7.2 Architektura varlat

Lue et al. (2005, 2010a) uvádí, že dospělé myši 41,XXY mají malá, pevná varlata obsahující SCO tubuly se sníženým průměrem a zvýšeným počtem Leydigových buněk v intersticiu. Tyto nálezy jsou totožné s nálezy u alternativního modelu KS, myši 41,XXY* (Lewejohann et al., 2009a; Wistuba et al., 2010, obr. 24.2), a dokonale se podobají testikulárnímu fenotypu pozorovanému u naprosté většiny dospělých mužů s KS (obr. 24.3). Navíc 41,XXY myši vykazovaly aberantní vzorec exprese androgenního receptoru (AR), který dosud nebyl u KS pozorován (Lue et al., 2005).

Obrázek 24.2. Testikulární fenotyp myšího modelu KS 41,XXY*.

(A) Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) pohlavních chromozomů v interfázních jádrech získaných ze vzorků periferní krve myších samců kmene B6Ei.Lt-Y*. Vlevo: jádra leukocytů 40,XY*, vpravo: jádra leukocytů 41,XXY* myších samců. (a) chromozomy Y* (šipky) detekované zelenou fluorescenční myší specifickou sondou; (b) chromozom X (šipky) detekovaný červenou fluorescenční myší specifickou sondou; (c) jaderné barvení DAPI; (d) překrytí a-c. Všimněte si dvou signálů chromozomu X v leukocytech 41,XXY*. Jeden chromozom X se vždy nachází v těsné blízkosti signálu Y*. Částečné překrytí těchto chromozomů lze zjistit podle nažloutlé barvy. (B) Srovnání bitestikulárních hmotností dospělých 41,XXY* mužů (n = 98) a jejich 40,XY* vrstevníků (n = 91). Ztráta zárodečných buněk u samců s nadpočetným chromozomem X vedla k významnému zmenšení velikosti varlat. Hodnoty jsou průměrné ± SEM. (C a D) Reprezentativní mikrofotografie testikulární histologie semenného epitelu. (C) Kontrolní myš 40,XY* vykazující plnou spermatogenezi. (D) varle myši 41,XXY*. Ze semenného epitelu byly odstraněny všechny zárodečné buňky a zůstal pouze syndrom Sertoliho buněk. Sertoliho buňky vykazují počátek vakuolizace. (E a F) Reprezentativní mikrofotografie testikulární histologie intersticiálního prostoru. (E) U kontrolních myší 40,XY* jsou Leydigovy buňky normálně uspořádány v intersticiálních prostorech mezi stěnami tubulů. (F) Naproti tomu u myší 41,XXY* je počet Leydigových buněk zvýšený a tvoří hyperplazii. Sloupce představují 20 μm. Symboly: X, Sertoliho buňky; *, diferencující se zárodečné buňky; #, Leydigovy buňky. Barvení: Hematoxylin-Eosin.

Obrázek 24.3. Histologie lidské testikulární tkáně: Srovnání normální spermatogeneze a syndromu SCO typicky pozorovaného u pacientů s Klinefelterovým syndromem.

(A, C a E) Reprezentativní mikrofotografie normální histologie lidských varlat vykazující plnou spermatogenezi. (B, D a F) Reprezentativní mikrofotografie testikulární histologie pacienta s KS a syndromem SCO. (A a B) přehled příčných řezů tubuly: zatímco kontrolní tkáň vykazuje normální rozložení intersticiálních a tubulárních oblastí, situace SCO vykazuje úplnou ztrátu zárodečných buněk a hyalinizované stěny tubulů. Semenné kanálky obsahují pouze Sertoliho buňky. (C a D) Detail semenotvorného epitelu: U kontroly jsou přítomna všechna stadia zárodečných buněk až po zralé spermie. Typicky u dospělých mužů s KS všechny zárodečné buňky chybí. Sertoliho buňky vykazují počátek vakuolizace. (E a F) Detail intersticiálního prostoru. V kontrolním varleti jsou Leydigovy buňky normálně uspořádány v intersticiálních prostorech mezi stěnami tubulů. Naproti tomu ve tkáni získané od pacienta s KS je počet Leydigových buněk zvýšený a vykazuje typickou hyperplazii. Sloupce představují 20 μm. Symboly: X, Sertoliho buňky; *, diferencující se zárodečné buňky; #, Leydigovy buňky. Barvení: Hematoxylin-Eosin.

