Abstrakt

Wnt5a se podílí na aktivaci několika nekanonických signálních drah Wnt, které mohou inhibovat nebo aktivovat kanonickou signální dráhu Wnt/β-katenin v závislosti na kontextu receptoru. Signalizace Wnt5a je kritická pro regulaci normálních vývojových procesů, včetně sebeobnovy kmenových buněk, proliferace, diferenciace, migrace, adheze a polarity. Kromě toho se aberantní aktivace nebo inhibice signalizace Wnt5a ukazuje jako důležitá událost v progresi rakoviny, která má jak onkogenní, tak nádorově supresivní účinky. Nedávné studie ukazují zapojení signalizace Wnt5a do regulace sebeobnovy normálních a nádorových kmenových buněk, proliferace nádorových buněk, migrace a invaze. V tomto článku podáváme přehled nejnovějších poznatků týkajících se molekulárních mechanismů a rolí signalizace Wnt5a v kmenových buňkách v embryogenezi a v normálním či neoplastickém prsu nebo vaječníku, přičemž zdůrazňujeme, že Wnt5a může mít na cílové buňky různé účinky v závislosti na povrchových receptorech exprimovaných cílovou buňkou.

1. Úvod

Kmenové buňky, včetně embryonálních kmenových buněk a kmenových buněk identifikovaných v dospělých tkáních, mají schopnost sebeobnovy a vytváření diferencovanějšího potomstva. Embryonální kmenová buňka je odvozena z vnitřní buněčné hmoty blastocysty, je pluripotentní, a může tak vytvářet všechny tkáně těla . Kmenové buňky v dospělých tkáních sídlí ve specializovaných nikách, kde integrují různé environmentální a vnitřní signální vstupy, které určují osud buněk a udržují homeostázu tkání.

Wnt faktory jsou skupinou těchto signálních molekul, které působí na kmenové buňky v rámci niky kmenových buněk a pomáhají udržovat jejich schopnost sebeobnovy. Je známo, že faktory Wnt se vážou na různé receptory a přenášejí kanonickou signální dráhu nebo nekanonické signální dráhy, které regulují různé biologické aktivity . Kanonická signální dráha Wnt je zahájena, když se faktory Wnt vážou na receptory rodiny Frizzled (Fzd) a koreceptory 5/6 související s receptorem pro lipoproteiny o nízké hustotě (LRP5/6) a vytvářejí komplexy. To vede k náboru Axinu a dishevelled (Dvl) na plazmatickou membránu a narušení degradačního komplexu β-kateninu, což vede k akumulaci β-kateninu v cytoplazmě, který se poté přemístí do jádra, kde se váže na T-buněčný faktor (TCF)/lymfoidní enhancer faktor (LEF) rodiny a aktivuje transkripci kanonických cílových genů Wnt . Naproti tomu několik faktorů Wnt aktivuje dráhy nezávislé na β-kateninu (nekanonické signální dráhy Wnt), známé jako dráha Wnt-Ca2+ nebo dráha planární buněčné polarity (PCP), které působí na usměrňování buněčné migrace během embryogeneze .

U myší a lidí bylo identifikováno devatenáct vylučovaných glykoproteinů rodiny Wnt bohatých na cystein. Během rané embryogeneze savců nebo udržování homeostázy dospělých tkání jsou tyto faktory Wnt a jejich receptory dynamicky exprimovány, aby aktivovaly příslušnou signalizaci a zajistily správnou rovnováhu mezi proliferací a diferenciací. Narušení signalizace Wnt aberantní expresí faktorů Wnt, jejich receptorů nebo navazujících signálních molekul může vést ke vzniku několika lidských nádorů . Protože se zdá, že schopnost iniciace nádoru je omezena na malou populaci nádorových buněk, které jsou vybaveny schopností sebeobnovy a diferenciace, jsou často označovány jako nádorové kmenové buňky (CSC nebo buňky iniciace nádoru) . Důležitější je, že biologie embryonálních kmenových buněk, normálních kmenových buněk a CSC je vysoce provázaná. To je zřejmé ze skutečnosti, že molekulární signály (např. signalizace Wnt), které definují a udržují embryonální kmenové buňky nebo dospělé normální kmenové buňky, jsou často aberantně aktivovány v nádorových buňkách.

