Koně. Bylo získáno 378 vzorků séra od zdravých domestikovaných koní z několika rančů nacházejících se ve čtyřech okresech. Vzorky séra byly odebrány také od dostihových koní (obrázek 1).

Člověk. Vzorky séra získané od 42 pacientů (17 mužů a 25 žen) z oddělení infekčních chorob a neuroinfekcí Lékařské univerzity v Bialystoku. Pacienti vykazovali neurologické příznaky charakteristické pro meningitidu, lymfocytární meningitidu a klíšťovou encefalitidu. Byly hospitalizovány v období od května do září 2010. Všichni pacienti byli vyšetřeni na přítomnost protilátek proti viru klíšťové encefalitidy metodou Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens . Vzorky byly uchovávány při -20 °C.

Všechny vyšetřované vzorky byly dvakrát kontrolovány a testovány za podmínek biologické bezpečnosti úrovně 3+.

ELISA-1. Sérologická studie byla provedena pomocí komerčně dostupné konkurence ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, Francie) pro detekci protilátek proti obalovým proteinům viru západonilské encefalitidy pr-E a pr-M obsahujícím epitop společný viru japonské encefalitidy podle protokolu výrobce. Všechny vzorky byly vyšetřeny dvakrát. Mikroplatničky byly odečteny při 450 nm. ELISA se validovala, když se vypočítaly zbytkové vazebné poměry (S/N%). Vzorky sér s poměrem S/N rovným nebo nižším než 40 % byly považovány za pozitivní; vzorky s poměrem vyšším než 50 % byly považovány za negativní. Hodnoty S/N mezi 40 % a 50 % byly pochybné.

ELISA-2 byla provedena pomocí ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, Francie). Jamky byly potaženy polyklonální protilátkou IgM. Při pozitivních výsledcích se přítomnost protilátek projevila jako modrý roztok a po přidání stop roztoku zežloutla. V případě nepřítomnosti protilátek se neobjevilo žádné zbarvení. Destičky se odečítaly při vlnové délce 450 nm.

ELISA-3 byla provedena pomocí enzymatického testu Ingezim WNV Compac (Ingenasa, Španělsko) na základě blokující ELISA, ve které byla použita monoklonální protilátka (MAb) specifická pro protein E WNV. Pokud byly ve vzorcích séra přítomny protilátky, vázaly se na antigen. Pokud byla přidána MAb specifická pro protein E, vázala se na antigen, který nebyl blokován protilátkami ze vzorku séra. V případě, že protilátky blokovaly antigen, konjugát se na něj nevázal. Test se odečítal kolorimetrickou reakcí po přidání substrátu. Vzorky byly považovány za pozitivní, pokud byly hodnoty OD stejné nebo nižší než u pozitivních kontrolních vzorků sér. Vzorky byly považovány za negativní, pokud byla hodnota OD stejná nebo vyšší než negativní mezní hodnota. Vzorky s hodnotou OD v rozmezí obou hodnot byly považovány za pochybné.

Mikroneutralizační test virů. Mikroneutralizační test viru s pozitivními vzorky ELISA od volně žijících ptáků byl proveden v Evropské referenční laboratoři ANSES ve Francii. V testu byly použity buňky Vero a virus západonilské horečky, kmen IS-98-ST1. Test byl založen na standardním postupu OIE .

3. Výsledky

Okresy Polska a oblasti, kde byly vzorky odebrány, jsou uvedeny na obrázku 1.

Většina vzorků byla odebrána ptákům během asanace a veterinárního ošetření. Někteří ptáci byli v rehabilitačním centru po některých nehodách. U ptáků se neprojevovaly žádné příznaky neurologických onemocnění ani žádné známky neurologických infekcí. Každý pták byl dodán organizací, která vzorky odeslala, s informacemi o lokalitě, pohlaví, věku, a pokud to bylo možné, i o cestovní anamnéze.

Vyšetřením vzorků séra byly zjištěny specifické protilátky proti WNV u 63 vzorků od volně žijících ptáků: 62 od čápa bílého a jeden od sýce rousného. Jeden pozitivní vzorek séra byl získán od klisny.

Co se týče vzorků lidského séra, 14 ze 42 bylo pozitivních a jeden byl pochybný. Všichni pacienti měli v anamnéze kousnutí komárem a klíštětem. Klíšťová encefalitida byla diagnostikována u 16 pacientů .

Pro potvrzení výsledků byl proveden test ELISA-2 ke zjištění specifických protilátek IgM proti WNV v séru jako první linie imunitní odpovědi. Výsledky byly negativní, a proto nepotvrdily přítomnost protilátek IgM ani žádný důkaz nedávné infekce zvířat.

