Vytvoření modelu xenotransplantátu lidského karcinomu žaludku u imunokompetentních myší pomocí mikronosiče-6
Abstrakt
Karcinom žaludku patří mezi nejčastější zhoubné nádory trávicího traktu. Vytvoření robustního a spolehlivého zvířecího modelu je základem pro studium patogeneze rakoviny. Tato studie vytvořila myší model karcinomu žaludku inokulací imunokompetentních myší buňkami MKN45 pomocí mikronosiče. Šedesát myších samců C57BL/6 bylo náhodně rozděleno do tří skupin: 2D skupina, skupina s prázdným nosičem a 3D skupina podle systému kokultivace MKN45 a mikronosiče. Myší modely byly vytvořeny podkožní injekcí. V každé skupině byla sledována doba do vzniku nádoru, rychlost tvorby nádoru a patologické znaky. Ve skupině 3D byla doba vzniku nádoru krátká, zatímco míra tvorby nádoru byla vysoká (75 %). Ve 2D skupině ani ve skupině s prázdným nosičem nebyla zjištěna žádná tvorba nádoru. Jak H&E, tak imunohistochemické barvení nádorového xenograftu vykazovalo charakteristické známky lidských žaludečních novotvarů. Tato studie úspěšně vytvořila model lidského karcinomu žaludku u imunokompetentních myší, který poskytuje nový a cenný zvířecí model pro výzkum rakoviny a vývoj protinádorových léků.
1. Úvod
S přibližně jedním milionem nově diagnostikovaných případů ročně představuje rakovina žaludku vážnou hrozbu pro zdraví a životy lidí na celém světě . Patogeneze a mechanismy metastazování rakoviny žaludku však dosud nebyly zcela objasněny. Modely rakoviny žaludku in vivo jsou základním nástrojem pro zkoumání biologických vlastností této rakoviny a potenciálních nových možností léčby . Modely xenograftů rakoviny žaludku odvozené od člověka byly vytvořeny na imunodeficitních myších, jako jsou nahé myši a myši s těžkou kombinovanou imunodeficiencí. Chov imunodeficitních myší však není snadný a je nákladný. Důležité je, že imunodeficitní myši neodrážejí důležitou roli imunitního systému ve vývoji a progresi nádorů. Proto má vytvoření nového modelu xenotransplantátu lidského karcinomu žaludku u myší s normálním imunitním systémem velký význam . V této studii byla provedena kokultivace MKN45, lidských buněk karcinomu žaludku a mikronosiče a následně byla suspenze inokulována imunokompetentním myším, čímž byl úspěšně vytvořen nový xenotransplantát karcinomu žaludku lidského původu.
2. Materiál a metody
2.1. Materiál a metody
2.2. Model karcinomu žaludku lidského původu. Materiály
Kultivační médium Roswell Park Memorial Institute- (RPMI-) 1640, trypsin, fetální hovězí sérum a penicilin byly zakoupeny od společnosti Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Králičí monoklonální protilátky proti lidskému karbohydrátovému antigenu 199 (CA199), cytokeratinu 7 (CK-7) a homeoboxu 2 kaudálního typu (CDX-2) byly zakoupeny od společnosti Abcam (Cambridge, Spojené království). Mikronosič-6 byl zakoupen od společnosti Elyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, USA).
2.2. Mikronosič-6 byl zakoupen od společnosti Elyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, USA). Experimentální zvířata
Šedesát 6-8 týdnů starých myších samců C57BL/6 o hmotnosti 22-25 g bylo zakoupeno od společnosti Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. (dále jen „společnost“). (číslo licence: SCXK 20140007, provincie Šan-tung, Čína) a byly umístěny ve specifickém centru pro zvířata bez patogenů v Affiliated Hospital of Jining Medical College (provincie Šan-tung, Čína). Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny se souhlasem Institucionální komise pro péči o zvířata a jejich používání při Přidružené nemocnici Lékařské univerzity Jining a byly prováděny v souladu se schválenými pokyny.
2.3. Pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu se schválenými pokyny. Buněčné linie
Buněčná linie lidského karcinomu žaludku MKN45 byla zakoupena v Buněčné bance Čínské akademie věd (Šanghaj, Čína) a kultivována v médiu RPMI-1640 obsahujícím 10 % fetálního bovinního séra a 100 U/ml penicilinu při 37 °C a 5 % CO2. Kultivační médium se měnilo každých 24 hodin a buňky se sklízely trávením pomocí 0,25% trypsinu.
