Abstrakt

Signální dráha Wnt je spojena s mnoha zásadními buněčnými procesy. Cílem této studie je prozkoumat vliv signalizace Wnt na proliferaci kultivovaných buněk HEK293T. Buňky byly inkubovány s Wnt3a a aktivace Wnt dráhy byla sledována analýzou hladiny proteinu β-kateninu a hladiny exprese cílových genů MYC a CCND1. Hladina proteinu β-kateninu se zvýšila až čtyřnásobně. Zatímco hladina mRNA c-Myc a cyklinu D1 se zvýšila mírně, hladina proteinu se zvýšila až 1,5krát. Pozoruhodné je, že testy MTT a BrdU ukázaly odlišné výsledky při měření míry proliferace buněk HEK293T stimulovaných Wnt3a. V testech s BrdU bylo možné zjistit zvýšení rychlosti proliferace, které korelovalo s použitou koncentrací Wnt3a. Naopak tuto korelaci nebylo možné prokázat v MTT testech. Výsledky MTT, které jsou založeny na mitochondriální aktivitě, byly potvrzeny analýzou komplexu sukcinát dehydrogenázy pomocí imunofluorescence a western blotu. Celkově naše studie ukazuje, že Wnt3a aktivuje proliferaci buněk HEK293. Tyto účinky lze zjistit spíše měřením syntézy DNA než měřením změn mitochondriální aktivity.

1. Úvod

Je známo, že signální dráha Wnt hraje klíčovou roli v regulaci buněčné diferenciace, proliferace, přežití a apoptózy . Proteiny Wnt jsou vysoce konzervovanou rodinou sekretovaných glykoproteinů bohatých na cystein modifikovaných lipidy, které aktivují signální kaskády uvnitř buňky vazbou na člena rodiny receptorů spřažených s G-proteiny Frizzled (Fz) na extracelulární matrix . Existuje 19 členů Wnts obratlovců , které lze rozdělit do dvou hlavních tříd na základě jejich schopnosti stabilizovat cytosolický β-katenin: kanonická a nekanonická cesta . Nedávné práce také ukázaly, že některé ligandy Wnt, jako například Wnt5a, jsou schopny aktivovat více než jen jednu signální dráhu Wnt , takže striktně binární klasifikace je stále více zastaralá. Špatná funkce signální dráhy Wnt souvisí s několika onemocněními, jako je osteoporóza , Crohnova choroba , Alzheimerova choroba , schizofrenie a zejména rakovina .

Ligand Wnt3a patří do β-katenin dependentní (kanonické) signalizace Wnt, která se váže na transmembránové receptory frizzled. Následně komplex receptorů LRP5 (low-density lipoprotein receptor-related protein 5) nebo LRP6 aktivuje cytoplazmatické rozbrázděné proteiny, které spustí inhibici glykogen syntázy kinázy 3β (GSK-3β). Protoonkoprotein β-katenin se hromadí v cytoplazmě jako důsledek rozpadu destrukčního komplexu, který je tvořen adenomatosis polyposis coli (APC), AXIN a GSK-3β. β-katenin se tak může přemístit do jádra, kde aktivuje transkripci cílových genů zprostředkovanou transkripčním faktorem specifickým pro T-buňky (TCF)/lymphoid-enhancing faktorem (LEF) . Tyto geny jsou zodpovědné za regulaci základních fyziologických procesů v embryonálním a dospělém vývoji, jako je buněčná proliferace, diferenciace, morfogeneze a buněčná adheze .

Při indikaci proliferace dochází ke složité interakci mezi kanonickou signalizací Wnt a buněčným cyklem. Signální dráha Wnt/β-katenin je významná při stimulaci progrese G1-fáze inhibicí GSK-3β, která reguluje efektory buněčného cyklu a růstové regulátory .

Jedním z přímých cílových genů signální dráhy Wnt/β-katenin je protoonkogen MYC, který byl identifikován jako cíl Wnt u buněk rakoviny tlustého střeva . Regulátor transkripce c-MYC řídí mnoho buněčných funkcí, zejména regulaci progrese buněčného cyklu . Gen kódující cyklin D1 CCND1 je také cílovým genem dráhy Wnt/β-katenin, který byl popsán v buňkách rakoviny tlustého střeva . Cyklin D1 jako aktivátor cyklin dependentní kinázy (cdk) 4 nebo cdk 6 řídí přechod fáze G1/S .

