Globální bla KPC-E. coli jsou rozmanité, a to i v rámci nejrozšířenějšího ST, ST131, s důkazy o lokálním přenosu

45 izolátů bylo získáno z 21 měst v 11 zemích na čtyřech kontinentech (2010-2013; předchozí výsledky laboratorní typizace jsou shrnuty v tabulce S1). Jeden izolát byl při celogenomovém sekvenování (WGS; ecol_252) bla KPC negativní, potenciálně ztratil bla KPC během skladování nebo subkultivace v mezidobí mezi provedením původní typizace a následnou extrakcí DNA a přípravou pro WGS. U jednoho izolátu se údaje WGS neshodovaly s výsledky laboratorní typizace (ecol_451), což pravděpodobně představovalo laboratorní záměnu; ecol_252 a ecol_451 byly proto z následných analýz vyloučeny. Ostatních 43 izolátů bylo úspěšně sekvenováno (metriky kvality viz tabulka S1). Mezi těmito 43 izoláty bylo zastoupeno dvacet jedna různých ST E. coli (tabulka 1; předpovězeno in silico z WGS), včetně: ST131 , ST410 , ST38 , ST10, ST69 (zbývající izoláty singletonové ST).

Z 16 053 anotovaných otevřených čtecích rámců (ORF) identifikovaných napříč všemi izoláty KPC-E. coli bylo pouze 2 950 (18,4 %) společných pro všechny izoláty („core“) a dalších 222 (1,4 %) pro 95- < 100 % izolátů („soft core „27). Na úrovni nukleotidů bylo v jádru genomu 213 352 jednonukleotidových variant (SNV), což odpovídá dříve pozorované druhové rozmanitosti28. Profily genů rezistence se také výrazně lišily mezi jednotlivými kmeny, přičemž některé z nich obsahovaly několik mechanismů rezistence vůči beta-laktamům, aminoglykosidům, tetracyklinům a fluorochinolonům (např. ecol_224) a jiné obsahovaly pouze bla KPC (např. ecol_584; obr. 1). U 16 kmenů s KPC-ST131 bylo 4 071/7 910 (51 %) ORF jádrem a 6 778 SNV v jádru genomu těchto izolátů, což opět odpovídá předchozím globálním studiím diverzity ST13123, 24 (obr. S1). Příslušné genomy byly vysoce shodné u některých (např. ecol_356/ecol_276/ecol_875), ale ne u všech (např. ecol_AZ159/ecol_244) izolátů, které byly úzce příbuzné ve svých jádrových genomech, což podporuje vysoce variabilní evoluční dynamiku mezi jádrovými a příslušnými genomy (obr. 1). Geografické rozšíření izolátů úzce příbuzných v jádrovém i akcesorním genomu podporuje lokální (např. ecol_AZ166, ecol_AZ167 ) přenos konkrétních kmenů KPC-E. coli. Homologie genetických doprovodných motivů kolem genů bla KPC u těchto blízce příbuzných párů izolátů by rovněž odpovídala této hypotéze a méně by odpovídala vícenásobnému získání bla KPC v rámci stejného genetického pozadí, zejména vzhledem k rozmanitosti doprovodných sekvencí bla KPC pozorované ve zbytku souboru dat (viz níže).

Fylogeneze KPC-Escherichia coli identifikovaných z globálních systémů sledování rezistence ke karbapenemům, 2008-2013. Panely vpravo od fylogeneze představují společné mechanismy genů rezistence (úplné podrobnosti o typizaci genů rezistence v tabulce S2), jádrové a akcesorní složky genomu. U panelu akcesorního genomu modrá barva představuje anotované oblasti, které jsou přítomny, a bílá ty, které chybí.

Geny bla KPC se v současné době u E. coli zdají být omezeny na plazmidový kontext, ale mohou existovat ve více kopiích na jediné plazmidové struktuře nebo v plazmidech s vysokým počtem kopií

Třicet čtyři izolátů (80 %) obsahovalo bla KPC-2 a devět izolátů (20 %) bla KPC-3. Chromozomální integrace bla KPC byla popsána u jiných Enterobacteriaceae, Pseudomonas a Acinetobacter spp. ale zůstává vzácná5, 29, 30. Chromozomální integrace bla KPC nebyla prokázána ani v 18 chromozomálních strukturách rekonstruovaných na základě sekvenování s dlouhými čteními, ani na základě přezkumu anotací v kontigenech obsahujících bla KPC (odvozených z de novo sestav Illumina) u ostatních 25 izolátů. Alely bla KPC nebyly segregovány podle ST.