2.4. Vytvoření trojrozměrného (3D) modelu kultury nádorových buněk
Mikronosič-6 byl namočen do 75% ethanolu na 24 h, třikrát promyt 1x fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem a inkubován v médiu RPMI-1640 po dobu 24 h. Následně byl mikronosič-6 modifikován prostřednictvím 3hodinové inkubace s faktorem odvozeným od stromálních buněk-1 alfa (SDF-1α) a vaskulárním endoteliálním růstovým faktorem (VEGF), oba v koncentraci 100 ng/ml. Buňky v logaritmické růstové fázi byly spočítány po obarvení trypanovou modří a upraveny na koncentraci, kdy byla životaschopnost >95 %. Suspenze buněk MKN45 byla smíchána s modifikovaným mikronosičem-6 a inkubována při 37 °C s 5 % CO2 po dobu dalších 24 hodin, aby se buňky mikronosičem nasytily, jak bylo pozorováno mikroskopem (obrázky 1c) a 1d)).
(a)
(b)
(c)
.
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
2.5. Ukazuje se, že buňky MKN45 přilnuly k mikronosičům. Rozdělení zvířat do skupin
Šedesát myší C57BL/6 bylo náhodně rozděleno do tří skupin (20 myší na skupinu): dvourozměrná (2D) skupina (zvířata inokulovaná s obsahem ), skupina s prázdným nosičem (zvířata inokulovaná s obsahem 30 μg mikronosiče-6) a 3D skupina (zvířata inokulovaná s obsahem a 30 μg mikronosiče-6).
2.6. Rozdělení zvířat do skupin
Myši C57BL/6 byly rozděleny do tří skupin (20 myší na skupinu). Vytvoření zvířecího modelu
Model 3D kultury nádorových buněk byl vytvořen první den experimentu a inkubován po dobu 24 h. Druhý den byly kultivované komplexy buněk a mikronosiče třikrát promyty a jemně promíchány, aby se upravila koncentrace na buňky a 300 μg mikronosiče-6 na 1 ml suspenze, a uloženy na led pro pozdější použití. Buňky MKN45 v logaritmické růstové fázi byly odebrány, trypsinizovány, třikrát promyty a resuspendovány v přípravku o koncentraci , který byl uložen na led pro pozdější použití. Modifikovaný mikronosič-6 byl třikrát promyt , resuspendován v koncentraci 300 μg/ml a uložen na led pro pozdější použití. Každá myš ve všech třech experimentálních skupinách byla naočkována 100 μl příslušného roztoku pod pravý axilární hřeben
2.7. Detekce indikátorů a patologické vyšetření
Po inokulaci byly myši umístěny odděleně podle skupin a denně byla sledována chuť k jídlu, aktivita a hmotnost. U každé myši byla zaznamenána doba vzniku lokálního nádoru a objem nádoru. Jakmile byly nádory viditelné, byl denně měřen dlouhý průměr (a) a krátký průměr (b) každého nádoru a objem nádoru byl vypočítán podle vzorce pro objem nádoru : . Myši s nádorem byly usmrceny ve třech dávkách: 10, 20 a 30 dní po inokulaci. Nádorové tkáně byly kompletně odstraněny z každé myši a byla zaznamenána kvalita, struktura a stupeň infiltrace a nekrózy nádoru. Nádorové tkáně byly následně fixovány ve 4% neutrálním pufrovaném formaldehydu a obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E). Pro imunohistochemii byla použita dvoustupňová technika barvení EnVision. Výsledky barvení byly stanoveny na základě pozitivního zbarvení granulární cytoplazmy nádoru. Negativní (-ve) barvení bylo definováno jako <5 % pozitivně obarvených buněk a pozitivní (+ve) barvení bylo definováno jako ≥5 % pozitivně obarvených buněk.
2,8. Statistická analýza
Pro statistickou analýzu byl použit software SPSS 13.0 (IBM SPSS, Chicago, IL, USA). Naměřené údaje jsou prezentovány jako střední hodnoty ± standardní chyba průměru (SEM). Rozdíly mezi průměrnými hodnotami jednotlivých skupin byly porovnány pomocí jednocestné analýzy rozptylu (ANOVA), případně Kruskal-Wallisova testu. je považován za statisticky významný rozdíl.