Existuje několik způsobů měření proliferace buněk indukované Wnt3a . Jednou z neradioaktivních metod je imunoanalýza založená na inkorporaci 5-bromo-2′-deoxyuridinu (BrdU) do DNA za účelem stanovení syntézy DNA, která koreluje s přechodem do fáze S, a tedy s buněčnou proliferací . Další metoda využívá měření mitochondriální aktivity životaschopných buněk. V testu MTT vzniká nerozpustný modrý formazanový produkt redukcí MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid) mitochondriálními dehydrogenázami .

V této studii jsme zkoumali proliferaci buněk HEK293T pod vlivem ligandů Wnt3a pomocí testu MTT i BrdU. Dále jsme porovnali výsledky těchto testů s mitochondriální aktivitou buněk ošetřených Wnt3a měřenou pomocí imunoznačení proteinu elektronového transportního řetězce SDHA (podjednotka A komplexu sukcinátdehydrogenázy).

2. Materiál a metody

2.1. Materiály a metody Buňky a kultivace buněk

Lidské embryonální ledvinové buňky HEK293T byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném médiu Eagle (DMEM) doplněném 10% fetálním hovězím sérem (PAN Biotech, Aidenbach, Německo), 1% neesenciálními aminokyselinami a 1% penicilinem/streptomycinem (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) při 37 °C a 5% CO2.

2.2. Proliferační testy

MTT a BrdU testy byly prováděny na 96jamkových destičkách. Do každé jamky bylo nasazeno deset tisíc buněk a buňky byly stimulovány stupňujícími se dávkami Wnt3a (R&D Systems, Minneapolis, USA), konkrétně 0, 10, 50, 100, 150 a 200 ng/ml, po dobu 24, 48 a 72 h. MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) byl rozpuštěn v PBS v koncentraci 5 mg/ml a do každé jamky bylo přidáno 20 μl roztoku MTT s následnou tříhodinovou inkubací při 37 °C v 5% CO2. Poté bylo médium s MTT vymyto a přidáno 200 μl DMSO. Pro rozpuštění krystalů byly buňky 15 minut protřepávány při pokojové teplotě. Hodnoty na destičkách byly odečteny čtečkou ELISA (Tecan Group Ltd., Männedorf, Švýcarsko) při vlnové délce 590 nm. Pro stanovení BrdU byla použita komerční souprava „Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric“ (Roche, Mannheim, Německo) podle pokynů výrobce. Po přidání roztoku značení BrdU byly buňky inkubovány po dobu tří hodin při 37 °C a 5 % CO2. Po závěrečném promytí bylo k buňkám přidáno 100 μl/jamku roztoku substrátu a reakce byla po 15 minutách inkubace při pokojové teplotě zastavena pomocí kyseliny sírové. Destičky byly ihned odečteny čtečkou ELISA při vlnové délce 450 nm. Všechny testy byly provedeny ve třech opakováních (). Pro kalibraci byly buňky nasazeny v různých počtech (0,1 × 104 až 3 × 104).

2.3. Imunocytochemie a fluorescenční mikroskopie

Buňky HEK293T byly nasazeny do 24jamkových destiček a ošetřeny 0-200 ng/ml Wnt3a při konfluenci 30 % a fixovány ve 4% formaldehydu po 24, 48 a 72 h. Byla přidána protilátka SDHA (Abcam, Cambridge, UK) v ředění 1 : 200 a buňky byly inkubovány jednu hodinu. Buněčná jádra byla protibarvena DAPI po dobu 5 min. Buňky byly analyzovány pomocí fluorescenčního mikroskopu (Observer. Z1 od společnosti Zeiss, Jena, Německo) a doprovodného softwaru AxioVision 4.7.

2.4. Gelová elektroforéza proteinů a Western Blot

Pomocí Bradfordova testu byly stanoveny koncentrace proteinů v celobuněčných lyzátech. Stejná množství proteinů byla naložena na SDS-polyakrylamidové gely (NuPAGE, 4-12 %, Life Technologies, Carlsbad, USA). Gely byly zpracovávány při 150 V po dobu 1 h a přeneseny na nitrocelulózové membrány pomocí systému iBlot (Life Technologies). Membrány byly analyzovány pomocí primárních protilátek proti SDHA, β-kateninu, c-Myc, cyklinu D1 a β-aktinu (Cell Signaling, Cambridge, UK), ředěných 1 : 1000 v TBS-Tween s 3 % mléka, a následně inkubovány s příslušnou sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (ředění 1 : 2000). Proteinové pásy byly vizualizovány pomocí detekce ECL.