Odhady počtu kopií bla KPC na bakteriální chromozom se pohybovaly mezi <1 (ecol_879, ecol_881) a 55 (ecol_AZ152). V devíti případech byl tento odhad ≥10 kopií bla KPC na bakteriální chromozom (ecol_276, ecol_356, ecol_867, ecol_869, ecol_870, ecol_875, ecol_AZ150, ecol_AZ152, ecol_AZ159, tabulka S2). Šest z těchto izolátů obsahovalo bla KPC v kontextu plazmidu podobného col, ve dvou případech byl typ plazmidu replikonu neznámý a v jednom případě se jednalo o replikon IncN. Počet kopií plazmidu je spojen s vyšší úrovní rezistence k antibiotikům, pokud se příslušný gen nachází na jednotce s vysokým počtem kopií. Je zajímavé, že u plazmidů s vysokým počtem kopií se předpokládá vyšší šance na fixaci v potomských buňkách, protože se šíří přiměřeněji náhodně a bez požadavku na rozdělovací systémy31 , a na přenos při jakékoli konjugaci, ať už přímé, nebo nepřímé32,33,34 .

Populace bla KPC a non-bla KPC plazmidů napříč globálními kmeny KPC-E. coli jsou extrémně rozmanité

Typizace plazmidů Inc odhalila přítomnost mediánu čtyř typů plazmidových replikonů na izolát (rozmezí: 1-6; IQR: 3-5), což představuje širokou rozmanitost (tabulka 1). Replikony IncN, col, IncFIA a IncI1 však byly neúměrně nadměrně zastoupeny u některých ST (p < 0,05; tabulka 1). Mezi 18 izoláty, které byly podrobeny sekvenování PacBio, jsme identifikovali 53 uzavřených, nebla KPC plazmidů v rozsahu od 1 459 bp do 289 903 bp (tabulka S1; přítomny byly nejméně čtyři další, částečně kompletní struktury plazmidů). Z těchto non-bla KPC plazmidů mělo 10 (velikost: 2 571-150 994 bp) <70% podobnost (definovanou procentuální sekvenční identitou vynásobenou podílem délky dotazu prokazující homologii) s jinými sekvencemi dostupnými v GenBank, což zdůrazňuje, že část „plazmidomu“ v KPC-E. coli zůstává neúplně charakterizována. U ostatních 43 plazmidů byl nejvyšší shodou v GenBank plazmid z E. coli v 35 případech, K. pneumoniae v 5 případech a Citrobacter freundii, Shigella sonnei, Salmonella enterica vždy v 1 případě (tabulka S3).

Bylo plně rozlišeno 22 struktur plazmidu bla KPC (17 pouze z dat Pacbio, 4 pouze z dat Illumina, 1 z dat PacBio i Illumina) v rozsahu od 14 029 bp do 287 067 bp (medián = 55 590 bp; IQR: 23 499-82 765 bp). Tyto plazmidy obsahující bla KPC a šest dalších případů, kdy byla bla KPC identifikována na kontigu obsahujícím replicon, byly na základě Inc typizace velmi různorodé (tabulka S1). Nejčastějším typem byl IncN (n = 8/28 typizovatelných struktur bla KPC; 29 %), následovaný malými plazmidy typu col (n = 6/28 ; 21 %). Dalšími méně častými typy byly např: A/C2, FII(k), U (všechny n = 2; a L/M, P, Q1 a R (všechny n = 1). Čtyři (14 %) bla KPC plazmidy byly multireplikonové konstrukty, a to: Col/repA, FIB/FII, FIA/FII a FIA/FII/R.

Běžné IncN plazmidové kostry se globálně rozptýlily v rámci E. coli

Z GenBank jsme pro srovnání vybrali všechny unikátní, plně sekvenované sekvence IncN-bla KPC plazmidů (tabulka S4), které pocházejí již z roku 2005, tedy přibližně z doby prvních zpráv o E. coli produkující KPC. Plasmidové páteře a doprovodné sekvence obklopující bla KPC v těchto 16 referenčních plazmidech a podskupině 12 studijních sekvencí (viz „Metody“) byly v souladu s vícenásobnými akvizicemi dvou známých komplexů IncN-Tn4401-bla KPC v divergentních ST E. coli: zaprvé v rámci elementu podobného Plasmid-9 (FJ223607, 2005, USA) a zadruhé v rámci elementu podobného Tn2/3 v elementu podobném Plasmid-12 (FJ223605, 2005, USA).

