De uppmätta effekterna av Wnt3a på proliferation av HEK293T-celler beror på den använda analysen
Abstract
Wnt-signalvägen har förknippats med många viktiga cellprocesser. Denna studie syftar till att undersöka effekterna av Wnt-signalering på proliferation av odlade HEK293T-celler. Cellerna inkuberades med Wnt3a och aktiveringen av Wnt-signalvägen följdes genom analys av nivån av β-cateninproteinet och av uttrycksnivåerna för målgenerna MYC och CCND1. Nivån av β-cateninprotein ökade upp till fyra gånger. Medan mRNA-nivåerna av c-Myc och cyklin D1 ökade något, ökade proteinnivåerna upp till en faktor 1,5. Anmärkningsvärt nog visade MTT- och BrdU-analyser olika resultat vid mätning av proliferationshastigheten hos Wnt3a-stimulerade HEK293T-celler. I BrdU-analyserna kunde en ökning av proliferationshastigheten påvisas, vilket korrelerade med den applicerade Wnt3a-koncentrationen. Däremot kunde denna korrelation inte påvisas i MTT-analyserna. MTT-resultaten, som bygger på mitokondriell aktivitet, bekräftades genom analys av succinatdehydrogenaskomplexet genom immunofluorescens och genom Western Blotting. Sammantaget visar vår studie att Wnt3a aktiverar proliferation av HEK293-celler. Dessa effekter kan upptäckas genom att mäta DNA-syntesen snarare än genom att mäta förändringar av mitokondriell aktivitet.
1. Introduktion
Wnt-signalvägen är känd för att spela en nyckelroll i regleringen av cellulär differentiering, proliferation, överlevnad och apoptos . Wnt-proteiner är en mycket konserverad familj av utsöndrade lipidmodifierade cysteinrika glykoproteiner som aktiverar signalkaskader inne i cellen genom att binda till en medlem av Frizzled (Fz)-familjen av G-proteinkopplade receptorer på den extracellulära matrisen . Det finns 19 medlemmar av vertebrate Wnts , som kan grupperas i två huvudklasser baserat på deras förmåga att stabilisera cytosoliskt β-catenin: kanonisk och icke-kanonisk väg . Nya arbeten har också visat att vissa Wnt-ligander, som Wnt5a, kan aktivera mer än bara en Wnt-signalväg , så den strikt binära klassificeringen blir mer och mer föråldrad. Funktionsstörningar i Wnt-signalvägen är relaterade till flera sjukdomar som osteoporos , Crohns sjukdom , Alzheimers sjukdom , schizofreni och framför allt cancer .
Liganden Wnt3a tillhör β-cateninberoende (kanonisk) Wnt-signalering, som binder till frizzled transmembranreceptorer. Därefter aktiverar lågdensitetslipoproteinreceptorrelaterat protein 5 (LRP5) eller LRP6-receptorkomplexet cytoplasmatiska disheveledproteiner, som utlöser hämning av glykogensyntaskinas 3β (GSK-3β). Protoonkoproteinet β-catenin ackumuleras i cytoplasman som en följd av nedmonteringen av destruktionskomplexet som bildas av adenomatosis polyposis coli (APC), AXIN och GSK-3β. Således kan β-catenin translokeras till kärnan där det aktiverar transkriptionen av målgener som medieras av T-cellsspecifik transkriptionsfaktor (TCF)/lymphoid-enhancing factor (LEF) . Dessa gener är ansvariga för att reglera viktiga fysiologiska processer i embryonal och vuxen utveckling såsom cellproliferation, differentiering, morfogenes och celladhesion .
Med indikation på proliferation finns det ett komplext samspel mellan den kanoniska Wnt-signalering och cellcykeln. Wnt/β-catenin-signalvägen är betydelsefull för att stimulera progressionen av G1-fasen genom att hämma GSK-3β, som reglerar cellcykeleffektorer och tillväxtregulatorer .
En direkt målgen för Wnt/β-catenin-signalvägen är protoonkogenen MYC, som identifierades som ett Wnt-mål i koloncancerceller . Transkriptionsregulatorn c-Myc kontrollerar många cellfunktioner, särskilt regleringen av cellcykelns utveckling . Den cyklin D1-kodande genen CCND1 är också en målgen för Wnt/β-catenin-signalvägen, som beskrevs i koloncancerceller . Cyklin D1 som en aktivator av cyklinberoende kinas (cdk) 4 eller cdk 6 driver G1/S-fasövergången .
Det finns flera sätt att mäta Wnt3a inducerad cellproliferation. En icke-radioaktiv metod är ett immunoassay baserat på inkorporering av 5-bromo-2′-deoxyuridin (BrdU) i DNA för att bestämma DNA-syntesen, som korrelerar med S-fasövergången och därmed med cellproliferation . En annan metod bygger på mätning av mitokondriell aktivitet i livskraftiga celler. I MTT-analysen produceras en olöslig blå formazanprodukt av mitokondriella dehydrogenaser genom reduktion av MTT (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) .