2.5. Izolace RNA a RT-PCR

Celková RNA byla izolována pomocí NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Německo) a 1 μg RNA byl reverzně přepsán pomocí Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Německo) v objemu 40 μl. Sekvence primerů (MWG, Mnichov, Německo) použitých pro semikvantitativní PCR s reverzní transkriptázou jsou pro GAPDH 5′-catggtgctgagatttgccaac-3′ (forward) a 5′-tcaacaccttgaccttctcatcac-3′ (reverse), pro MYC 5′-ccgagcaaggacgcgactctc-3′ (forward) a 5′-gcctttcagagaagcgggtcct-3′ (reverse) a pro CCND1 5′-gcctgaacctgaggagcccca-3′ (forward) a 5′-gtcacacttgatcactctgg-3′ (reverse). Amplifikace PCR byla provedena pomocí směsi My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Německo) podle protokolu výrobce. Reakce byla provedena s předběžnou denaturací po dobu 2 min při 94 °C, následovanou 30 cykly denaturace při 94 °C po dobu 1 min, žíhání při 55 °C (CCND1), 57 °C (GAPDH) nebo 60 °C (MYC) po dobu 30 s a extenze při 72 °C po dobu 1 min. Závěrečný krok prodloužení trval 10 min při 72 °C. Produkty PCR byly analyzovány elektroforézou na 1,5% agarózovém gelu.

2.6. Analýza dat

Pro správu dat, včetně výpočtu směrodatných odchylek, byl použit software Microsoft Excel. western bloty a agarosové gely byly skenovány pomocí gelového dokumentačního systému Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Německo). Pásy byly kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, USA).

3. Výsledky

3.1. Kvantitativní analýza výsledků Účinky Wnt3a na indukci β-kateninu a typických cílových genů Wnt

Pro prokázání aktivace dráhy Wnt jsme zjišťovali množství koncentrace proteinu β-kateninu v buňkách HEK293T po ošetření Wnt3a (obr. 1). Po 24 hodinách léčby se koncentrace proteinu β-kateninu zvyšovala s rostoucí koncentrací Wnt3a. Nejvyšší koncentrace proteinu β-kateninu byla zjištěna po 24 hodinách při koncentraci 200 ng/ml Wnt3a. Zde kvantifikace ukázala čtyřnásobné zvýšení ve srovnání s kontrolou. V časových bodech 48 a 72 hodin po ošetření již není účinek indukce β-kateninu jasně rozpoznatelný. Dále jsme analyzovali regulaci cílových genů Wnt CCND1 a MYC po léčbě Wnt3a jak pomocí semikvantitativní RT-PCR, tak pomocí western blotu (obrázky 2 a 3). U neošetřených buněk byla zjištěna bazální hladina c-Myc a cyklinu D1. Výsledky RT-PCR ukázaly okrajové změny v množství cDNA MYC a indukci CCND1 po 24 a 48 hodinách s 10 ng/ml Wnt3a a také po 72 hodinách s koncentrací 100-200 ng/ml Wnt3a. Mírně zvýšená hladina proteinu c-Myc byla pozorována při koncentraci 50 ng/ml po 24 hodinách. Kvantifikace cyklinu D1 pomocí western blotu ukázala 1,5násobné zvýšení při koncentraci Wnt3a od 50 do 200 ng/ml po 24 hodinách. Hladina proteinu c-Myc stoupala stejným způsobem s koncentrací 50 ng/ml Wnt3a po 24 hodinách.

Obrázek 1

Western blot analýza buněk HEK293T ošetřených 0-200 ng/ml Wnt3a po dobu 24, 48 nebo 72 h. β-katenin se mírně zvýšil 24 hodin po ošetření. Jako kontrola zatížení byla použita protilátka proti β-aktinu. Pro kvantifikaci byly hladiny proteinů normalizovány na hladinu β-aktinu a neošetřená kontrola byla stanovena na 1.

Obrázek 2

Výsledky RT-PCR. Exponenciálně rostoucí buňky HEK293T byly ošetřeny 0-200 ng/ml Wnt3a po dobu 24, 48 nebo 72 h. Po těchto časových bodech byla izolována celková RNA a byla provedena semikvantitativní RT-PCR s použitím primerů specifických pro CCND1, MYC a jako kontrola zatížení GAPDH. Pro kvantifikaci byla exprese normalizována na úroveň exprese GAPDH a neošetřená kontrola byla nastavena na 100 %.

