren ihre Giftzähne den Schlauch und injizieren Gift hinein. Auf diese Weise wird eine elektrische Stimulation vermieden, die das Gift mit Enzymen aus Speichel und Verdauungsflüssigkeiten kontaminieren kann. Mit dieser Methode könnten etwa 50 mg Gift von etwa 300 Lycosa singoriensis-Spinnen gewonnen werden, was die Erforschung der biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften dieses Spinnengifts ermöglicht. Das Rohgift ist eine klare und farblose Flüssigkeit, die leicht in Wasser löslich ist und alle zwei Wochen gesammelt wurde. Gefriergetrocknetes Rohgift wurde vor der Analyse bei -20°C gelagert.

SDS-PAGE-Analyse des Rohgifts

Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) des gesammelten Gifts wurde unter denaturierten Bedingungen in einem 10%igen Polyacrylamid-Gel durchgeführt. Einhundert Mikrogramm lyophilisiertes Gift wurden für die Elektrophorese verwendet, und die getrennten Proteine im Gel wurden durch G250-Färbung sichtbar gemacht.

MALDI-TOF-Analyse des Rohgifts

Der Fingerabdruck des Rohgifts wurde mit Hilfe der matrixunterstützten Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) bestimmt (Voyager-DE STR Biospectometry® Workstation, Applied Biosystems, USA). Die Ionisierung erfolgte durch Bestrahlung mit einem Stickstofflaser (337 nm) bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV; als Matrix wurde α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CCA) verwendet.

Die Wirkung des rohen Giftes auf isolierte Nervensynapsenpräparate

Drei Arten von isolierten Nervensynapsenpräparaten – Zwerchfellnerv der Maus, Vas deferens der Ratte und Krötenherz – wurden verwendet, um die pharmakologische Aktivität des rohen Giftes zu untersuchen. Die Experimente mit den Präparaten des Zwerchfellnervs der Maus wurden nach Bülbring (11) durchgeführt. Vas deferens Assays und Toad Heart Assays wurden nach Liang et al. (12) durchgeführt.

Hämolytischer Assay

Die hämolytische Aktivität des rohen Giftes wurde mit heparinisierten menschlichen roten Blutkörperchen getestet, die dreimal in 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS – 50 mM NaH2PO4 und 150 mM NaCl, pH 7,2) gespült und 5 Minuten lang bei 3.000 U/min zentrifugiert wurden. Die roten Blutkörperchen wurden dann bei Raumtemperatur eine Stunde lang in deionisiertem Wasser (Positivkontrolle), in PBS (Blindprobe) oder mit Giften in verschiedenen Konzentrationen (3,1 bis 20 mg/ml) in PBS inkubiert. Die Proben wurden 5 Minuten lang bei 12.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde vom Pellet abgetrennt und seine Absorption bei 570 nm gemessen.

Antimikrobielle Aktivität von Rohgift

Sechs Bakterien (Bacillus cereus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus albus und E. coli DH5) und zwei Pilze (Saccaromyces cerevisae und Candida albicans) wurden im Nährmedium bis zum Erreichen der exponentiellen Phase mit einer Absorption bei 600 nm von 0,3 bis 0,8 gezüchtet. Fünfzig Mikroliter des Mediums wurden gleichmäßig auf drei verfestigte Agarplatten verteilt. Die Platten wurden mit 1,5 % Agarose/Medium ausgefüllt und in 100 × 20 mm große sterile Petrischalen gegossen. Ein Filterpapier mit einem Durchmesser von 6 mm bedeckte die Platten. Fünf Mikroliter der Giftlösung in normaler Kochsalzlösung in verschiedenen Konzentrationen wurden auf das Filterpapier gegeben. Nach der Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Wirkungen des rohen Giftes als klare Kreise im Bakterienrasen auf dem Filterpapier aufgezeichnet.