3. Výsledky
3.1. Rozdíly mezi průměrnými hodnotami jednotlivých skupin byly porovnány pomocí jednocestné analýzy rozptylu (ANOVA) nebo Kruskal-Wallisova testu. Vytvoření systému 3D kultivace nádorů MKN45 in vitro pomocí mikronosiče-6
Mikronosič-6 je nový mikronosič složený z pozitivně elektrifikovatelných organických polymerů s vícevrstvou porézní strukturou. Velikost pórů, hustotu kladného povrchového náboje a velikost mikronosiče-6 lze upravit chemickou syntézou. Mikronosič typu C s malým objemem, velkou velikostí pórů a mnohonásobným skládáním prostoru se používá především pro 3D buněčné kultury a experimenty s citlivostí na léčiva (obr. 2(a) a 2(b)). Mikronosič typu M-6, velký objem, malá velikost pórů a nízká doba vnitřního skládání, se používá hlavně pro výzkum tkáňového inženýrství (obrázky 2(c) a 2(d)). V naší studii byl použit mikronosič typu C-6. Mikronosič-6 je čistá organická sloučenina, která není náchylná ke kontaminaci, neobsahuje žádné nečistoty, má nízkou imunogenitu a metabolismus a je vysoce biokompatibilní, čímž poskytuje stabilní mikroprostředí pro růst buněk (obrázky 2(a)-2(d)). Kromě toho je mikronosič-6 přímo zabudován do kůže myší, což vyvolává prorůstání krevních cév (obrázky 2(e) a 2(f)), které mohou zajistit dostatečné prokrvení pro růst nádorových buněk. Buňky MKN45 rychle adherovaly ve 2D prostředí a morfologie buněk pozorovaná mikroskopem po 24 hodinách kultivace vykazovala nepravidelný polygonální tvar (obrázek 1(a)). Mikroskopický nosič-6 vykazoval nepravidelný nebo dlouhý vřetenovitý tvar a volnou strukturu (Obrázek 1(b)). Po 24hodinové kokultuře MKN45 a modifikované mikronosiče-6 buňky MKN45 dobře přilnuly k mikronosiči a dosáhly konfluence. Kromě toho byly kolem buněk MKN45 přilnutých k mikronosiči-6 pozorovány nepravidelné shluky buněk (obrázek 1c). Komplexy buněk MKN45 a mikronosiče byly obarveny roztokem 4,6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI), což odhalilo velký počet buněk MKN45 přilnutých k lešení mikronosiče-6 (obrázek 1(d)). Vícevrstvou porézní strukturu mikronosičů lze pozorovat pod rastrovacím elektronovým mikroskopem (obrázek 1(e)). Buňky MKN45 přilnuly k mikronosičům a buňky přilnuté k povrchu vytvořily buněčné shluky (obrázek 1(f)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2. Ukázalo se, že se jedná o cévy. Přežívání myší a tvorba nádorů
V průběhu pokusu nebyly mezi skupinami zaznamenány žádné významné změny chuti k jídlu, srsti ani tělesné hmotnosti (tabulka 1). Myši ve skupině 3D vykazovaly týden po inokulaci mírný pokles aktivity. Žádné zvíře v žádné skupině neuhynulo a ve skupinách s prázdným nosičem a 2D nebyla během 30denního pokusu zjištěna tvorba nádorů. U 15 z 20 myší ve 3D skupině byly 7-10 dní po inokulaci palpací identifikovány podkožní masy, což naznačuje 75% míru tvorby nádorů (tabulka 1). Nádorové xenografty rychle rostly a byly pozorovány jako podkožní masy přibližně 10 dní po inokulaci (obrázek 3 a), doplňkový obrázek 3). Nádorové xenografty narostly do velikosti 0,5-1,0 cm3 2 až 3 týdny po inokulaci. Tkáně nádorových xenograftů byly snadno oddělitelné od přilehlých tkání a prezentovaly se jako relativně pravidelné tvary, většinou kulaté nebo oválné, šedobílé nebo šedočervené barvy a s bohatým periferním prokrvením (obrázky 3(b) a 3(c) a doplňkový obrázek 3). Ve skupině s prázdným nosičem došlo k histologickým změnám v místě vpichu, ale ve skupině 2D nedošlo k žádným změnám (obrázky 3(d) a 3(e)). Ve skupině s prázdným nosičem byly pozorovány malé podkožní útvary žluté barvy (obrázek 3(d)).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Údaje jsou uvedeny jako .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
.