Obrázek 3

Western blot analýza buněk HEK293T ošetřených 0-200 ng/ml Wnt3a po dobu 24, 48 nebo 72 h. Membrána byla inkubována s protilátkami specifickými pro cyklin D1 a c-Myc. Jako kontrola zatížení byla použita protilátka proti β-aktinu. Pro kvantifikaci byly hladiny proteinů normalizovány na hladinu β-aktinu a neošetřená kontrola byla nastavena na 100 %

3.2. Testy buněčné proliferace

Pro studium účinků proteinů Wnt na růst buněk byly buňky HEK293T kultivovány v 96jamkových destičkách po dobu 24 hodin, než byly ošetřeny proteinem Wnt3a o koncentraci 0, 10, 50, 100, 150, resp. 200 ng/ml. Po 24, 48 a 72 hodinách inkubace byly provedeny testy MTT a BrdU. Testy BrdU vykazují jasný trend; se zvyšující se koncentrací Wnt3a se zvyšoval související odečet (obrázek 4(a)), kdy Wnt3a vykazuje nejvyšší rychlost růstu po 48 hodinách a koncentraci 200 ng/ml.

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 4

Výsledky testů proliferace. Buňky HEK293T byly ošetřeny různými koncentracemi Wnt3a. Hodnoty testů byly měřeny po 24 h, 48 h a 72 h. Sloupce ukazují počet buněk v jamce vyjádřený v procentech ve srovnání s neošetřenou kontrolou (svislá osa), která byla normalizována na 100 %. Všechny testy byly provedeny ve třech opakováních. (a) Test BrdU. (b) Test MTT.

Na rozdíl od testů BrdU nevykazovaly testy MTT korelaci mezi koncentrací Wnt a počtem buněk. Počty buněk zůstaly všechny přibližně stejné nebo se snížily v porovnání s jejich příslušnými kontrolami (viz obrázek 4b).

3.3. Stanovení počtu buněk. Mitochondriální aktivita

Pro další doložení role Wnt3a týkající se mitochondriální aktivity v buňkách HEK293T bylo stanoveno množství proteinu SDHA pomocí western blotu i imunocytochemické analýzy. Sukcinátdehydrogenáza (SDH) se svou podjednotkou SDHA je klíčovou složkou cyklu kyseliny citronové, která je zapojena do komplexu II mitochondriálního elektronového transportního řetězce a je zodpovědná za přenos elektronů ze sukcinátu na ubichinon. Buňky byly zpracovány stejně jako při experimentech s analýzou proliferace a inkubovány s protilátkou proti SDHA, jak je popsáno výše. Výsledky (obr. 5) ukázaly rostoucí fluorescenční signál a také intenzivnější signál při western blotu ve srovnání s kontrolou po 24 hodinách působení Wnt3a. Po 48 hodinách hladina proteinu zaznamenaná imunofluorescenční mikroskopií ani western blot analýzou nevykazovala žádné významné změny. Po 72 hodinách léčby Wnt3a byl v obou experimentech pozorován dokonce klesající signál. Nejvyšší signál byl naměřen po 24 hodinách s 50 ng/ml Wnt3a.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Obrázek 5

Mitochondriální aktivita buněk HEK293T ošetřených Wnt3a. (a) Exponenciálně rostoucí buňky HEK293T byly vystaveny různým koncentracím Wnt3a po uvedenou dobu. Byly připraveny proteinové extrakty a použity pro western blot analýzu. Membránové frakce byly inkubovány s protilátkou proti SDHA nebo, jako kontrola zatížení, proti β-aktinu. (b a c) Buňky HEK293T byly podrobeny imunocytochemické analýze. Protein SDHA byl detekován zelenou fluorescencí pomocí fluorescenční mikroskopie při 200násobném zvětšení. Sloupce ukazují intenzitu pásů vyjádřenou v procentech ve srovnání s neošetřenou kontrolou (svislá osa), která byla normalizována na 100 %.