Hlavním předmětem tohoto přehledu je role signalizace Wnt5a prostřednictvím různých povrchových receptorů v regulaci kmenových buněk v embryogenezi a v normálním nebo neoplastickém prsu nebo vaječníku, protože již existuje několik vynikajících přehledů, které se zabývají aspekty signalizace Wnt u rakoviny tlustého střeva . Shrnuli jsme nejnovější pokroky v oblasti signálních drah, které jsou aktivovány Wnt5a a které představují hlavolam pro racionální návrh léků zaměřených na depleci CSC (nebo buněk iniciujících nádor) v nádorech a zároveň šetřící funkci normálních tkání.

2. Signální dráha Wnt5a

Wnt5a je nekanonický ligand Wnt, který je evolučně konzervovaný a hraje důležitou roli ve vývoji. Homozygotní myši s knockoutem Wnt5a mají perinatální letalitu způsobenou vývojovými defekty . Předchozí studie ukázaly, že Wnt5a může interagovat s Fzd2 a receptorovým tyrozinkinázovým sirotčím receptorem 2 (ROR2) a aktivovat Rac1 cestou nezávislou na β-kateninu. Nedávno jsme prokázali, že Wnt5a indukuje heterooligermizaci receptorového tyrozinkinázového sirotčího receptoru 1/2 (ROR1/ROR2), který rekrutuje a aktivuje guaninové výměnné faktory (GEF), které následně aktivují RhoA a Rac1, respektive zvyšují chemotaxi a proliferaci leukemických buněk . Na druhé straně, jako další účinek Wnt5a, soutěžil s Wnt3a o vazbu na Fzd2, čímž inhiboval fosforylaci LRP6 závislou na Wnt3a a akumulaci β-kateninu in vitro a v intaktních buňkách, inhiboval schopnost Wnt3a indukovat akumulaci β-kateninu, a tím inhiboval signalizaci Wnt závislou na β-kateninu .

Však také Wnt5a mohl aktivovat dráhu závislou na β-kateninu a indukovat tvorbu sekundární osy u embryí Xenopus, která koexprimovala receptor Fzd5 . Následně jiná studie zjistila, že Wnt5a může inhibovat kanonickou Wnt/β-kateninovou signalizaci v buňkách, které exprimují ROR2, ale také může indukovat kanonickou Wnt/β-kateninovou signalizaci v buňkách, které exprimují Fzd4 a LRP5 . Jeden ligand Wnt5a tak může mít na buňky rozdílné účinky v závislosti na dostupnosti receptoru. Účinek Wnt5a je tedy dán buněčným kontextem. To by mohlo vysvětlit pozorování, že Wnt5a může mít u různých druhů rakoviny buď onkogenní, nebo tumor supresivní účinky .

3. Signalizace Wnt5a v embryonálních kmenových buňkách

Dráha Wnt (spouštěná buď Wnt3a, Wnt5a, nebo Wnt6) by se také mohla podílet na krátkodobém udržení pluripotence myších i lidských ES buněk . První důkaz o tom poskytla studie farmakologického inhibitoru glykogen syntázy kinázy-3 (GSK3), který mohl modulovat aktivitu GSK3, což vedlo k aktivaci kanonické signalizace β-kateninu a zvýšení stability c-Myc . Následně bylo zjištěno, že Wnt5a a Wnt6 jsou produkovány buňkami embryonálních fibroblastů, které by mohly inhibovat diferenciaci myších ES buněk v závislosti na séru. Přímá aktivace β-kateninu pomocí konstitutivně aktivního β-kateninu (S33Y) bez narušení předřazených složek Wnt/β-kateninu plně rekapitulovala účinek Wnts na ES buňky. Důležité je, že Wnt5a je také silným inhibitorem fosforylace β-kateninu, čímž stabilizuje β-katenin . Tyto údaje naznačují, že signál Wnt5a stabilizuje β-katenin, aby dále aktivoval kanonickou signalizaci Wnt/β-katenin v myších ES buňkách. A konečně, dráha Wnt/β-katenin může regulovat mRNA pro STAT3, známý regulátor sebeobnovy ES buněk , což naznačuje molekulární mechanismus, kterým dráha Wnt/β-katenin působí proti diferenciaci ES buněk prostřednictvím konvergence na dráhu LIF/JAK-STAT na úrovni STAT3 . Jaké povrchové receptory se podílejí na aktivaci signalizace Wnt5a/β-kateninu v ES buňkách a zda může být Wnt5a v ES buňkách aktivována také nekanonická signalizace Wnt, však zůstává nejasné.

