Von Sara Ryding, B.Sc.Überprüft von Deepthi Sathyajith, M.Pharm.

Die Ganzgenom-Bisulfit-Sequenzierung oder WGBS ist eine Sequenzierungstechnik der nächsten Generation zur Analyse der DNA-Methylierung.

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DNA-Methylierung ist ein epigenetischer Mechanismus zur Regulierung der Genexpression und beinhaltet das Anhängen einer Methylgruppe an eine Cytosinbase. Abnormale Methylierungsmuster wurden mit verschiedenen Zuständen und Krankheiten, wie z. B. Krebs, in Verbindung gebracht. Seit der Entwicklung von WGBS wird es unter anderem zur Untersuchung der epigenetischen Reprogrammierung und epigenetischer Signaturen eingesetzt.

Grundlegende Methodik

WGBS kombiniert die Behandlung mit Natriumbisulfit mit der DNA-Sequenzierung im Hochdurchsatz. Natriumbisulfit schützt methylierte Cytosine, oder Methylcytosine, vor der Umwandlung, während unmethylierte Cytosine in Uracil umgewandelt werden.

Die unmethylierten Cytosine werden dann nach der PCR weiter zu Thymin umgewandelt, was bedeutet, dass die Sequenzierungsergebnisse überwiegend Adenin-, Guanin- und Thyminbasen zeigen, wobei alle Cytosinbasen auf methylierte Cytosinstellen hinweisen.

Die Methode wurde zunächst an der Pflanze Aradopsis thaliana ausprobiert, da ihr Genom relativ klein ist. Seitdem hat sie sich als geeignet erwiesen, etwa 90 % aller versuchten Cytosine zu analysieren. Die WGBS-Technik wurde auf die Genome von Menschen, Mäusen, Mais und Sojabohnen angewandt.

Stammzellenanwendungen

Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, die die Fähigkeit behalten, sich zu jeder Art von Zelle zu entwickeln, z. B. zu Neuronen oder Muskelzellen. Daher sind sie für Entwicklungsbiologen und mögliche Anwendungen in der Medizin von großem Interesse, um zu verstehen, was sie von reifen Zellen unterscheidet.

Die ersten genomweiten Karten mit Einzelbasenauflösung von methylierten Cytosinen in menschlichen embryonalen Stammzellen und fötalen Fibroblasten zeigten große Unterschiede zwischen den beiden. In embryonalen Zellen befand sich fast ein Viertel aller identifizierten Methylierungen in einem Nicht-Cytosin-Guanin (CG)-Kontext, während in fetalen Zellen 99,98 % der Methylcytosine im GC-Kontext waren.

Nicht-CG-Kontext bedeutet, dass es in CHG oder CHH war, wobei H für Adenin, Thymin oder Cytosin steht. Bisher war man davon ausgegangen, dass fast alle Methylierungen der Säugetier-DNA im CG-Kontext stattfinden, während diese Studie darauf hindeutet, dass dies ein allgemeines Merkmal menschlicher embryonaler Stammzellen sein könnte.

Die Nicht-CG-Methylierung scheint bei der Differenzierung verloren zu gehen. Die Nicht-CG-Methylierung wurde wiederhergestellt, als fötale Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen umgewandelt wurden. Dies zeigt auch, dass die CHG- und CHH-Methylierung nicht auf genetische Unterschiede zurückzuführen ist, sondern ein Merkmal embryonaler Stammzellen darstellt.

Die frühere Studie deutete darauf hin, dass Stammzellen, ob induzierte pluripotente Stammzellen oder embryonale Stammzellen, epigenetische Merkmale durch Methylierung teilen. Stammzellen sind für therapeutische Zwecke und die Erforschung von Krankheiten von enormer Bedeutung. Sie unterscheiden sich von somatischen Zellen eher durch epigenomische als durch genetische Veränderungen, was die Untersuchung ihrer Methylierungsmuster hochinteressant macht.

Eine Folgestudie konzentrierte sich auf die Unterschiede zwischen embryonalen Stammzellen und induzierten pluripotenten Stammzellen und stellte fest, dass ihre Methylierungsmuster zwar auf globaler Ebene sehr ähnlich sind, die induzierten pluripotenten Stammzellen aber im Vergleich zu embryonalen Stammzellen erhebliche Unterschiede bei der Reprogrammierung aufweisen. Während WGBS also dazu beigetragen hat, viel über Stammzellen aufzuklären, bleiben bestimmte Fragen offen.

WGBS in der Entwicklungsbiologie

DNA-Methylierung ist während der normalen Entwicklung von Säugetieren wichtig. Insbesondere ist die Nicht-CG-Methylierung in pluripotenten Stammzellen und Eizellen weit verbreitet.

Forscher haben WGBS eingesetzt, um dieses Konzept weiter zu erforschen, und haben herausgefunden, dass fast zwei Drittel aller Methylierungen in Keimblaseneizellen von Mäusen in einem Nicht-CG-Kontext auftreten. Sie fanden auch heraus, dass die Methylierung von Nicht-CG-Stellen während des Oozytenwachstums zunahm.

Die Nicht-CG-Methylierung schien insbesondere von einigen wenigen Methyltransferasen abzuhängen, nämlich dem DNA-Methyltransferasen-Komplex, d.h. dem Dnmt3s-Dnmt3L-Komplex. Im Gegensatz dazu schien Dnmt1 die CG-Methylierung aufrechtzuerhalten.

Die Vererbung der epigenetischen Programmierung ist bei Pflanzen häufiger als bei Säugetieren. Eine Studie, die sich auf die Methylierung konzentrierte, ergab, dass die pflanzliche Keimbahn durch die Verwendung von WGBS die CG- und CHG-Methylierung bewahrt. Dies steht im Gegensatz zu Säugetieren, bei denen die CHH-Methylierung in Mikrosporen und Spermazellen verloren geht. Sie wird jedoch nach der Befruchtung durch de novo-DNA-Methyltransferase wiederhergestellt, die durch kleine RNA gesteuert wird.

WGBS für die Frühdiagnose von Krankheiten

Studien haben gezeigt, dass WGBS zur Erkennung von abnormaler Methylierung verwendet werden kann, indem nach spezifischen hypermethylierten Suppressorgenen gesucht wird, wie sie bei Krebsarten wie akuter promyelozytischer Leukämie, Magenkrebs usw. vorkommen.

Anwendungen von WGBS in der Forensik

Forensische Studien wurden an getrockneten Blutspotproben unter Verwendung von WGBS nach DNA-Extraktion durchgeführt. Die Verwendung von WGBS liefert qualitativ hochwertige Proben, die die Analyse der DNA-Methylierung auf forensischen Flecken verbessern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass WGBS bei der Untersuchung der DNA-Methylierung immer beliebter wird, da diese Technik die DNA-Methylierung von Bisulfit-konvertierter genomischer DNA mit einer Auflösung von einem Nukleotid schätzen kann.

Obwohl WGBS ein sehr effizientes Instrument zum Verständnis der epigenetischen Reprogrammierung ist, ist es ebenso wichtig, eine kosteneffiziente Hochsequenzierungstechnologie zu entwickeln und zu erhalten, die in verschiedenen Bereichen der wissenschaftlichen Forschung eingesetzt werden kann.

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Geschrieben von

Sara Ryding

Sara ist eine leidenschaftliche Biowissenschaftlerin, die sich auf Zoologie und Ornithologie spezialisiert hat. Zurzeit promoviert sie an der Deakin University in Australien über die Veränderung der Schnäbel von Vögeln durch die globale Erwärmung.

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