V prvním případě byly zjištěny genetické podobnosti mezi Plasmid-9, pKPC-FCF/3SP, pKPC-FCF13/05, pCF8698, pKP1433 (představující hybridní IncN) a bla KPC plazmidy z izolátů ecol_516, ecol_517, ecol_656 a ecol_736 (tato studie). Plazmid-9 obsahuje duplicitní elementy Tn4401b v obrácené orientaci se čtyřmi různými 5 bp doprovodnými sekvencemi v atypickém uspořádání v rámci intronu skupiny II35. Páteřní struktury ostatních plazmidů v této skupině odpovídají samostatné události získání elementu Tn4401b mezi oblastmi pld a traG v rámci ancestrální verze struktury Plasmid-9 s vytvořením flankující duplikace cílového místa TTCAG (TSD) (označeno jako Plasmid 9-like plasmid (hypotetický), obr. 2). Mezinárodní šíření následované lokální evolucí v rámci druhu i mezi druhy by vysvětlovalo rozdíly mezi plazmidy, mj: (i) variace na úrovni nukleotidů (pozorované u všech plazmidů); (ii) malé inserce/delece (pozorované u všech plazmidů); (iii) větší inserce/delece zprostředkované transponovatelnými elementy (např. pCF8698_KPC_2); a (iv) pravděpodobná homologní rekombinace, která vede ke shlukové variaci v rámci podobné kostry plazmidu (např. ecol_656/ecol_736), jakož i výraznější přestavby, včetně vzniku „hybridních“ plazmidů (např. pKP1433)(obr. 2).

Srovnávací schéma IncN plazmidů podobných FJ223607 (Plasmid 9-like) (veřejně dostupné; tato studie) a jejich geografický původ/data izolace. Červeně jsou vyznačeny názvy sekvencí plazmidů z této studie odvozené z dat PacBio a uzavřené (ecol_517, ecol_656) nebo neúplné struktury plazmidů (ecol_516, ecol_736) odvozené z dat Illumina. Zarovnané sloupce přiléhající k názvům plazmidů představují sekvence plazmidů: světle šedá barva označuje oblasti se 100% identitou sekvencí; černá barva představuje nukleotidovou diverzitu mezi sekvencemi a tenké čáry představují indely. Kódující sekvence jsou znázorněny tlustými šipkami pod jednotlivými sloupci sekvencí a jsou barevně označeny podle barevného klíče. Vložené schéma popisující genetickou variabilitu mezi sekvencemi znázorňuje příklady identifikovaných evolučních událostí: (a) změna na úrovni jednoho nukleotidu, (b) malé indely (≤100 bp), (c) velké indely (>100 bp), (d) rekombinační události.

V plazmidu-12 (FJ223605) se Tn4401b vložil do hybridního elementu podobného Tn2-Tn3 (s přidruženými geny rezistence k léčivům včetně bla TEM-1, bla OXA-9 a několika genů rezistence k aminoglykosidům), i když v nepřítomnosti duplikace cílové sekvence, pravděpodobně v důsledku vnitromolekulární, replikační transpozice generující neshodnou sekvenci cílového místa (L TSS = TATTA; R TSS = GTTCT). Tento komplex se zase nachází mezi dvěma elementy podobnými IS15DIV (IS15Δ)/IS26 lemovanými 8 bp invertovanými repeticemi a umístěnými mezi lokusy traI (891 bp od 3′ konce) a pld (~28 Kb; obr. 3A). Páteřní komponenty plazmidu IncN-12 odpovídají těm, které byly pozorovány v ohnisku nákazy NIH5 a v přeorganizované verzi v ohnisku nákazy na University of Virginia (CAV1043; 2008)6 . Z této studie vyplývá, že plazmidy ecol_224, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_422 a scaffoldy ecol_AZ151, ecol_744, ecol_AZ150 mají téměř identickou strukturu jako plazmid-12, přičemž v genech traJ-traI je přítomna shluková variabilita na úrovni nukleotidů, což odpovídá homologní rekombinační události ovlivňující tuto oblast, a důkazy o sporadických insercích/delecích (obr. 3A). Struktury bla KPC-Tn4401 v těchto izolátech jsou však téměř zcela degradovány přítomností jiných mobilních genetických elementů (MGE), včetně elementů podobných Tn2/Tn3, ISKpn8/27 a Tn1721. V případě ecol_224 byl bla KPC-2 vložen do páteře IncN jako součást dvou opakovaných, invertovaných struktur podobných Tn3, které jsou lemovány TTGCT TSD a jsou blíže traI (136 bp od 3′ konce) než výše zmíněný komplex podobný IS15DIV (IS15Δ)/IS26 v plazmidu-12 (obr. 3B). Ačkoli vzhledem k dostupným údajům není možné přesně vysledovat evoluční historii této genomové oblasti, přítomnost společných znaků této struktury v ecol_422, ecol_744, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_AZ150 a ecol_AZ151 naznačuje společné získání a několikanásobné následné přeskupení zprostředkované přítomností velkého počtu MGE obklopujících bla KPC-2.

