Allmän beskrivning

Färdiga lentivirala dCas9-VP64-partiklar möjliggör omedelbar transduktion av ett stort antal cellinjer. Lentivirala dCas9-VP64-partiklar integrerar effektivt och stabilt dCas9-VP64 och en resistenskassett för blasticidin som är kopplad till en 2A-peptid och drivs av EF1 alfa-promotorn (EF1a-dCas9-VP64-2A-Blasticidin) för ett starkt uttryck i både delande och icke-delande cellinjer. De är idealiska för att undvika den tråkiga lentivirusproduktionsprocessen och är en del av ett tredelat CRISPR-system med individuella dCas9-VP64. MS2-p65-HSF1 och gRNA-uttrycksvektorer.
För att beställa gRNA i vilket format som helst klicka här

Användning

Funktionell genomik/målvalidering
– Opartisk framåtriktad genetisk screening
– Stark transkriptionsaktivering i flera cellinjer
– Skapande av cellinjer som stabilt uttrycker dCas9-VP64.

Funktioner och fördelar

– Mycket specifik och mycket aktiv
– Sekvensverifierade lentivirala partiklar med hög renhet och hög titer
– Aktiverar gener genom transkriptionsaktivering snarare än cDNA-baserad överuttryckning
Lär dig mer om SAM CRISPR-aktivatorer hos SigmaAldrich.com/CRISPRa

Princip

CRISPR/Cas-system används av bakterier och arkéer som ett försvar mot invaderande virus och plasmider. Nyligen har CRISPR/Cas-systemet av typ II från bakterien Streptococcus pyogenes konstruerats för att fungera i eukaryota system med hjälp av två molekylära komponenter: ett enda Cas9-protein och ett icke-kodande guide-RNA (gRNA). Cas9-endonukleaset kan göras inaktivt (dCas9) med mutationer i de två proteindomänerna RuvC och HnH (D10A respektive H840A), som är ansvariga för nukleasaktiviteten. Det nukleasbristande proteinet kan sedan fusioneras med transkriptionsaktivatorn VP64 och användas tillsammans med ett guide-RNA modifierat med MS2 RNA-aptamerer som fungerar för att rekrytera de ytterligare transkriptionella koaktivatorerna p65 och HSF1. Det sammansatta SAM-komplexet används sedan som ett system för leverans av last till målgenpromotorer, vilket möjliggör platsspecifik transkriptionsaktivering av den aktuella genen.

Enhetsdefinition

VP/mL är koncentrationsmåttenheten för viral titer uppskattad genom p24-analys.