4. V případě, že by Wnt5a aktivoval nekanonickou signalizaci Wnt, bylo by možné, že by Wnt5a aktivoval i nekanonickou signalizaci Wnt. Signalizace Wnt5a na kmenové buňky v normálních tkáních mléčné žlázy a vaječníků

Řada důkazů podporuje význam Wnt při udržování kmenových buněk v mléčné žláze . Wnt5a však neindukuje transaktivační aktivitu β-kateninu/TCF v tkáni mléčné žlázy. Buňky mléčné žlázy jsou u myší s knockoutem Wnt5a hyperproliferativní, zatímco v přítomnosti ektopického Wnt5a je inhibováno rozšiřování duktů . Tyto fenotypy jsou inverzní k aktivaci kanonické Wnt/β-kateninové signalizace. Wnt5a tedy může omezovat a řídit růst mléčné žlázy potlačením signalizace Wnt/β-katenin. Je tedy záhadou, že tato inhibice růstu mléčné žlázy nebyla pozorována u transgenních kmenů MMTV-Wnt5a .

V zárodečníku Drosophily dochází ke změně signalizace Wingless (Wg; homolog Wnt u much) v zárodečných kmenových buňkách vaječníků (GSC) odstraněním jeho regulátorů, jako jsou dishevelled, armadillo, Axin a shaggy; to způsobuje ztrátu GSC, ovlivňuje proliferaci folikulárních buněk a indukuje diferenciaci . Použití podmíněného cílení genu pro Wnt5a v ovariálních granulózových buňkách (GC) vede k ženské subfertilitě spojené se zvýšenou folikulární atrézií a sníženou mírou ovulace. Další studie zjistila, že Wnt5a reguluje své cílové geny nikoliv signalizací prostřednictvím dráhy Wnt/Ca2+ nebo dráhy planární buněčné polarity, ale spíše inhibicí kanonické dráhy, což způsobuje snížení hladiny β-kateninu i proteinu CREB (cAMP responsive element binding) prostřednictvím dráhy závislé na glykogen syntáze kinázy-3β v ovariálních granulózových buňkách (GC). Tyto údaje naznačují, že Wnt5a je nutný pro normální vývoj ovariálních folikulů a může antagonizovat gonadotropinovou reaktivitu v granulózových buňkách potlačením kanonické Wnt/β-kateninové signalizace .

Souhrnně lze říci, že Wnt5a s největší pravděpodobností potlačuje β-kateninovou signalizaci v normálních kmenových buňkách mléčné žlázy a ovariálních tkání, ačkoli Wnt5a je schopen aktivovat β-kateninovou signalizaci v embryonálních kmenových buňkách. Je třeba dále zkoumat, zda je tento rozdíl způsoben receptory, které jsou odlišně exprimovány v embryonálních kmenových buňkách oproti kmenovým buňkám normální mléčné žlázy nebo vaječníků.

5. Signalizace Wnt5a v kmenových buňkách karcinomu prsu

Wnt faktory mohou ovlivňovat různé epiteliální buňky mléčné žlázy a vyvolávat expanzi kmenových buněk během progrese nádoru . Aberantní exprese β-kateninu byla navíc spojena s bazálními, triple-negativními karcinomy prsu a špatným klinickým výsledkem . Výskyt aberantní signalizace Wnt u specifických podtypů karcinomu prsu je s menší pravděpodobností dán aktivací způsobenou somatickými mutacemi . Mutace nebyly identifikovány v CTNNB1, který kóduje β-katenin, a mutace v APC byly identifikovány u méně než 20 % vzorků pacientek s karcinomem prsu . Je třeba dále zkoumat, které ligandy a receptory Wnt způsobují tuto aberantní signalizaci Wnt/β-katenin.

