3.06.4.1.1 Kvasinky Saccharomyces

Předchozí studie ukázaly, že kvasinky Saccharomyces mohou fermentovat xylulózu na etanol, i když ne efektivně. Teoreticky tedy kvasinkám Saccharomyces chybí pouze enzym(y) pro přeměnu xylosy na xylulosu. Jak bylo popsáno výše, bakterie přeměňují xylosu na xylulosu pomocí jediného enzymu, který nevyžaduje kofaktory (obrázek 3). Naproti tomu kvasinkový systém přeměny xylosy na xylulosu vyžadoval dva enzymy, které nejsou metabolicky ideální, jak bylo popsáno výše. Zpočátku se téměř 10 různých laboratoří po celém světě pokoušelo naklonovat gen bakteriální xylose isomerázy do kvasinek. Ho a spol. z Purdue University byli první skupinou, které se podařilo klonovat gen pro xylosovou izomerasu z Escherichia coli. Protein syntetizovaný v kvasinkách klonovaným bakteriálním genem však neměl žádnou xylose isomerázovou aktivitu.

Druhým přístupem bylo naklonování genů XR a XD z P. stipitis do kvasinek Saccharomyces. Kinetika těchto enzymů a termodynamická rovnováha reakce však upřednostňují produkci xylitolu místo ethanolu. Na počátku 90. let 20. století tři skupiny (Kotter, Ciriacy a kolegové z univerzity v Düsseldorfu, Tantirungkij a kolegové z univerzity v Osace a Hahn-Hägerdal a kolegové z univerzity v Lundu) oznámily úspěšné klonování genů XR a XD do kvasinky Saccharomyces, aby byla schopna fermentovat xylosu. Rekombinantní kvasinky vyvinuté těmito skupinami však fermentovaly xylosu extrémně pomalu a produkovaly málo ethanolu; hlavním metabolickým produktem byl xylitol.

Hoova skupina předpokládala, že nadměrná exprese nativní xylulokinasy (XK) spolu s XR a XD z P. stipitis zlepší tok xylosy metabolismem na ethanol snížením intracelulární koncentrace xylulosy. Jelikož xylulokináza katalyzuje nevratnou reakci směřující k produkci ethanolu (obr. 3), vysoká aktivita xylulokinázy povede k nízkým koncentracím xylulózy. To je žádoucí, protože rovnováha reakce katalyzované XD upřednostňuje xylitol a nízké koncentrace xylulózy v ustáleném stavu jsou potřebné k usměrnění metabolického toku směrem k produkci ethanolu . Klonování těchto tří genů navíc umožnilo řídit jejich expresi v buňce. V přirozeném systému kontroly exprese v buňce je jejich exprese indukována přítomností xylosy a inhibována glukosou. Výsledná rekombinantní kvasinka by mohla být schopna kofermentovat glukózu a xylózu současně na ethanol bez dlouhé prodlevy mezi fermentací glukózy a xylózy, což by bylo pro průmyslovou výrobu ethanolu velmi žádoucí.

V roce 1989 Hoova skupina z Purdue poprvé oznámila klonování genu xylulokinázy z kvasinky Saccharomyces. Následně Hoova skupina nahradila sekvence DNA před strukturními geny XR, XD a XK sekvencemi před glykolytickými geny obsahujícími účinné konstitutivní promotory. Výsledné geny XR, XD a XK byly klonovány na plazmid s vysokým počtem kopií 2μ a výsledný plazmid pLNH32 byl použit k transformaci kmene divokého typu průmyslových kvasinek Saccharomyces, o němž je známo, že je lepší pro výrobu ethanolu za použití škrobu (glukózy) jako vstupní suroviny. V roce 1993 stejná skupina oznámila úspěšný vývoj rekombinantní kvasinky Saccharomyces 1400 (pLNH32), která dokázala fermentovat vysoké koncentrace xylosy téměř úplně na ethanol s velmi malým množstvím xylitolu jako vedlejšího produktu. Výsledná kvasinka navíc dokázala kofermentovat glukózu a xylózu na ethanol bez větší prodlevy mezi fermentací těchto dvou cukrů, ačkoli rychlost fermentace xylózy je pomalejší než u glukózy (obr. 4). Následně byly uvedeny podrobnosti o konstrukci a vývoji 1400 (pLNH 32) . Od té doby Hoova skupina pokračovala ve vylepšování kvasinky pomocí různých nových přístupů, jak je popsáno níže.