Sertoliho buňky se nacházejí v semenných kanálcích, kde podporují spermatogenní diferenciaci tím, že poskytují výživu a zprostředkovávají endokrinní signalizaci (Wistuba et al., 2007). Jakékoli změny v těchto základních buňkách proto hluboce ovlivňují funkci varlat. Byly nalezeny důkazy o časné apoptóze Sertoliho buněk u KS, což vede k domněnce, že ztráta podpory a komunikace mezi Sertoliho buňkami a pohlavními buňkami může souviset s úbytkem pohlavních buněk, který je u tohoto syndromu pozorován (Aksglaede et al., 2006; Wistuba et al., 2010). Sertoliho buňky exprimují androgenní receptor (AR) a produkují protein vázající androgeny a inhibin. Jakékoli narušení těchto buněk proto může ovlivnit množství ITT v intersticiálních prostorech a v důsledku toho ovlivnit endokrinní zpětnou vazbu podél hypotalamo-hypofyzární gonadální osy. Dokud nebyly k dispozici první systematické poznatky z experimentálních modelů, nebylo možné získat žádné empiricky podložené důkazy o změněné přítomnosti, vývoji a/nebo funkci Sertoliho buněk. Výsledky prvních studií (Lue et al., 2005) byly obzvláště zajímavé a důležité, protože ukázaly, že AR je exprimován v Sertoliho buňkách dospělých kontrolních myší XY, ale ne u myší XXY. A to i přesto, že obě zvířata měla podobný vzorec až do 20. dne po porodu (pp), což naznačuje, že ke ztrátě exprese AR u XXY myší dochází kolem puberty, a naznačuje, že u těchto zvířat může být zrání Sertoliho buněk změněno, což naznačuje, že mohou ovlivňovat nebo být ovlivněny abnormálním vývojem zárodečných buněk. Určitou důvěryhodnost této představě poskytlo histologické hodnocení varlat modelu 41,XXY*, které zjistilo, že počet Sertoliho buněk je ve srovnání s kontrolami snížený.

Dosud provedená šetření poskytují dostatečné důkazy pro domněnku, že Sertoliho buňky jsou u samců s nadpočetným chromozomem X změněné. K pochopení základů interakce zárodečných buněk se Sertoliho buňkami, apoptózy, zrání a diferenciace Sertoliho buněk jsou zapotřebí důkladnější hodnocení; studie, které vyžadují značné množství materiálu a sledování proliferace, diferenciace a zrání v rozsáhlém časovém období. Tato vyšetření není možné provádět u lidí. Pouze s pomocí myších modelů lze provést jakékoli smysluplné zkoumání změn v této klíčové somatické testikulární buňce.

Bylo zjištěno, že během testikulární degenerace pozorované u KS také Sertoliho buňky v průběhu času degenerují (Aksglaede a Juul, 2013; Aksglaede et al., 2006), což je pozorování, které je v souladu s údaji v našem myším modelu prokazujícími, že počet Sertoliho buněk se během postnatálního vývoje mění (Werler et al., 2014). Souhrnně lze říci, že změněná fyziologie Sertoliho buněk vyžaduje podrobnější analýzy tohoto somatického typu buněk již během prenatálního vývoje. Důsledky chromozomální aberace ovlivňují zejména rozmnožování a diferenciaci zárodečné linie. Hlavní kontrolní body a následně procesy probíhající specificky v zárodečné linii by tedy mohly být změněny chromozomální nerovnováhou, tedy vývojem systému primordiálních a spermatogoniálních kmenových buněk (PGC, SSC). Jak již bylo zmíněno, studie in vitro ukázaly, že aneuploidní nediferencované zárodečné buňky při izolaci z embryonálních gonád odumírají a v kultuře přežívají pouze ty s náhodně opraveným karyotypem (Hunt et al., 1998; Mroz et al., 1999). SSC s aberantním karyotypem tedy musely vstoupit na výchozí dráhu během intrauterinní fáze, ale nejpozději v perinatálním období. Když po izolaci z embryonální gonády přežívají in vitro pouze zárodečné buňky s opraveným karyotypem, zatímco aberantní zárodečné buňky časem odumírají, vyvstává otázka, proč – in vivo – ztráta zárodečných buněk postupuje postnatálně, jak se nedávno ukázalo (Werler et al., 2014). I když je v perinatálním varleti stále přítomno několik aberantních zárodečných buněk, určitá část těch, které jsou přítomny v okamžiku narození, by měla mít správný karyotyp a populace spermatogonií by měla přinejmenším zůstat stabilní, pokud se nerozmnoží. Z tohoto částečně rozporuplného pozorování a za přijetí nejpravděpodobnějšího předpokladu, že korekce náhodnou propulzí vysvětluje přežívání redukované populace primordiálních zárodečných buněk (PGC; Mroz et al., 1999; Sciurano et al., 2009) a následně gonocytů do postnatálního období, by část těchto přeživších mohla ztratit své vlastnosti kmenových buněk již před narozením. Zřejmě se ztratí během peripubertální diferenciace, zatímco velmi málo z nich může příležitostně přežít, správně exprimovat všechny relevantní markery a řídit ohniska spermatogeneze. Systematické hodnocení fenotypových změn během vývoje in utero je samo o sobě možné pouze na myším modelu.