Nedávno bylo ve studii na primárních myších buňkách MMTV-Wnt1 zjištěno, že rekombinantní Wnt3a i rekombinantní Wnt5a mohou zvýšit tvorbu mammosfér in vitro. Tvorba mammosfér vyvolaná Wnt5a nebyla způsobena zvýšením kanonické Wnt/β-kateninové signalizace, ale byla naopak zprostředkována nekanonickou Wnt signalizací vyžadující receptorovou tyrozinkinázu ROR2 a aktivitu Jun N-terminální kinázy, JNK, v buňkách myšího karcinomu prsu . To je v souladu s pozorováním, že pacientky s karcinomy prsu, které exprimují ROR2, měly výrazně kratší celkové přežití než pacientky s nádory bez exprese ROR2 . Umlčení ROR2 v lidských buněčných liniích karcinomu prsu však snížilo jak β-katenin-dependentní, tak β-katenin-nezávislé cíle , což naznačuje, že ROR2 může být zapojen jak do β-katenin-dependentních, tak β-katenin-nezávislých signálních drah Wnt. Zdá se, že ROR1 je převážně exprimován méně diferencovanými nádory, které mají vysoký potenciál k recidivám a metastázám a které také exprimují markery spojené s epiteliálně-mezenchymálním přechodem (EMT) . Naopak umlčení ROR1 u buněčných linií lidského karcinomu prsu by mohlo oslabit expresi genů spojených s EMT a zhoršit jejich schopnost migrace/invaze in vitro a jejich metastatický potenciál in vivo . Zcela nedávno Chien et al. uvedli, že exprese ROR1 může být nezávislým nepříznivým prognostickým faktorem u pacientek s triple-negativním karcinomem prsu . Zda může mít ROR1 podobný účinek jako ROR2 na kmenové buňky karcinomu prsu a jaké signální dráhy jsou aktivovány ROR1 v kmenových buňkách karcinomu prsu, zatím není známo.

Studie na myším modelu karcinomu prsu indukovaného ErbB2 zjistila rozporuplné důkazy o účinku Wnt5a na lidské kmenové buňky karcinomu prsu. Během ErbB2 indukované mamární tumorigeneze bazální nádorové iniciační buňky (TIC), které vykazovaly zvýšenou tumorigenní kapacitu ve srovnání s odpovídajícími luminálními progenitory, přednostně ztrácely expresi Wnt5a, jak bylo stanoveno analýzou transkripčních profilů. Heterozygozita Wnt5a navíc podporovala nádorovou multiplicitu a plicní metastazování. Jako substrát TGFβ vyvolal Wnt5a produkovaný luminálními buňkami zpětnovazební smyčku, která aktivovala SMAD2 způsobem závislým na RYK a TGFβR1, aby omezila expanzi bazálních TIC parakrinním způsobem, což je potenciální vysvětlení supresivního účinku Wnt5a na mamární tumorigenezi . V tomto myším modelu zůstává nejisté, zda byla aktivována kanonická Wnt/β-kateninová signalizace, nebo zda Wnt5a také inhiboval kanonickou β-kateninovou signalizaci, aby potlačil expanzi bazálních TIC.

Laboratoř Weinberg studovala imortalizované lidské mléčné epiteliální buňky (mMEC) a zjistila, že kanonická i nekanonická Wnt dráha spolupracuje se signalizací TGFβ nejen při udržování, ale zajímavě i při indukci vlastností kmenových buněk . Navíc bylo zjištěno, že pouze nekanonické ligandy Wnt Wnt5a a Wnt16 jsou v kmenových buňkách ve srovnání s nekmenovými buňkami regulovány . Je tedy možné, že Wnt5a nebo Wnt16 mohou v lidských kmenových buňkách karcinomu prsu aktivovat buď kanonickou, nebo nekanonickou signální dráhu Wnt způsobem závislým na kontextu receptoru.

6. Signalizace Wnt5a v kmenových buňkách karcinomu vaječníků

Podobně jako u karcinomu prsu je i u karcinomu vaječníků vliv Wnt5a kontroverzní. Raná studie primárních nádorů vaječníků (), která ukázala, že nízká hladina Wnt5a u karcinomu vaječníků ve srovnání s normálním vaječníkem je prediktorem špatného výsledku . Ektopická exprese Wnt5a inhibuje proliferaci buněčné linie lidského karcinomu vaječníků OVCAR5 jak in vitro, tak na ortotopických myších modelech karcinomu vaječníků in vivo. Mechanisticky ektopická exprese Wnt5a u OVCAR5 antagonizuje kanonickou signalizaci Wnt/β-katenin a indukuje buněčnou senescenci aktivací dráhy senescence histonového represoru A (HIRA)/promyelocytární leukemie (PML) .