Pro ověření výsledků získaných metodou ELISA-1 byla provedena metoda ELISA-3, která v těchto případech potvrdila přítomnost specifických protilátek WNV. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Pro potvrzení pozitivních výsledků byly pozitivní vzorky sér ptáků znovu testovány mikronutralizačním testem na virus. Všech 63 vzorků séra volně žijících ptáků bylo potvrzeno a identifikováno jako pozitivní na protilátky WNV s titrem 10 u 60 vzorků a titrem 30 u tří vzorků. Pokud jde o vyšetření ostatních členů JECV, byly vzorky rovněž negativní na virus Usutu. Nebyly pozorovány žádné zkřížené reakce.

Srovnání výsledků získaných různými diagnostickými metodami (ELISA a mikronutralizační testy viru) je uvedeno v tabulce 1.

4. Diskuse

V posledních letech bylo zjištěno, že WNV se šíří v zemích s mírným klimatem. komáři z čeledi Culicidae jsou nejčastějším vektorem šíření viru a v současné době se v polském klimatickém pásmu vyskytuje šest druhů komárů . V devadesátých letech minulého století Juřicová a kol. pomocí hemaglutinační inhibiční zkoušky potvrdili protilátky proti WNV u 12,1 % vrabců domácích (Passer domesticus) a u 2,8 % vrabců polních (Passer montanus) v oblasti Campinaského lesa v Polsku. V dalších letech byly zjištěny protilátky proti WNV u tří čápů, jedné vrány (Corvus corone cornix) a jedné labutě němé (Cygnus olor) na druhé straně Polska .

Provedli jsme tři různé testy ELISA, abychom prezentovali a následně potvrdili získané výsledky. První ELISA byl ID Screen West Nile Competition, test specifický pro WNV, ale poskytuje také sérologické zkřížené reakce mezi členy JECV. Při pozitivních výsledcích byl proveden test ELISA-2 West Nile IgM Capture, který je specifický pouze pro WNV a umožňuje vyloučit zkřížené reakce, ale detekuje pouze IgM. To znamená, že můžeme identifikovat pouze recentní infekci a nelze detekovat IgG protilátky. ELISA-3 byl použit k potvrzení výsledků získaných pomocí ELISA-1 a výsledky byly potvrzeny ve 100 % případů.

V naší studii byly pozitivní výsledky u vzorků séra volně žijících ptáků získaných pomocí ELISA potvrzeny mikronutralizačním testem viru. Kromě toho ELISA prokázala protilátky proti WNV u 14 ze 42 vzorků séra od pacientů s příznaky meningitidy, lymfocytární meningitidy a klíšťové encefalitidy, ale získané výsledky se nám nepodařilo ověřit plakově redukčním neutralizačním testem (PRNT). Infekce WNV u lidí a identifikace WNV v mozkomíšním moku byly obvykle potvrzeny pomocí RT-PCR, Nested PCR , nebo ve formalínem fixovaných, do parafínu vložených lidských tkáních pomocí RT-PCR. Podle studie Czupryna et al. byly všechny vzorky mozkomíšního moku od 24 pacientů hospitalizovaných na oddělení infekčních nemocí a neuroinfekcí Lékařské univerzity v Bialystoku negativní na přítomnost WNV RNA.

Jako vhodné vzorky pro stanovení specifických protilátek proti WNV byly použity vzorky séra lidí, ptáků a koní. Pokud jsme potvrdili specifické protilátky ve vzorcích séra, bylo zvíře nebo člověk považován za kontakt s virem (v Polsku nebo mimo zemi). Předpokládá se, že pozitivní volně žijící ptáci mohli přijít do kontaktu s virem mimo zemi. Pokud jde o pozitivní vzorky od lidí, 11 pacientů nikdy neopustilo zemi; to znamená, že museli mít kontakt s virem již v Polsku. Stejně je tomu i v případě koní, kteří podle cestovní anamnézy nikdy neopustili zemi.

Na základě epidemiologické situace v Evropě, úlohy volně žijících ptáků v přenosu WNV a výsledků předchozích sérologických vyšetření lidí a ptáků lze usuzovat na možný výskyt WNV v Polsku. V Polsku byly zjištěny protilátky proti WNV u ženy s horečkou a u zdravých lesních dělníků z regionů Swietokrzyskie (28,85 %) a Podlaskie (34,14 %) . Z našich sérologických výsledků lze usuzovat, že virus se v našem klimatickém pásmu a v našem ekosystému již vyskytuje. Je třeba vzít v úvahu možnost jeho zkřížené reakce s viry klíšťové encefalitidy a endemických onemocnění.

Etické schválení

Studie byla schválena II. místní etickou komisí v Lublinu (číslo 92/2010 ze dne 16. listopadu 2010) a získala povolení generálního ředitele ochrany životního prostředí (číslo DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł).

Konflikt zájmů

Autoři nehlásí žádný konflikt zájmů.

Poděkování

Autoři děkují za finanční podporu poskytnutou rámcovým pracovním projektem P/020, Volně žijící vodní ptáci jako rezervoár a vektor při expanzi virových onemocnění, a rámcovým pracovním projektem W/211, Vývoj diagnostických metod a hodnocení rizika výskytu infekce virem západonilské horečky u ptáků v Polsku (2014-2018).

.