I den här studien har vi undersökt HEK293T-cellernas proliferation under påverkan av Wnt3a-ligander med hjälp av MTT- samt BrdU-analysen. Vidare jämför vi resultaten från dessa analyser med mitokondriell aktivitet hos Wnt3a-behandlade celler som mäts genom immunfärgning av elektrontransportkedjeproteinet SDHA (succinatdehydrogenaskomplexets underenhet A).
2. Material och metoder
2.1. Celler och cellodling
De mänskliga embryonala njurcellerna, HEK293T, odlades i Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (PAN Biotech, Aidenbach, Tyskland), 1 % icke-essentiella aminosyror och 1 % penicillin/streptomycin (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) vid 37 °C i 5 % CO2.
2.2. Proliferationsanalyser
MTT- och BrdU-analyser utfördes på 96-brunnsplattor. Tio tusen celler såddes per brunn och cellerna stimulerades med eskalerande doser av Wnt3a (R&D Systems, Minneapolis, USA), nämligen 0, 10, 50, 100, 150 och 200 ng/ml, under 24, 48 och 72 timmar. MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) löstes upp i PBS i 5 mg/ml och 20 μL MTT-lösning tillsattes till varje brunn, följt av en inkubation i tre timmar vid 37 °C i 5 % CO2. Medium med MTT slogs sedan ut och 200 μL DMSO tillsattes. För att lösa upp kristallerna skakades cellerna i 15 minuter i rumstemperatur. Plattorna avlästes med en ELISA-läsare (Tecan Group Ltd., Männedorf, Schweiz) vid 590 nm. För BrdU-analys användes ett kommersiellt kit ”Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric” (Roche, Mannheim, Tyskland) enligt tillverkarens anvisningar. Efter tillsats av BrdU-märkningslösningen inkuberades cellerna i tre timmar vid 37 °C i 5 % CO2. Efter det sista tvättsteget tillsattes 100 μL/brunn substratlösning till cellerna och reaktionen stoppades efter 15 minuters inkubation i rumstemperatur med hjälp av svavelsyra. Plattorna avlästes omedelbart med en ELISA-läsare vid 450 nm. Alla analyser gjordes i tre exemplar (). För kalibrering såddes cellerna i olika antal (0,1 × 104 till 3 × 104).
2.3. Immunocytokemi och fluorescensmikroskopi
HEK293T-celler såddes i 24-hålsplattor och behandlades med 0-200 ng/ml Wnt3a vid en konfluens på 30 % och fixerades i 4 % formaldehyd efter 24, 48 och 72 timmar. SDHA-antikropp (Abcam, Cambridge, Storbritannien) i en utspädning på 1 : 200 tillsattes och cellerna inkuberades i en timme. Cellkärnorna kontrafärgades med DAPI i 5 minuter. Cellerna analyserades via fluorescensmikroskopi (Observer. Z1 från Zeiss, Jena, Tyskland) och den tillhörande programvaran AxioVision 4.7.
2.4. Proteingelelektrofores och Western Blot
Med hjälp av Bradford-Assay bestämdes proteinkoncentrationerna i lysat av hela celler. Lika stora mängder protein laddades på SDS-polyakrylamidgeler (NuPAGE, 4-12 %, Life Technologies, Carlsbad, USA). Gelen kördes vid 150 V i 1 timme och överfördes till nitrocellulosamembran via iBlot-systemet (Life Technologies). Membranen analyserades med hjälp av primära antikroppar mot SDHA, β-catenin, c-Myc, Cyclin D1 och β-actin (Cell Signaling, Cambridge, Storbritannien), utspädda 1 : 1000 i TBS-Tween med 3 % mjölk, följt av inkubation med en lämplig pepparrotperoxidas-konjugerad sekundär antikropp (utspädning 1 : 2000). Proteinbanden visualiserades med hjälp av ECL-detektion.