Studie zahrnující velký počet pacientek naopak zjistily, že upregulace Wnt5a je spojena s relativně špatnou prognózou . V porovnání s četností exprese Wnt1 u karcinomu vaječníků byl Wnt5a častěji nalezen u pacientek s maligním epiteliálním karcinomem vaječníků (80 % z celkového počtu 38). Za zmínku stojí, že pacientky s karcinomy vaječníků, které exprimují vysoké hladiny Wnt1 i Wnt5a, měly významně nižší pravděpodobnost dlouhodobého přežití než pacientky s karcinomy vaječníků, které neexprimovaly Wnt1 ani Wnt5a. Kromě toho se Wnt5a vyskytuje v tekutině ascitu získané od žen s karcinomem vaječníků , což naznačuje, že přispívá k mikroprostředí ovariálního nádoru. To je v souladu s pozorováním, že vysoké hladiny Wnt5a jsou spojeny se zvýšeným rizikem metastazování .

Aktivující mutace v kanonické dráze Wnt je u karcinomu vaječníků vzácná, s výjimkou endometrioidních karcinomů vaječníků . Podíl kanonické signalizace Wnt na progresi karcinomu vaječníků zůstává neznámý. Naopak studie nekanonické signalizace Wnt/β-kateninu ukazují, že Wnt5a může regulovat EMT, migraci nebo metastazování karcinomu vaječníků prostřednictvím nekanonických signálních drah . V souladu s touto představou nedávné studie zjistily, že exprese ROR1, receptoru Wnt5a, byla vysoce exprimována u high-grade a méně diferencovaných karcinomů vaječníků a byla spojena s relativně krátkým přežitím bez onemocnění a celkovým přežitím ve srovnání s karcinomy vaječníků, které ROR1 neexprimovaly . Karcinomy vaječníků, které exprimují vysoké hladiny ROR1, měly genové expresní podpisy spojené s ovariálními CSC . Kromě toho exprese ROR1 v nádorových buňkách zřejmě koreluje s expresí ALDH1 a schopností tvořit nádorové sféroidy in vitro (oba markery CSC). Ošetření primárních ovariálních nádorových buněk odvozených od pacientek (PDX), které exprimují vysoké hladiny ROR1, anti-ROR1 mAb (UC-961 nebo cirmtuzumab), inhibovalo tvorbu sféroidů a migraci in vitro a přihojení a opětovné přihojení u imunodeficitních myší, což naznačuje, že ROR1 může ovlivňovat sebeobnovu kmenových buněk ovariálního karcinomu. Je třeba provést další studie, abychom zjistili, zda je Wnt5a zodpovědný za vliv, který má ROR1 zřejmě na biologii kmenových buněk rakoviny vaječníků.

7. Závěrečné poznámky

Wnt5a může hrát důležitou roli ve vývoji embryonálních kmenových buněk a orgánů. Úloha Wnt5a v nádorových kmenových buňkách je však různorodá a složitá. Může potlačovat nebo podporovat progresi nádoru. K objasnění molekulárních mechanismů, které řídí změněné chování buněk, je zapotřebí dalšího výzkumu exprese specifických receptorů a koreceptorů v jednotlivých tkáních. Zejména je třeba podrobněji porozumět složitým vzájemným vazbám mezi Wnt5a a specifickými receptory, které jsou exprimovány v embryonálních kmenových buňkách a které mohou být znovu exprimovány nebo reaktivovány v nádorových kmenových buňkách, ale ne v normálních somatických tkáních (např, ROR1 a ROR2), může umožnit vývoj specifických inhibitorů, které blokují aberantní signalizaci, a tím příznivě ovlivňují přežití pacientů.

Konflikty zájmů

Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo k žádnému konfliktu zájmů.

Poděkování

Tato studie byla podpořena Nadací pro výzkum rakoviny prsu (NIH Grant P01-CA081534), Kalifornským institutem pro regenerativní medicínu, Čínskou národní přírodovědeckou nadací (NSFC, Grant č. 2016YFC009159) a Vědeckotechnickou nadací města Šen-čen v Číně (Shenzhen Peacock Innovation Team Project, Grant č. KQTD20140630100658078).

Poděkování

Tato studie byla podpořena Nadací pro výzkum rakoviny prsu (NIH Grant P01-CA081534).