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3. Podkožní hmoty v podkoží a v podkoží. H&E barvení
Histomorfologie, pozorovaná světelnou mikroskopií, ukázala velké množství neuspořádaných a atypických buněk v nádorových xenografech od myší ve 3D skupině (obrázky 4(a)-4(c)). Deset dní po inokulaci bylo pozorováno velké množství heterotypických buněk, zbytkových mikronosičů a hojných krevních cév (obrázek 4(a)). Po 20 dnech po inokulaci byl pozorován malý počet zbytkových mikronosičů (obrázek 4b) a velký počet nekrotických lézí (obrázek 4d). Třicet dní po inokulaci však byly mikronosiče podstatně eliminovány (obrázek 4c). Ve skupině s prázdným nosičem byl pozorován velký počet mikronosičů a malý počet zánětlivých buněk, ale nebyly nalezeny žádné nádorové buňky (obrázek 4 e)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3,4. Imunohistochemie
Imunohistochemie byla provedena u zvířat utracených 20 dní po xenotransplantaci nádoru. Tkáně nádorového xenotransplantátu vykazovaly pozitivní barvení CA199, CK-7 a CDX-2 (obr. 4(f)-4(h)), což dále potvrdilo, že atypické buňky byly nádorové buňky lidského původu.
4. Diskuse
Zvířecí modely jsou hojně využívány ke studiu patogeneze a mechanismů metastazování rakoviny žaludku a hrají mimořádně důležitou roli při hodnocení účinnosti a toxicity terapeutických léčiv . V současné době zahrnují zvířecí modely rakoviny žaludku především tyto modely: indukční model, transplantační model a model genetického inženýrství . Mezi těmito třemi typy modelů je transplantační model snadno ovladatelný, a proto široce používaný. Typ pokusných zvířat, nádorové xenografty a místo a způsob transplantace jsou považovány za faktory, které ovlivňují úspěšnost xenograftických modelů . Pro xenotransplantační modely se běžně používají myši s defektem imunitní funkce, jako jsou nahé myši a myši s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID) . Vzhledem k poměrně vysoké ceně, krátké délce života a nedostatečné imunitní odpovědi na nádory u myší s imunodeficitem jsme však pro model xenotransplantátu zvolili imunokompetentní myši C57BL/6, abychom se vyhnuli nedostatkům myší s imunodeficitem. Obecně se má za to, že výskyt rakoviny žaludku nesouvisí s hladinou estrogenu a že výskyt rakoviny žaludku u samců je vyšší než u samic. Proto jsme jako model použili myší samce. V této studii byly navíc k vytvoření modelu in vitro použity lidské buňky karcinomu žaludku MKN45, a to především kvůli silným invazivním a metastatickým vlastnostem této buněčné linie . Kromě toho byla jako místo a způsob transplantace nádorových buněk vybrána podkožní oblast podpaží a ektopická transplantace, a to v důsledku bohatého prokrvení a volné struktury tkáně této oblasti, která usnadňuje růst nádoru u myší .
Jako most mezi 2D systémem buněčných kultur a zvířecím modelem 3D systém buněčných kultur lépe simuluje mikroprostředí růstu nádorových buněk a stal se atraktivním tématem v současném výzkumu . 3D kultivace nádorových buněk vytvoří nádorové organoidy a myší nádorové xenograftové modely založené na nádorových organoidech se začaly používat pro screening protinádorových léčiv . V této studii byly pro kokultivační experimenty použity nové mikronosiče-6 a buňky MKN45 k úspěšnému vytvoření 3D růstového modelu. Mikronosič-6 jsme přímo vložili do podkožní tkáně myší, abychom umožnili vstup krevních cév do mikronosičů, což představuje specifickou výhodu, které se u jiných mikronosičů nedosahuje. Studie uvádějí mírnou imunosupresi imunokompetentních myší k dosažení rezistence vůči lidským nádorovým buňkám, čímž byl úspěšně vytvořen myší model s nádorem ; dosud však neexistují žádné zprávy o úspěšné ektopické transplantaci lidského nádoru u normálních myší za neimunosupresivních podmínek. Kromě toho, když jsme upravili koncentraci buněk MKN45 na a okamžitě jsme každé myši subkutánně aplikovali 100 μl buněčné suspenze MKN45, nebylo dosaženo stabilní tvorby nádoru v důsledku silné imunitní clearance ektopicky transplantovaných lidských nádorových buněk. Mikronosič-6 použitý v této studii vykazoval nízkou imunogenicitu a volnou strukturu s četnými póry ve středu, což usnadňovalo růst nádorových buněk. Mikronosič-6 také fungoval jako bariéra, která bránila imunitním buňkám v přímém zabíjení nádorových buněk. Upravený mikronosič-6 umožňoval snadný růst krevních cév uvnitř nádoru, což poskytovalo vhodné podmínky pro rychlý růst nádorových buněk.