Obrázek 4. (Vlevo) Kmen kvasinek Saccharomyces 1400 transformovaný mateřským plazmidem pLNH32 neobsahujícím geny XR, XD nebo XK nebo obsahujícím pouze geny XR a XD, ale nikoli XK, použitý ke kvašení směsi glukózy a xylózy. (Vpravo) 1400 kvasinek transformovaných plazmidem pLNH32 obsahujícím klonované geny XR, XD a XK. Kvasinky byly použity ke kvašení glukózy a xylózy za identických podmínek jako výsledky popsané na levém obrázku. Geny klonované v těchto plazmidech byly upraveny a konstruovány identicky, jak je popsáno v odkazu 9.

Plazmid pLNH32, obsahující klonovaný gen XR-XD-XK, je plazmid se širokým hostitelským záběrem, který byl navržen tak, aby mohl transformovat jakékoli kmeny kvasinek Saccharomyces, včetně průmyslových kvasinek Saccharomyces divokého typu. Takový plazmid lze použít ke screeningu lepších hostitelů pro výrobu celulózového ethanolu. Hoova skupina také vyvinula novou unikátní techniku integrace genů, která usnadňuje účinnou integraci více genů do chromozomu kvasinek ve více kopiích . Tato technika je snadno proveditelná a téměř zaručuje, že geny klonované na integrační plazmid a transformované do hostitelských kvasinkových buněk mohou být integrovány do hostitelského genomu v tolika kopiích, kolik je požadováno, aby poskytovaly nejlepší aktivity (obrázek 5). Tato integrační technika byla použita k vývoji stabilního xylosu fermentujícího kmene 1400 (LNH-ST) tak, že se geny XR-XD-XK nejprve integrovaly společně jako kazeta do chromosomu kvasinky v dostatečném počtu kopií, dokud výsledná kvasinka nefermentovala xylosu s nejvyšší účinností (obrázek 6). Současný nejlepší kmen vyvinutý Hoovou skupinou, 424A (LNH-ST), byl vybrán z 10 různých kmenů kvasinek Saccharomyces tak, že každý kmen byl nejprve transformován 2 μ plazmidem pLNH32, aby bylo zajištěno, že tyto kmeny jsou schopny účinně fermentovat xylosu i kofermentovat glukosu/xylosu v přítomnosti pLNH32, a následně byly geny integrovány do chromosomů vybraných kmenů kvasinek, aby se touto novou integrační technikou vyvinula „stabilní kvasinka“. Kofermentace glukózy/xylosy pomocí 424A (LNH-ST) je znázorněna na obrázku 7.

Obrázek 5. Demonstrace postupné integrace více kopií genů XR-XD-XK do chromozomů kvasinky Saccharomyces kmene 259 metodou popsanou v práci Ho et al. . Kvasinky v různých fázích integrace byly použity ke zkvašení glukózy a xylózy za identických podmínek, aby byl demonstrován průběh integrace těchto genů: a) v počáteční fázi integrace, b) 25 % dokončení, c) 50-75 % dokončení, d) po dokončení integrace. Dokončení integrace se projevuje tím, že buňky z procesu integrace produkují stejné výsledky fermentace po dostatečně dlouhou dobu.

Obrázek 6. Ukončení integrace. Kofermentace glukosy a xylosy s 1400 (LNH-ST) obsahujícími více kopií genů XR-XD-XK integrovaných do chromosomů kvasinek metodou Ho et al. .

Obrázek 7. Kofermentace glukózy a xylózy s rekombinantním kmenem Saccharomyces 424A (LNH-ST) obsahujícím více kopií genů XR-XD-XK integrovaných do kvasinkových chromozomů kmene Saccharomyces 424A metodou Ho et al. . Jedná se o nejlepší Ho-Purdue kvasinky vyvinuté na Purdue University před rokem 2007, které jsou v současné době poskytovány průmyslu pro výrobu celulózového etanolu.