Srovnávací schéma plazmidů IncN KPC podobných FJ223605 (Plasmid-12-like) z této studie. Panel 3A. Geografický původ, data izolace a celkové zarovnání struktur plazmidů/kontig. Červeně jsou vyznačeny názvy sekvencí plazmidů z této studie odvozené z dat PacBio a uzavřené (ecol_224, ecol_422, ecol_881, ecol_AZ159) nebo neúplné struktury plazmidů (ecol_744, ecol_AZ151, ecol_AZ150) odvozené z dat Illumina. Zarovnané sloupce přiléhající k názvům plazmidů představují sekvence plazmidů: světle šedá barva označuje oblasti se 100% homologií sekvencí; černá barva představuje nukleotidovou diverzitu mezi sekvencemi a tenké čáry představují indely. Kódující sekvence jsou znázorněny tlustými šipkami pod jednotlivými sloupci sekvencí a jsou barevně označeny podle barevného klíče. Vložené schéma popisující genetickou variabilitu mezi sekvencemi znázorňuje příklady identifikovaných evolučních událostí: (a) změna na úrovni jednoho nukleotidu, (b) malé indely (≤100 bp), (c) velké indely (>100 bp), (d) rekombinační události. Panel 3B. Přiblížení oblasti mezi traI a pld obsahující bla KPC-2 pouze u studovaných izolátů. Kódující sekvence jsou barevně označeny stejně jako na obr. 3A; oblasti sekvencí uvedené v textu jsou opatřeny poznámkami.

Kolem podobné plazmidy mohou představovat důležitý vektor přenosu bla KPC u E. KPC. coli

Malé col-like plasmidy byly druhým nejčastějším typem plasmidu nesoucího bla KPC u E. coli (n = 5 ), ale tři z nich byly identické (bla KPC-2, 16 559 bp), všechny izolované v Pittsburghu, USA, z izolátů ST131 v průběhu dvou let (ecol_276 , ecol_356 , ecol_875 ). Tyto tři izoláty navíc obsahovaly replikony FIA, FIB, FII, X3 a X4, což naznačuje stabilní perzistenci klonálního kmene + plazmidů v průběhu času, což je v souladu s analýzami SNV/jádra i akcesorního genomu (obr. 1, obr. S1).

Další dva plazmidy podobné col účinně představují krátké úseky DNA kódující různé mobilizační geny (mbeA/mbeC/mbeD) zapojené do modulů Tn4401/bla KPC. Sekvence 5 bp lemující Tn4401 odpovídaly v obou případech přímé mezimolekulární transpozici (ecol_870: TGTTT-TGTTT; ecol_867: TGTGA-TGTGA). V tomto souboru dat byl také pozorován plazmid s kointegrací col/repA (ecol_AZ161), ve kterém byl Tn4401b vložen mezi signaturní sekvence colE3 a element Tn3 (Tn4401 TSS: AGATA-GTTCT). Tvorba takovýchto kointegračních plazmidových struktur u E. coli byla také již dříve popsána36, včetně struktury fúzovaného plazmidu podobného col/pKpQIL (pKpQIL je historicky spojován s bla KPC)37.

Plazmidy podobné col byly spojovány s producenty KPC i v dalších menších, regionálních studiích21, 38. Znepokojující je, že se ukázalo, že tyto malé vektory jsou zodpovědné za mezidruhovou difúzi qnr genů zprostředkujících rezistenci k fluorochinolonům, a to i při absenci zjevného antimikrobiálního selekčního tlaku39. Významná asociace col-like plazmidů s určitými ST E. coli (převážně ST131) v této studii by mohla být jedním z vysvětlení neúměrného zastoupení bla KPC v této linii.