2.5. RNA-isolering och RT-PCR
Total RNA isolerades med hjälp av NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Tyskland) och 1 μg RNA reverserades med Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Tyskland) i en volym på 40 μL. Sekvenserna för de primers (MWG, München, Tyskland) som användes för semikvantitativ PCR med omvänd transkriptas är för GAPDH 5′-catggtgctgctgagatttgccaac-3′ (framåt) och 5′-tcaacacctcttgaccttctcatcac-3′ (bakåt), för MYC 5′-ccgagagcaaggacgcgactctctc-3′ (framåt) och 5′-gcctttcagagaagcgggtcctcct-3′ (bakåt), och för CCND1 5′-gcctgaacacctgaggagcccca-3′ (framåt) och 5′-gtcacactacttgatcactctctgg-3′ (bakåt). PCR-amplifieringen utfördes med My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Tyskland) enligt tillverkarens protokoll. Reaktionen utfördes med preliminär denaturering i 2 minuter vid 94 °C, följt av 30 cykler med denaturering vid 94 °C i 1 minut, glödgning vid 55 °C (CCND1), 57 °C (GAPDH) eller 60 °C (MYC) i 30 sekunder och förlängning vid 72 °C i 1 minut. Det sista förlängningssteget varade 10 minuter vid 72 °C. PCR-produkterna analyserades genom elektrofores på en 1,5 % agarosgel.
2.6. Dataanalys
Microsoft Excel-programvaran användes för datahantering, inklusive beräkning av standardavvikelser. western blots och agarosgeler skannades med geldokumentationssystemet Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Tyskland). Banden kvantifierades med hjälp av programmet ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, USA).
3. Resultat
3.1. Effekter av Wnt3a på induktion av β-Catenin och typiska Wnt-målgener
För att bevisa aktivering av Wnt-banan detekterade vi mängden β-cateninproteinkoncentration i HEK293T-celler efter behandling med Wnt3a (Figur 1). Efter 24 timmars behandling ökade β-cateninproteinkoncentrationen med ökande koncentrationer av Wnt3a. Den högsta β-cateninproteinkoncentrationen identifierades vid 24 timmar med en koncentration på 200 ng/mL Wnt3a. Här visade kvantifieringen en fyrfaldig ökning jämfört med kontrollen. Vid tidpunkterna 48 och 72 timmar efter behandlingen är effekten av β-catenininduktion inte längre tydligt igenkännbar. Vidare analyserade vi regleringen av Wnt-målgenerna CCND1 och MYC efter behandling med Wnt3a både genom semikvantitativ RT-PCR och genom western blot (figur 2 och 3). En basal nivå av c-Myc och cyklin D1 upptäcktes i obehandlade celler. Resultaten av RT-PCR visade marginella förändringar i mängden MYC cDNA och en induktion av CCND1 efter 24 och 48 timmar med 10 ng/mL Wnt3a, samt efter 72 timmar med en koncentration på 100-200 ng/mL Wnt3a. En något ökad proteinnivå av c-Myc observerades med en koncentration på 50 ng/mL efter 24 timmar. Western blot-kvantifieringen av cyklin D1 visade en ökning med en faktor 1,5 med en Wnt3a-koncentration från 50 till 200 ng/mL efter 24 timmar. Proteinnivån av c-Myc steg på samma sätt med en koncentration av 50 ng/mL Wnt3a efter 24 timmar.
3.2. Cellproliferationsanalyser
För att studera effekterna av Wnt-proteiner på celltillväxt odlades HEK293T-celler i 96-hålsplattor i 24 timmar innan de behandlades med Wnt3a-proteinkoncentrationer på 0, 10, 50, 100, 150 eller 200 ng/mL respektive. Efter 24, 48 och 72 timmars inkubation utfördes MTT- och BrdU-analyser. BrdU-analyserna visar en tydlig trend; med ökande koncentrationer av Wnt3a ökade den associerade avläsningen (figur 4(a)), där Wnt3a indikerar den högsta tillväxthastigheten efter 48 timmar och en koncentration på 200 ng/mL.
(a)
(b)
(a)
(b)
I motsats till BrdU-analyserna visade MTT-analyserna ingen korrelation mellan Wnt-koncentrationer och cellantal. Cellantalet förblev alla ungefär detsamma eller minskade i jämförelse med sina relevanta kontroller (se figur 4(b)).
3.3. Mitokondriell aktivitet
För att ytterligare styrka Wnt3as roll i förhållande till den mitokondriella aktiviteten i HEK293T-celler bestämdes mängder av SDHA-protein genom western blot samt genom immunocytokemisk analys. Succinatdehydrogenas (SDH) med sin underenhet SDHA är en nyckelkomponent i citronsyracykeln, som är involverad i komplex II i den mitokondriella elektrontransportkedjan och ansvarar för att överföra elektroner från succinat till ubiquinon. Cellerna behandlades på samma sätt som vid proliferationsanalyser och inkuberades med SDHA-antikroppen enligt beskrivningen ovan. Resultaten (figur 5) visade en ökande fluorescenssignal och även en mer intensiv signal vid western blot i förhållande till kontrollen efter 24 timmars Wnt3a-behandling. Efter 48 timmar visade proteinnivån som registrerades genom immunofluorescensmikroskopi eller genom western blot-analys ingen signifikant förändring. Efter 72 timmars Wnt3a-behandling observerades till och med en minskande signal i båda experimenten. Den högsta signalen uppmättes efter 24 timmar med 50 ng/ml Wnt3a.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4. Diskussion
Wnt-proteiner är involverade i olika cellulära funktioner, inklusive reglering av genuttryck för cellcykel och proliferation . Wnt3a är känd som en främjare av proliferation och migration av humana linsepitelceller , även för proliferation av fibroblaster eller som en regulator av proliferation av pankreas NIT-1 betaceller . MYC och CCND1 är målgener för Wnt-signalvägen i däggdjursceller. Yoon et al. avslöjade till exempel att Wnt-signalering aktiverar mitokondriell biogenes genom att utföra en storskalig RNAi-screening; de identifierade gener som påverkar mitokondriell funktion, bland annat MYC .