Bei diesem Bioassay wurden also rohe Giftlösungen in verschiedenen Konzentrationen (3 mg/mL, 6 mg/mL und 12 mg/mL) auf das Filterpapier getropft, und ein klarer Kreis war auf dem Papier zu erkennen, wenn das Gift in dieser Konzentration das mikrobielle Wachstum gehemmt hatte.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Biochemische Charakterisierung des rohen Giftes

Es wurde festgestellt, dass jedes Milligramm des rohen Giftes etwa 0,659 mg Protein/Peptide enthält. Wie in Abbildung 2 dargestellt, verteilen sich die hochmolekularen Proteine des rohen Giftes hauptsächlich auf Molekularmassen zwischen 14 und 31.000 Da, wobei eine dicke Proteinbande bei 20.000 Da und eine weitere Bande bei 14.000 Da zu erkennen ist. Eine dicke Bande ist auch im oberen Teil des SDS-PAGE-Gels zu sehen, die aus Peptiden mit einer Molekularmasse von weniger als 10.000 Da besteht. Die in den beiden dicken Banden verteilten Proteine/Peptide sind die am häufigsten vorkommenden Bestandteile des rohen Giftes, die 80 % der Proteinkomponente des rohen Giftes entsprechen.

In jüngster Zeit wurde die MALDI-TOF-Massenspektrometrie eingesetzt, um die Komplexität der Giftpeptide aufzuklären. Mit der rasanten Entwicklung der Massenspektrometrie wurde diese Technologie auch in der Giftforschung breit eingesetzt (5, 13). So haben beispielsweise Pierre Escoubas et al. (5) ein Bild der Gifte gezeichnet, um die Komplexität der Gifte australischer Trichternetzspinnen mit Hilfe eines kombinierten cDNA- und massenspektrometrischen Ansatzes zu erfassen. Ihre Studien zeigen, dass die Gifte dieser Spinnen viele Hunderte von Peptiden enthalten, die einer bimodalen Verteilung folgen, wobei die Mehrheit der Peptide im Massenbereich von 3.000 bis 5.000 Da liegt und eine zweite, weniger ausgeprägte Gruppe im Bereich von 6.500 bis 8.500 Da. Diese Verteilung der Molekularmassen ist analog zu derjenigen, die zuvor für eine große Anzahl von Tarantelgiften beobachtet wurde (4). Ähnliche Ergebnisse wurden auch in unseren früheren Untersuchungen der Gifte der chinesischen Vogelspinnen Ornithoctonus huwena, Ornithoctonus hainana und Chilobrachys jingzhao (14-16) gefunden.

Wie in Abbildung 3 dargestellt, zeigt die MALDI-TOF-Spektrometrie-Analyse des rohen Gifts von Lycosa singoriensis, dass die Molekularmassenverteilung analog im Bereich von 1.000 bis 10.000 Da zu beobachten ist. Im Gegensatz zu den vorgenannten Arten lassen sich die Lycosa singoriensis-Giftpeptide jedoch anhand ihrer Massen in drei Gruppen unterteilen. Die erste Gruppe umfasst Peptide mit Molekularmassen zwischen 2.000 und 2.500 Da, was bedeutet, dass sie etwa 20 Aminosäurereste enthalten. Dieser Molekularmassenbereich wurde in den meisten bisher untersuchten Spinnengiften nur selten beobachtet. Die zweite Gruppe umfasst hauptsächlich Peptide mit Molekularmassen im Bereich von 4.800 bis 5.500 Da, was darauf hindeutet, dass sie aus etwa 50 Aminosäureresten zusammengesetzt sind. Die dritte Gruppe besteht aus Peptiden mit einem Massenbereich von 7.000 bis 8.000 Da, was mehr als 60 Aminosäureresten entspricht. Man schätzt, dass die Peptide der beiden letztgenannten Gruppen die Mehrheit der Giftpeptide ausmachen.

