Principy bisulfitového sekvenování celého genomu

Epigenetické studie potvrdily, že DNA-metylační modifikace specifických genových oblastí hraje důležitou roli v konformaci chromozomu a regulaci genové exprese. Metylace cytozinových zbytků DNA na úrovni C5 (5meC) je běžnou epigenetickou značkou u mnoha eukaryot a hojně se vyskytuje v CpG nebo CpHpG (H=A, T, C). Existují především tři přístupy, včetně štěpení endonukleázou, afinitního obohacování a bisulfitové konverze (tabulka 1). Téměř všechny přístupy sekvenčně specifické analýzy metylace DNA vyžadují před amplifikací nebo hybridizací úpravu závislou na metylaci, aby byla zachována věrnost. K detekci zbytků 5meC se následně provádějí různé techniky molekulární biologie, například sekvenování nové generace (NGS).

Tabulka 1. Hlavní principy metylační analýzy založené na NGS.

*MCA: amplifikace metylovaných CpG ostrovů; *HELP: HpaII tiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR; *MSCC: methylation-sensitive cut counting; *MeDIP-seq: methylated DNA immunoprecipitation; *MIRA: methylated CpG island recovery assay; *RRBS: reduced representation bisulfite sequencing; *WGBS: whole genome bisulfite sequencing; *BSPP: bisulfite padlock probes.

Bisulfitová konverze podnítila v 90. letech 20. století revoluci v analýze metylace genomu. Vzhledem k tomu, že bisulfit může přeměnit nemetylované cytosiny v genomu na uracily a ty pak během amplifikace PCR nahradit thyminy, které lze po sekvenování odlišit od cytosinů původně změněných metylací spočítáním cytosinů a thyminů pro každou pozici (obr. 1). Celogenomové bisulfitové sekvenování (WGBS) jako výzkumná metoda, která má v této oblasti velký význam, používá kombinaci bisulfitového ošetření a technologií sekvenování nové/třetí generace (většinou sekvenování shotgun) ke studiu metylace DNA na genomové úrovni.

Obrázek 1. Sekvenování celého genomu (WGBS). Bisulfitová konverze a amplifikace PCR před sekvenováním DNA.

Výhody bisulfitového sekvenování celého genomu

• Umožnění profilování metylace celého genomu na úrovni jedné báze.
• Posouzení metylačního stavu téměř každého CpG lokusu, včetně intergenových „genových pouští“, částečných metylačních domén a vzdálených regulačních elementů.
• Zjištění absolutních úrovní metylace DNA a metylačního sekvenčního pozadí.

Pracovní postup bisulfitového sekvenování celého genomu

Zkrátka základní kroky bisulfitového sekvenování celého genomu (WGBS) zahrnují extrakci DNA, bisulfitovou konverzi, přípravu knihovny, sekvenování a bioinformatickou analýzu. Zde použijeme jako příklad Illumina HiSeq, abychom ilustrovali pracovní postup WGBS.

Obrázek 2. Pracovní postup bisulfitového sekvenování celého genomu (Khanna et al. 2013).

• Extrakce DNA

Nejprve se připraví přibližně 1-5 mg vzorků tkání odebraných z lidí, zvířat, rostlin nebo mikroorganismů pro DNA. Obecně musí vzorky pro celogenomové bisulfitové sekvenování splňovat následující čtyři charakteristiky.

i. Eukaryota;

ii. Hypomethylace (jak ukazuje obrázek 3, studie ukázaly, že jakmile se počet míst CpG v oblasti zvýší, začnou se sekvenační data WGBS snižovat);

iii. Jeho referenční genom byl sestaven alespoň na úrovni skeletů;

iv. Relativně kompletní anotace genomu. A poté použijte vhodnou soupravu pro extrakci vysoce čisté a vysokomolekulární DNA. Extrahovaná DNA by neměla mít hmotnost menší než 5 μg, koncentraci menší než 50 ng/ul a OD260/280 1,8 až 2,0.

Obrázek 3. V případě, že se jedná o extrahovanou DNA, měla by být její koncentrace menší než 50 ng/ul. Konvenční technologie WGBS má nízké pokrytí metylačních míst (Raine et al. 2016)

• Bisulfitová konverze

Bisulfitová konverze je považována za „zlatý standard“ pro analýzu metylace DNA, principy byly znázorněny na obr. 4. U této metody může rozklad DNA vyvolaný BS vést k vyčerpání genomických oblastí obohacených o nemetylované cytosiny. Proto je důležité posoudit množství degradace DNA za podmínek reakce a je třeba také zvážit, jak to ovlivní požadovaný amplikon. Olova et al. (2018) zjistili, že degradace DNA je silná u protokolů bisulfitové konverze, které využívají vysokou denaturaci nebo vysokou molaritu bisulfitů. Na trhu je k dispozici několik souprav (tabulka 2).

Obrázek 4: Soupravy pro bisfosfátovou transformaci (viz tabulka 2). Bisulfitem zprostředkovaná deaminace cytosinu (Hayatsu et al. 2004).

Tabulka 2. Protokoly a parametry bisulfitové konverze.

• Příprava knihovny

Příklad EpiGnomeTM Methyl-Seq Kit (Epicentre) (jak je uvedeno na obrázku 5), jednovláknová DNA ošetřená bisulfitem je náhodně primitivně upravena pomocí polymerázy schopné číst uracilové nukleotidy, aby se syntetizovala DNA obsahující specifickou sekvenční značku. 3′ konec nově syntetizovaného vlákna DNA je pak selektivně označen druhou specifickou sekvencí, čímž lze získat dvouznačkovou molekulu DNA se známou sekvenční značkou na 5′ a 3′ konci. Adaptéry Illumina P7 a P5 se následně přidají pomocí PCR na 5 a 3 konec před sekvenováním DNA.