Narušení osy HPG, které způsobuje hypergonadotropní hypogonadismus běžně pozorovaný u pacientů s KS, spolu s naznačeným zvýšeným počtem Leydigových buněk v testikulárních biopsiích vedlo k hypotéze, že funkce a/nebo zrání Leydigových buněk může být ovlivněno pohlavní chromozomální nerovnováhou. Leydigovy buňky jsou steroidogenní a jsou zdrojem testosteronu, který je nezbytný pro vývoj zdravého mužského fenotypu a rozhodující pro pokračování a dokončení normální spermatogeneze.

Stejně jako u ostatních aspektů KS je omezujícím faktorem pro jakékoli hloubkové vyšetřování omezený přístup k testikulární tkáni. S dostupností myších samců 41,XXY* se staly studie Leydigových buněk samců s nadpočetným chromozomem X zkoumatelnými. Pomocí tohoto modelu jsme potvrdili přítomnost hyperplazie Leydigových buněk, jak bylo stanoveno stereologickou mikroskopií, a také jsme zjistili, že hladiny ITT byly podobné jako u kontrolních myší (Wistuba et al., 2010). To bylo překvapivé vzhledem k nízkým sérovým hladinám T pozorovaným jak u pacientů s KS, tak u 41,XXY* myší (Lanfranco et al., 2004; Smyth a Bremner, 1998; Wistuba, 2010). V souladu s nízkými hladinami T v cirkulaci bylo zjištění, že jakmile byly Leydigovy buňky z modelu KS odebrány z testikulárního prostředí, pěstovány in vitro a normalizován jejich počet, jejich funkce byla skutečně změněna. Nebyla však narušena, jak by se na první pohled zdálo, ale hyperaktivována. Když byly zjištěny profily exprese mRNA markerových genů Tsp2 (trombospondin 2: matricelulární protein fetálního původu, který je převážně exprimován v juvenilních Leydigových buňkách), Rlf (relaxin-like factor: marker zralých Leydigových buněk), Est (estrogen sulfotransferáza: (marker zralých Leydigových buněk) a LHR (LH receptor: zkoumán pro korelaci s pokusy o stimulaci Leydigových buněk, viz dále), izolované XXY* Leydigovy buňky vykazovaly profil exprese zralé mRNA a výrazně vyšší transkripční aktivitu ve srovnání s kontrolami (Wistuba et al., 2010; O’Shaughnessy et al., 2002). Analýza genové exprese odhalila celkové zvýšení exprese genů specifických pro XXY* Leydigovy buňky s přibližně 20násobnou expresí Est, 8násobnou Rlf, 5násobnou Tsp2 a 3násobnou LHR oproti Leydigovým buňkám divokého typu. Stimulace XXY* Leydigových buněk in vitro ukázala na zralý LH receptor, který reagoval na stimulaci lidským choriovým gonadotropinem (hCG, náhražka LH) ještě silněji než buňky z kontrol. Kromě toho byla steroidogenní aktivita XXY* Leydigových buněk zvýšená v tom smyslu, že v reakci na hCG bylo produkováno více T na buňku.

Tyto vzrušující výsledky vedou nejen k nové představě o původu hypergonadotropního hypogonadismu, ale také prokazují platnost myšího modelu KS s přímými translačními důsledky pro naše chápání pacientů s KS. Výsledky myšího modelu naznačují, že funkce Leydigových buněk není narušena sama o sobě, což naznačuje, že za narušenou androgenní endokrinologii pozorovanou u pacientů s KS jsou zodpovědné jiné faktory v prostředí varlat. Zejména proto, že i u pacientů jsme mohli potvrdit, že hodnoty ITT se neliší od kontrol (Tüttelmann et al., 2014). Je možné, že změněná architektura varlat spojená s touto poruchou může ztěžovat transport endokrinních látek do oběhu, což je domněnka, která byla podpořena zjištěním, že pacienti s KS mají také zmenšený průměr cév (Foresta et al., 2012). S ohledem na tuto skutečnost jsme se rozhodli najít možné „cévní“ vysvětlení nedostatečného uvolňování T do krevního oběhu varlat. U biopsií varlat pacientů však není spolehlivá analýza cév možná kvůli zkreslení vyplývajícímu z techniky disekce, která vyžaduje vyhýbání se větším cévám, aby se zabránilo krvácení. Proto byla konstituce cév hodnocena v celých řezech varlat dospělých myších samců 41,XXY* a 40,XY*. Poměr krevních cév k povrchu varlat s korekcí na menší varlata myší XXY* byl u těchto myší ve srovnání s kontrolami XY* skutečně výrazně nižší. Závěrem lze říci, že produkce T ve varlatech není u mužů s KS zřejmě narušena. Údaje z myšího modelu nám umožňují spekulovat, že na nižším uvolňování T do krevního oběhu se může podílet snížené cévní zásobení

.