Interessanterweise haben nur wenige Peptide eine Molekularmasse zwischen 3.000 und 5.000 Da. Paradoxerweise sind Peptide in diesem Massenbereich die häufigste Komponente in vielen anderen Spinnengiften. Weitere Studien wären erforderlich, um diese Diskrepanzen aufzuklären, was zum Verständnis des evolutionären Mechanismus von Spinnengiftpeptiden beitragen könnte. Die vorliegende Studie trägt dazu bei, zu beweisen, dass die Peptide von Lycosa singoriensis sehr vielfältig sind.

Die Analyse von cDNA-Bibliotheken aus Giftdrüsen ergab mehr als 200 toxinähnliche Peptidsequenzen. Die Massenverteilung dieser aus cDNA-Sequenzen abgeleiteten Peptide stimmt mit der durch MALDI-TOF-Spektrometrie beobachteten überein. Darüber hinaus ergab die Analyse der Sequenzen, dass die Peptide der ersten Gruppe keine Cysteinreste aufweisen, die der zweiten Gruppe 4 oder 5 Disulfidbindungen enthalten, während die der letzten Gruppe mehr als 5 Disulfidbindungen aufweisen (unveröffentlichte Daten). Die meisten bisher identifizierten Spinnenpeptidtoxine weisen in der Regel 3 oder 4 Disulfidbindungen auf, und ihre 3D-Strukturen entsprechen dem klassischen Cystin-Knoten-Motiv des Inhibitors. Folglich besteht Grund zu der Annahme, dass einige Peptide aus Lycosa singoriensis-Gift ein neuartiges strukturelles Thema besitzen.

Pharmakologische Charakterisierung des rohen Giftes

Das rohe Gift konnte in einer hohen Dosis von 200 µg/mL die elektrisch stimulierte Kontraktion der Zwerchfellpräparation des Nervus phrenicus der Maus (n = 5) nicht blockieren. Es zeigte auch eine geringe Wirkung auf die Zuckungsreaktion des Vas deferens der Ratte. Die Konzentration von 200 µg/ml des rohen Giftes konnte die Zuckungsreaktion nur teilweise für 20 Minuten hemmen (n = 5) (Abbildung 4 – A). Im Gegensatz dazu konnte das Rohgift der O. huwena-Spinne in der gleichen Konzentration die Zuckungsreaktion desselben Nerven-Zwerchfell-Präparats oder des Vas deferens der Ratte rasch blockieren (Daten nicht gezeigt). Das Rohgift von Lycosa singoriensis hatte jedoch eine signifikante Wirkung auf die Kontraktion des Krötenherzens. In Anwesenheit von 100 µg/ml Rohgift wurden die Geschwindigkeit und das Ausmaß des Herzschlags stark erhöht (n = 5) (Abbildung 4 – B). Dies deutet darauf hin, dass das rohe Gift einige Verbindungen enthält, die kardiotonisch wirken.

Gegenwärtig werden kardiotonische Wirkstoffe auf der Grundlage ihrer subzellulären Wirkmechanismen in drei Klassen eingeteilt, nämlich Wirkstoffe, die durch vorgelagerte Mechanismen (Ca2+-Mobilisatoren) sowie zentrale und nachgelagerte Mechanismen (Ca2+-Sensibilisatoren) wirken. Diese Wirkstoffe induzieren eine positive inotrope Wirkung durch Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Ionenkonzentration (17). Bislang gibt es keinen Bericht über eine kardiotonische Wirkung von Wolfsspinnengiften, und es wurden noch keine kardiotonischen Verbindungen aus diesen Giften gereinigt und charakterisiert. Daher ist es wichtig, die kardiotonischen Verbindungen aus dem Gift von Lycosa singoriensis zu untersuchen.

Die hämolytische Aktivität des rohen Giftes wurde mit frischen menschlichen Erythrozyten bestimmt. Wie in Abbildung 5 (A) dargestellt, zerstörte das Rohgift menschliche Erythrozyten in einer dosisabhängigen Weise. Die effektive Konzentration der 50%igen Hemmung (EC50) liegt bei 1,25 mg/ml.