Různorodé sekvence 5 bp cílových míst (TSS) Tn4401 podporují vysokou mobilitu transpozonů

Kompletní izoformy Tn4401 lemující bla KPC-2 nebo bla KPC-3 byly pozorovány pouze u 24/43 (56 %) izolátů, včetně Tn4401a/a-like (n = 10; jeden izolát s kontigovým zlomem před bla KPC), Tn4401b (n = 12) a Tn4401d (n = 2). Bylo identifikováno jedenáct různých párů 5 bp sekvence cílového místa (TSS), z nichž 7 (64 %) nebylo pozorováno v žádném srovnávacím plazmidu staženém z GenBank (tabulka S5). Tn4401a měl tři různé 5 bp TSS, Tn4401b sedm a Tn4401d jeden. Většina představovala TSD, ale ve třech případech obklopovaly Tn4401 různé 5 bp TSS, což odpovídá jak přímým inter-, tak replikačním intramolekulárním transpozičním událostem.

Z kompletního souboru plazmidů GenBank a transpozičních experimentů in vitro provedených jinými subjekty bylo charakterizováno 30 různých typů párů 5 bp TSS, z toho sedm pouze v experimentálním prostředí40. Stažené plazmidy pocházejí z různých druhů a časových období (2005-2014), ačkoli v důsledku zkreslení při odběru vzorků mohou nedostatečně reprezentovat širší rozmanitost inzertních míst Tn4401. Naše údaje by však odpovídaly významné mobilitě Tn4401 v rámci E. coli po získání různých izoforem Tn4401 a/nebo představují vícenásobný import do E. coli z jiných druhů.

Tradiční spojení bla KPC s Tn4401 bylo v plazmidech KPC u E. coli výrazně narušeno

Nejenže u dalších 19/43 (44 %) izolátů byla struktura Tn4401 degradována nahrazením MGE, z nichž pouze některé byly popsány již dříve41, 42 . Dva izoláty měly nové struktury Tn4401Δb (zkrácení v horním proudu IS26 nebo IS26-ΔIS5075 ). Struktura podobná Tn4401e (delece 255 bp před bla KPC) byla přítomna u tří izolátů (ecol_227, ecol_316, ecol_583): ta byla dále charakterizována v jedné kompletní sestavě PacBio plazmidu (ecol_316) a představovala přestavbu v místě L TSS elementu ISKpn7. V tomto plazmidu byl přítomen druhý, částečný element Tn4401 bez bla KPC, což by odpovídalo neúplné, replikační, vnitromolekulární transpozici (GGGAA = L TSS a R TSS na dvou elementech Tn4401b, v opačné orientaci). Další motivy obklopující bla KPC zahrnovaly: hybridní elementy Tn2/Tn3-ISKpn8/27-bla KPC (n = 1; ecol_224); IS26-ΔtnpR(Tn3)-ISKpn8/27- bla KPC-ΔTn1721-IS26 (n = 5; ecol_AZ153-AZ155, ecol_AZ166, ecol_AZ167); ISApu2-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-klcA-ΔTn1721-IS26 (n = 1; ecol_542); IS26-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC-korC-IS26 (n = 1; ecol_545); hybridní prvky Tn2/Tn3 + ΔblaTEM-bla KPC-ΔTn1721 (n = 2; ecol_744, ecol_422), prvky Tn3-Δbla TEM-bla KPC- ΔTn1721 (n = 4; ecol_881, ecol_AZ151, ecol_AZ159, ecol_AZ150) a ΔTn3-Δ -ΔIS3000 (Tn3-like) (n = 1; ecol_AZ152). Kvůli omezením sestavy jsme nebyli schopni posoudit flankovací kontext bla KPC v ecol_452.

Tato zjevná rozmanitost nezávisle získaných MGE kolem genu bla KPC rozšiřuje způsoby, kterými může být bla KPC mobilizován. Je zajímavé, že jak bylo pozorováno dříve43 , všechny degradované sekvence Tn4401 v tomto souboru dat byly spojeny s variabilními úseky doprovodných sekvencí podobných Tn2/3, což naznačuje, že vložení Tn4401 do kontextu podobného Tn2/Tn3 mohlo umožnit, aby tento kontext fungoval jako hotspot pro vložení dalších MGE6. Zvláštní pozornost si zaslouží spojení s IS26, který je spojen s šířením několika dalších genů rezistence v E. coli, včetně CTX-M ESBL24, 44; je schopen zvýšit expresi těsně sousedících genů rezistence45; podílí se na tvorbě kointegrátů, a tedy na přestavbě plazmidů46; a zvyšuje výskyt dalších přenosů zprostředkovaných IS26 do plazmidů, které obsahují IS2646.

.