Pokud se rekombinantní mikroorganismus používá pro rozsáhlou průmyslovou výrobu, například pro výrobu etanolu, je nutné klonované geny integrovat do chromozomů hostitele ze dvou klíčových důvodů. Jedním z nich je, že pokud jsou klonované geny integrovány do hostitelských chromozomů spolehlivou metodou, mohou být klonované geny udržovány na hostitelském chromozomu, aniž by bylo nutné používat speciální chemikálie, média, antibiotika a přísady. Požadavek na použití chemikálií nebo antibiotik k udržení znaků nejen zvyšuje náklady na chemikálie, ale také zvyšuje náklady a obtíže při schvalovacím procesu a čištění případných odpadních vod. Dokonce i v přítomnosti selektivního činidla nemusí být plazmidy s vysokým počtem kopií, jako je pLNH32, používané pro klonování genů do hostitelských buněk, schopny udržet rozsáhlý průmyslový provoz . Hoova skupina prokázala, že stabilní kvasinka vyvinutá pomocí nového integračního systému, 1400 (LNH-ST), byla schopna udržet kontinuální fermentaci hydrolyzátů kukuřičných stébel na ethanol v pilotním závodě, zatímco stejný kmen kvasinky obsahující plasmid 1400 (pLNH32) toho nebyl schopen.

Kmen 424A (LNH-ST) a další stabilní kmeny, 1400 (LNH-ST) a 259 (LNH-ST), vyvinuté novou integrační technikou, byly ověřeny jinými subjekty a ukázaly se jako udržitelné a účinné pro výrobu celulózového etanolu s hydrolyzáty z různých lignocelulózových surovin. Kmen 424A (LNH-ST) se od roku 2004 používá také průmyslově pro výrobu celulózového etanolu ze zemědělských zbytků v demonstračním zařízení.

Rekombinantní kvasinky vyvinuté společností Hahn-Hägerdal byly rozsáhle vylepšeny klonováním různých dalších genů, včetně klonování genu xylulokinázy poté, co Hoova skupina na Purdue University prokázala, že zvýšená exprese tohoto nativního genu zlepšuje výtěžnost ethanolu z xylózy .

Kvasinky vyvinuté Hoovou skupinou na Purdue jsou k dispozici pro průmyslovou výrobu celulózového ethanolu. Pravděpodobně bude mít dobrou šanci na úspěch, protože se jedná o kvasinky pro průmyslovou výrobu etanolu a byly podrobeny rozsáhlým testům. V poslední době skupina z Purdue pokračovala ve vylepšování kmene tím, že přiměla kmen kofermentovat arabinózu s dalšími čtyřmi cukry (glukózou, xylózou, manózou a galaktózou) a zvýšila jeho odolnost vůči ethanolu a kyselině octové.

Přestože první pokus o vývoj kvasinky Saccharomyces fermentující xylosu na bázi isomerasy nebyl úspěšný a byla vyvinuta účinná inženýrská kvasinka fermentující xylosu na bázi XR/XD, zájem o vývoj kvasinky fermentující xylosu na bázi isomerasy v průběhu let pokračoval, částečně proto, že tato cesta nemá redoxní nerovnováhu. V roce 2009 Brat a spol. zkonstruovali S. cerevisiae fermentující xylosu pomocí xylose isomerasy z Closteidium phytofermentans. Rovněž v roce 2009 společnost Cargill informovala o vývoji kmene kvasinek non-Saccharomyces, který exprimuje xylosovou isomerasu a je schopen účinně fermentovat směs glukosy a xylosy při nízkém pH a v přítomnosti 1 % kyseliny octové.

Ačkoli je arabinosa v biomase trav přítomna pouze v malém množství jako součást hemicelulosy GAX, několik speciálních zdrojů biomasy, jako je kukuřičné vlákno, obsahuje poměrně velké množství arabinosy. Přesto je ideální, aby mikrobi produkující celulózový ethanol byli schopni fermentovat všech pět různých molekul cukru přítomných v celulózové biomase, protože recyklace procesních toků v rámci průmyslového procesu může zvýšit koncentraci minoritních složek .

Metabolismus arabinózy u mikroorganismů je stejně komplikovaný jako metabolismus xylózy. Mechanismus metabolismu arabinózy u kvasinek se opět liší od bakterií . Podobně jako u metabolismu xylosy mechanismus metabolismu kvasinek neupřednostňuje anaerobní metabolismus. Nedávno Hahn-Hägerdal a spolupracovníci dále upravili své kvasinky Saccharomyces fermentující xylózu tak, aby kofermentovaly arabinózu s xylózou a dalšími cukry pomocí houbové l-arabinózové dráhy . Výsledná inženýrská kvasinka však stále nebyla schopna fermentovat arabinosu na významné množství ethanolu, ale byla schopna přeměnit malé množství arabinosy na arabitol

.