Wie von Budnik et al. (18) berichtet, enthält Lycosa singoriensis Rohgift antimikrobielle Peptide (Lycocitine 1, 2 und 3), die das Wachstum von grampositiven und gramnegativen Bakterien und Pilzen in mikromolaren Konzentrationen hemmen können. Wir haben daher die antimikrobielle Aktivität des rohen Giftes sowohl gegen prokaryotische als auch gegen eukaryotische Zellen mit Hilfe des Plattenwachstumshemmungstests getestet. Unter unseren Bioassay-Bedingungen waren die Zellstämme, die am empfindlichsten auf das rohe Gift reagierten, insbesondere Bacillus subtilis und Staphylococcus sp, bei denen das Wachstum bei 3 mg/mL stark gehemmt wurde. Das Gift wirkte auch stark gegen Corynebacterium glutamicum und Micrococcus luteus, aber nur schwach gegen einen der Pilzstämme (Candida albicans). Das rohe Gift hatte jedoch keine nachweisbare Wirkung auf E. coli und Saccaromyces cerevisae, selbst bei der hohen Konzentration von 12 mg/mL (Abbildung 5 – B).

In den letzten zehn Jahren wurden viele antimikrobielle Peptide aus Spinnengiften identifiziert. Die Lycotoxine I und II wurden aus dem Gift der Wolfsspinne Lycosa carolinensis identifiziert. Beide sind lineare antimikrobielle Peptide, die den für porenbildende Peptide typischen amphipathischen α-Helix-Charakter aufweisen. Ihr porenbildender Mechanismus wurde durch die Förderung des Ausflusses von Kalziumionen aus Synaptosomen weiter verifiziert (19). Nach den Lykotoxinen wurden auch die Cupiennine (20-22) und Oxyopinine (23, 24) aus dem Gift der Wolfsspinnen Cupiennus salei bzw. Oxyopes kitabensis als antimikrobiell wirksam eingestuft. Kürzlich wurden sieben neue kurze lineare antimikrobielle und zytolytische Peptide, die so genannten Latarcine, aus dem Gift der Lachesana tarabaevi-Spinne gereinigt. Darüber hinaus wurden fünf neue Peptide, die erhebliche strukturelle Ähnlichkeit mit den gereinigten Latarcinen aufweisen, aus der Expressed-Sequence-Tag-Datenbank für die Spinnengiftdrüse vorhergesagt (25).

Diese Peptide aus Spinnengiften gehören zu den linearen kationischen α-helicalen antimikrobiellen Peptiden. Diese Klasse antimikrobieller Peptide weist einige gemeinsame Merkmale auf, wie die Hemmung des mikrobiellen Wachstums bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen und die Bildung amphipathischer und kationischer Helixen in hydrophoben Umgebungen. In den letzten Jahrzehnten wurde eine große Anzahl antimikrobieller Peptide, einschließlich linearer kationischer α-helicaler antimikrobieller Peptide, sowohl in Tieren als auch in Pflanzen entdeckt. Diese Peptide bestehen in der Regel aus 12 bis 45 Aminosäuren und spielen eine wichtige Rolle im angeborenen Immunsystem der meisten lebenden Organismen (26-28). Die meisten von ihnen können Mikroorganismen mit den folgenden vier Eigenschaften abtöten: selektive Toxizität, schnelle Abtötung, breites antimikrobielles Spektrum und keine Resistenzentwicklung (29-31).

Zusammenfassend berichten wir über neue biochemische und pharmakologische Erkenntnisse über das Gift der Wolfsspinne Lycosa singoriensis. Die besonderen Eigenschaften der Peptide dieses Giftes machen es zu einem idealen Modell, um die evolutionären Mechanismen von Spinnengiftpeptiden zu untersuchen. Die pharmakologische Untersuchung dieses Giftes ist hilfreich für die Reinigung und Charakterisierung bioaktiver Peptide in weiteren Studien.

HINWEISE

Diese Arbeit wurde von Projekten der National Science Foundation (30430170 und 30700127) unterstützt.

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