I det här arbetet bestämde vi effekterna av Wnt3a på proliferation av HEK293T-celler. För detta tillämpade vi två viktiga tester som ofta används för att analysera proliferationshastigheten hos odlade celler, nämligen MTT- och BrdU-analysen. Därmed kunde de specifika effekterna av Wnt-ligander på DNA-syntesen och mitokondriell aktivitet upptäckas och jämföras direkt.
För att etablera vårt system och bevisa effekten av Wnt3a på Wnt-banan i HEK293T-celler visade vi på induktion av β-catenin efter 24 timmars behandling med Wnt3a och vi analyserade uttrycksnivåerna av MYC och CCND1. Nivån av båda målgenerna ökade också efter 24 timmars Wnt3a-exponering. C-Myc har en nyckelroll i G1-fasens progression; den uppreglerar cyklin D1 och undertrycker p21 och p27 . Cyklin D1 främjar i sin tur fosforylering och hämning av retinoblastomakomplexet (Rb), som i sin tur uppreglerar nivån av cyklin E . Anrikningen av cyklin E leder till övergången av kontrollpunkten G1/S-fas .
Under G1-fasen måste mitokondrierna leverera en stor mängd energi . Denna oxidativa fas följs av en reducerande period under S-/G2-/M-fasen i cellcykeln, där replikation av DNA och proliferation av mitokondrier äger rum .
Proliferationshastigheterna hos Wnt3a behandlade HEK293T var olika, när de mättes med de två tester som användes i denna studie. Vi förklarar skillnaden med de olika detektionsmekanismerna i dessa metoder. MTT-analysen mäter mitokondriernas aktivitet; å andra sidan upptäcker BrdU-analysen den relativa mängden nysyntetiserat DNA. Wagner et al. hänvisar till ett mycket signifikant samband mellan BrdU och MTT i sina resultat med proliferation av lymfocyter från hundar, även om BrdU-analysen har visat sig vara känsligare än MTT-analysen . Den till synes negativa effekten av Wnt3a på cellantalet skulle kunna förklaras av en minskning av mitokondriell aktivitet. BrdU-analysen visade dock en främjande effekt på DNA-syntesen i dessa celler. Försöken med mitokondriell aktivitet visade att SDHA-nivån ökade först efter 24 timmars Wnt3a-behandling. Aktiveringen med rekombinant Wnt3a har troligen ingen effekt på den mitokondriella aktiviteten efter 48 timmar eller senare. Enligt denna tidsbegränsade effekt är den minskande signalen under MTT-analysen efter 48 och 72 timmar. Detta bekräftas också av den avtagande ackumuleringen av β-catenin av Wnt3a efter 24 timmar. Andra publikationer stöder detta antagande att Wnt3a-behandlade celler visar en ökad β-cateninnivå endast under en 24-timmarsperiod . Vi förklarar våra resultat, som står i motsats till den publicerade proliferationseffekten av Wnt3a, med att de flesta studierna använde Wnt3a överuttryckta celler, Wnt3a-konditionerat medium eller serumstinna celler med rekombinant Wnt-protein för aktivering av Wnt/β-actin-signalvägen.
Slutsatsen är att resultaten från BrdU- och MTT-analyser knappast är jämförbara när man mäter effekterna av Wnt3a på proliferationshastigheten hos HEK293T-celler. Skillnaderna kan förklaras av deras olika utgångspunkter, nämligen den mitokondriella aktiviteten och DNA-syntesen. För att ge definitiva bevis för den cellulära spridningshastigheten kan det vara vilseledande att tolka resultaten från en enda metod. För utvärdering av cellproliferation skulle direkträkning av celler med optiska metoder bäst spegla den verkliga situationen. Det skulle vara intressant att jämföra motsvarande resultat med resultaten av biokemiska analyser som BrdU och MTT.
Interessentkonflikter
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter i samband med publiceringen av denna artikel.
Acknowledgment
Detta arbete har finansiellt stötts av det federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) .