Buněčná imunita je hlavní armádou proti růstu nádorů; mezi zapojené buňky patří především T-buňky, přirozené zabíječské buňky, makrofágy a dendritické buňky . Vzhledem k nepravidelné „labyrintové“ struktuře mikronosiče-6 může působit jako krátkodobá bariéra a do určité míry blokovat přímé zabíjení nádorových buněk imunitními buňkami. Kromě toho byl mikronosič-6 tři hodiny před pokusem dále modifikován pomocí SDF-1α a VEGF, aby se urychlila tvorba krevních cév a zajistil přívod krve pro rychlý růst nádoru, což překonalo protinádorový imunitní účinek myší. Současně jsme zjistili, že makrofágy v periferní krvi a slezinné tkáni myší byly v časné fázi tvorby transplantovaného nádoru významně sníženy ve srovnání s normální kontrolní skupinou (doplňkový obrázek 1). Počet makrofágů v kostní dřeni se postupně snižoval mezi skupinou s prázdným nosičem, skupinou 2D a skupinou 3D, ale nebyl statisticky významný (doplňkový obrázek 2A, 2B). Ve srovnání se skupinou s prázdným nosičem se počet T lymfocytů sleziny ve skupině 2D snížil, ale nebyla zjištěna statistická významnost (doplňkový obrázek 2C). Počet T lymfocytů sleziny ve skupině 3D byl významně nižší než ve skupině 2D (doplňkový obrázek 2C). To naznačuje, že růst nádoru inhiboval imunitní systém, což umožnilo rychlý růst nádoru.
V této studii byl vytvořen 3D model růstu buněk MKN45, který úspěšně vytvořil model xenotransplantátu lidského karcinomu žaludku u imunokompetentních myší ve skupině 3D, zatímco u myší ve skupinách 2D a s prázdným nosičem se nevytvořily žádné nádory. Tento xenograftový model se vyznačoval rychlým růstem nádorů, které bylo možné nahmatat rukou 7-10 dní po inokulaci a optimálního růstu dosáhly 10-15 dní po inokulaci; objem nádoru byl 0,5-1,0 cm3 přibližně 20 dní po inokulaci. Při barvení H&E bylo zjištěno velké množství buněk s jadernými atypiemi, které infiltrovaly svalovou a tukovou tkáň. Zbytkový mikrokarier-6 byl obklopen zánětlivými buňkami a tvořil granulomy s velkou oblastí nekrózy uprostřed, což bylo pravděpodobně způsobeno nedostatečným krevním zásobením v důsledku rychlého růstu nádoru. Tyto jevy odpovídají vývoji nádoru u lidí. Hojné kapiláry se navíc nacházely především na periferii nádorů. V současné době neexistuje žádný specifický nádorový marker pro karcinom žaludku, nicméně CA199, CK-7 a CDX-2 se běžně používají jako markery gastrointestinálních nádorů . Proto jsme tyto tři markery zvolili pro značení a identifikaci buněk rakoviny žaludku odvozených od člověka. Imunohistochemické barvení CA199, CK-7 a CDX-2 bylo pozitivní, což dále potvrdilo, že heteromorfní buňky jsou buňky lidského karcinomu žaludku.
5 . Závěry
Úspěšně jsme vytvořili model xenotransplantátu lidského karcinomu žaludku u imunokompetentních myší. Tento model může odrážet interakci mezi imunitním systémem organismu a nádory a má široké možnosti využití v budoucím výzkumu nádorové imunity i ve výzkumu a vývoji nových léčiv .
Dostupnost údajů
Údaje použité na podporu výsledků této studie jsou na vyžádání k dispozici u odpovídajícího autora.
Střety zájmů
Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.
Příspěvky autorů
Yanzhen Bi, Quanyi Wang a Yonghong Yang se na této práci podíleli rovným dílem.
Poděkování
Tato studie byla podpořena granty National Natural Science Foundation of China (81170395 a 81570556), Natural Science Foundation of Jilin Province (20180101137JC a 20180101130JC) a Research Fund for Lin He’s Academician Workstation of New Medicine and Clinical Translation in Jining Medical University (JYHL2019FMS21).
Doplňkové materiály
Změny zánětlivých buněk a další nádorová data. Doplňkový obrázek 1: změny zánětlivých buněk u myší s nádorem v časné fázi tvorby transplantovaného nádoru. Doplňkový obrázek 2: změny zánětlivých buněk u různých skupin během časné fáze tvorby transplantovaného nádoru. Doplňkový obrázek 3: myši nesoucí nádor a tkáně transplantovaného nádoru. (Doplňkové materiály)