4. Diskuse

Wnt proteiny se podílejí na různých buněčných funkcích včetně regulace genové exprese pro buněčný cyklus a proliferaci . Wnt3a je znám jako promotor proliferace a migrace epiteliálních buněk lidské čočky , také pro proliferaci fibroblastů nebo jako regulátor proliferace beta buněk pankreatu NIT-1 . MYC a CCND1 jsou cílovými geny signální dráhy Wnt v savčích buňkách. Například Yoon et al. odhalili, že signalizace Wnt aktivuje biogenezi mitochondrií, provedením rozsáhlého screeningu RNAi; identifikovali geny, které ovlivňují funkci mitochondrií, mimo jiné MYC .

V této práci jsme stanovili účinky Wnt3a na proliferaci buněk HEK293T. K tomu jsme použili dva hlavní testy, které se běžně používají pro analýzu míry proliferace kultivovaných buněk, a to MTT a BrdU test. Přitom jsme zjišťovali a přímo porovnávali specifické účinky ligandů Wnt na syntézu DNA a mitochondriální aktivitu.

Pro zavedení našeho systému a prokázání účinku Wnt3a na dráhu Wnt v buňkách HEK293T jsme prokázali indukci β-kateninu po 24 hodinách působení Wnt3a a analyzovali jsme hladiny exprese MYC a CCND1. Hladina obou cílových genů se po 24 hodinách expozice Wnt3a rovněž zvýšila. C-Myc má klíčovou roli v progresi G1-fáze; reguluje cyklin D1 a potlačuje p21 a p27 . Cyklin D1 zase podporuje fosforylaci a inhibici retinoblastomového (Rb) komplexu, který sám zvyšuje hladinu cyklinu E . Obohacení cyklinu E vede k přechodu kontrolního bodu fáze G1/S .

Během fáze G1 musí mitochondrie dodávat velké množství energie . Po této oxidační fázi následuje redukční období během S-/G2-/M-fáze buněčného cyklu, ve kterém probíhá replikace DNA a proliferace mitochondrií .

Míra proliferace HEK293T ošetřených Wnt3a se při měření pomocí dvou testů použitých v této studii lišila. Tento rozdíl vysvětlujeme rozdílnými mechanismy detekce těchto metod. Test MTT měří aktivitu mitochondrií, naproti tomu test BrdU zjišťuje relativní množství nově syntetizované DNA. Wagner a kol. uvádějí ve svých výsledcích s proliferací psích lymfocytů velmi významný vztah mezi BrdU a MTT, ačkoli se ukázalo, že test BrdU je citlivější než test MTT . Zjevně negativní účinek Wnt3a na počet buněk by mohl být vysvětlen poklesem mitochondriální aktivity. Test BrdU však prokázal podpůrný účinek na syntézu DNA v těchto buňkách. Pokusy s mitochondriální aktivitou ukázaly, že teprve po 24 hodinách léčby Wnt3a se zvýšila hladina SDHA. Aktivace rekombinantním Wnt3a pravděpodobně neměla žádný vliv na mitochondriální aktivitu po 48 hodinách nebo později. Podle tohoto časově omezeného účinku je klesající signál při MTT testu po 48 a 72 hodinách. To potvrzuje i klesající akumulace β-kateninu pomocí Wnt3a po 24 hodinách. Jiné publikace podporují tento předpoklad, že buňky ošetřené Wnt3a vykazují zvýšenou hladinu β-kateninu pouze během 24 hodin . Naše výsledky, které jsou v rozporu s publikovaným proliferačním účinkem Wnt3a, vysvětlujeme tím, že většina studií používala buňky s nadměrnou expresí Wnt3a, médium kondicionované Wnt3a nebo buňky zbavené séra s rekombinantním proteinem Wnt pro aktivaci signální dráhy Wnt/β-aktin.

Závěrem lze říci, že výsledky testů BrdU a MTT jsou při měření účinku Wnt3a na míru proliferace buněk HEK293T stěží srovnatelné. Rozdíly lze vysvětlit jejich odlišným místem použití, a to aktivitou mitochondrií a syntézou DNA. Aby bylo možné podat definitivní důkaz o rychlosti buněčné proliferace, mohla by být interpretace výsledků jedné jediné metody zavádějící. Pro hodnocení buněčné proliferace by přímé počítání buněk optickými metodami nejlépe odráželo skutečnou situaci. Bylo by zajímavé porovnat odpovídající výsledky s výsledky biochemických testů, jako jsou BrdU a MTT.

Konflikt zájmů

Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo ke konfliktu zájmů.

Poděkování

Tato práce byla finančně podpořena Spolkovým ministerstvem pro vzdělávání a výzkum (BMBF) .

.