Obrázek 5. Pracovní postup pro sadu EpiGnomeTM Methyl-Seq Kit.

• Sekvenování

Technologie sekvenování Hiseq, nová metoda sekvenování založená na sekvenování po syntéze (SBS), se široce používá pro WGBS. Amplifikace můstku na průtokové buňce se dosahuje pomocí pole jedné molekuly. Vzhledem k tomu, že nová technika reverzibilního blokování může syntetizovat pouze jednu bázi najednou a označit fluorofor, použije se k excitaci fluoroforu odpovídající laser a excitační světlo lze zachytit ke čtení informace o bázi. Strategie párového zakončení 150 bp se obvykle používá ve WGBS k sekvenování 250-300 bp vložených knihoven DNA ošetřených bisulfitem. Kromě platformy Illumina HiSeq se k tomuto účelu běžně používají také platformy PacBio SMRT, Nanopore, Roche 454 a další platformy Illumina.

• Analýza dat

Pro výsledky sekvenování lze provést řadu analýz. V tabulce 3 je uvedeno pět hlavních typů analýzy informací. Kromě toho lze provádět také analýzu hustoty metylace, analýzu diferenciálně metylovaných oblastí (DMR), anotaci DMR a analýzu obohacení (GO/KEGG) a analýzu shlukování. Mezi běžné bioinformatické zdroje WGBS patří BDPC, CpGcluster, CpGFinder, Epinexus, MethTools, mPod, QUMA a TCGA Data Portal.

Tabulka 3. Hlavní typy analýzy dat WGBS.

Vybavené služby:

Celogenomové bisulfitové sekvenování

Cílené bisulfitové sekvenování

ChIP-seq

Redukované zastoupení bisulfitového sekvenování

1. Fraga, M. F., Esteller, M. (2002). Metylace DNA: profil metod a aplikací. Biotechniques, 33(3), 636-49.
2. Green, R. E., Krause, J., Briggs, A. W., Maricic, T., Stenzel, U., et al. (2010). Návrh sekvence neandertálského genomu. Science, 328(5979), 710-722.
3. Hayatsu, H., Negishi, K., & Shiraishi, M. (2004). Analýza metylace DNA: urychlení bisulfitem zprostředkované deaminace cytosinu v postupu sekvenování genomu. Proceedings of the Japan Academy,80(4), 189-194.
4. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., & Baylin, S. B. (1996). Methylačně specifická pcr: nový pcr test pro stanovení methylačního stavu cpg ostrovů. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(18), 9821-9826.
5. Ji, L., Sasaki, T., Sun, X., Ma, P., Lewis, Z. A., & Schmitz, R. J. (2014). Metylovaná DNA je nadměrně zastoupena v datech celogenomového bisulfitového sekvenování. Front Genet, 5(5), 341.
6. Khanna, A., Czyz, A., & Syed, F. (2013). Epignome methyl-seq kit: nová metoda přípravy knihovny po bisulfitové konverzi pro analýzu metylace. Nature Methods, 10(10).
7. Laird, P. W. (2003). The power and the promise of DNA methylation markers (Síla a příslib metylačních markerů DNA). Nature Reviews Cancer, 3(4), 253-266. doi:10.1038/nrc1045
8. Laura-Jayne, G., Mark, Q. T., Lisa, O., Jonathan, P., Neil, H., & Anthony, H. (2015). Celogenomový průzkum metylace DNA u hexaploidní pšenice. Genome Biology, 16(1), 273.
9. Lin Liu, Ni Hu, Bo Wang, Minfeng Chen, Juan Wang, & Zhijian Tian a další (2011). Stručná zpráva o využití sekvenátoru illumina hiseq 2000. Mycology, 2(3), 169-191.
10. Meissner, A., Gnirke, A., Bell, G. W., Ramsahoye, B., Lander, E. S., & Jaenisch, R. (2005). Redukované reprezentativní bisulfitové sekvenování pro srovnávací analýzu metylace DNA s vysokým rozlišením. Nucleic Acids Research, 33(18), 5868-77.
11. Meyer, M., Kircher, M., Gansauge, M. T., Li, H., Racimo, F., & Mallick, S., et al. (2012). High coverage genome sequence from an archaic denisovan individual. Science, 338(6104), 222-6.
12. Olova, N., Krueger, F., Andrews, S., Oxley, D., Berrens, R. V., & Branco, M. R., et al. (2018). Comparison of whole-genome bisulfite sequencing library preparation strategies identifies sources of biases affecting dna methylation data [Srovnání strategií přípravy knihoven pro celogenomové bisulfitové sekvenování identifikuje zdroje zkreslení ovlivňující data o metylaci DNA]. Genome Biology, 19(1), 33.
13. Raine, A., Manlig, E., Wahlberg, P., Syvänen, A. C., & Nordlund, J. (2016). Splinted ligation adapter tagging (splat), nová metoda přípravy knihoven pro bisulfitové sekvenování celého genomu. Nucleic Acids Research, 45(6), e36.
14. Ziller, M. J., Müller, F., Liao, J., Zhang, Y., Gu, H., & Bock, C., et al. (2011). Genomická distribuce a variabilita non-cpg metylace mezi vzorky napříč lidskými buněčnými typy. Plos Genetics, 7(12), e1002389.