WWOX se nachází na dlouhém raménku chromozomu 16 ve známém křehkém místě. Skládá se z devíti exonů a má velikost >1 Mb.1 Kanonický transkript (ENST00000566780.5, NM_016373.3) kóduje všudypřítomný protein o velikosti 414 aminokyselin (aa) vysoce exprimovaný v prostatě, gonádách, prsu, plicích, endokrinních tkáních a mozku.21,22 Alternativní sestřih WWOX během zpracování prekurzorové messengerové RNA (pre-mRNA) vytváří osm transkriptů, které byly pozorovány pouze u nádorových onemocnění; zda je každá aberantní WWOX mRNA přeložena do proteinu, není známo.23 Oxidoreduktáza obsahující WW doménu je jediným proteinem, který spojuje dvě odlišné domény s vysokou homologií jak s rodinou WW domén, tak s nadrodinou SRD. WWOX v sobě ukrývá dvě WW domény na aminoterminálu, motiv jaderného lokalizačního signálu (NLS) a C-terminální krátkořetězcovou dehydrogenázovou reduktázovou doménu (SDR) (obr. 1b). V rámci domény SDR mezi aa 209 a aa 273 byl také mapován motiv mitochondriální cílové sekvence (MTS) (ref. 24). WWOX také obsahuje vazebné místo pro koenzym, NAD(H) nebo NADP(h) (GANSGIG, aa 131-137) a potenciální vazebné místo pro substrát (YNRSK, aa 293-297) (ref. 1). C-koncová doména WWOX (aa 125-414) je podobná interakční oblasti MAPT (http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZC7).

WWOX zárodečné patogenní varianty identifikované u pacientů s konstitučními poruchami souvisejícími s WWOX (SCAR12, syndrom WOREE a DSD). a Varianty počtu kopií (n = 12). DSD porucha pohlavního vývoje, IF in frame, OOF out of frame, WOREE epileptická encefalopatie související s WWOX. b Jednonukleotidové variace (n = 23). MTS mitochondriální cílová sekvence, NLS jaderný lokalizační signál, SRD reduktáza dehydrogenázy s krátkým řetězcem.

WWOX je tolerantní k missense variacím s missense constraint metrikou Z = -3,19 (Exome Aggregation Consortium).20 Mnoho heterozygotních CNV postihujících celý tento gen nebo jeho část je pozorováno u zdravých kontrolních vzorků (Database of Genomic Variants).25 Vysoký počet patogenních/pravděpodobně patogenních variací ve veřejných databázích není překvapivý vzhledem k autozomálně recesivnímu způsobu dědičnosti encefalopatie související s WWOX.

WWOX je exprimován ve vyvíjejícím se nervovém systému myší včetně mozkové kůry a mozečku od stádií in utero až do dospělosti.26 Zvířecí modely prokázaly epilepsii a ataxii způsobené ztrátou WWOX,3,27 což naznačuje neurodegenerativní proces. V podrobném přehledu literatury Aldaz a spolupracovníci jasně prokázali, že WWOX stojí na křižovatce rakoviny, metabolického syndromu a encefalopatie.28

Klinické a molekulární údaje všech pacientů z literatury s fenotypem SCAR12 nebo WOREE jsou popsány v doplňkové tabulce 3 (ref. 3,4,5,6,7,8,29,30). Další dva pacienty, sestry z příbuzenské arabské rodiny s homozygotní variantou WWOX (c.1228G>T; p.Gly410Cys), popsali v roce 2016 také Alkhateeb et al. (ref. 9), ale o patogenitě varianty identifikované v těchto případech existují pochybnosti. Oba se projevovali opožděnou řečí a jeden z nich měl od 2 let věku epilepsii. Klinický obraz v této rodině je ve srovnání se syndromem WOREE pozorovaným u pacientů s bialelickými zárodečnými patogenními variantami v genu WWOX velmi mírný. Tato změna glycinu na cystein v poloze 410 postihuje aminokyselinu na samém konci karboxylové koncové strany proteinu. Tato změna aminokyseliny je navíc přítomna v homozygotní formě u dvou jedinců v souboru dat gnomAD. Ačkoli in silico předpovědi hovoří ve prospěch patogenity této missense patogenní varianty (pravděpodobně poškozené PolyPhen-2), její kauzální role je v této rodině sporná. Proto jsme se rozhodli tyto pacienty z našeho literárního přehledu vyloučit.

Předkládáme zde zprávu o největší kohortě jedinců s fenotypem WOREE, kterou tvoří dalších 20 pacientů s bialelickými patogenními variantami v genu WWOX zděděnými po zdravých rodičích (doplňková tabulka 1). Molekulární diagnózy byly získány kombinací různých technik (array-CGH, qPCR/MLPA, cílené Sangerovo sekvenování, ES a WGS). Po agregaci našich pacientů se všemi případy dosud popsanými v literatuře je známo 37 pacientů z 27 rodin se syndromem WOREE a bialelickými patogenními variantami WWOX. Celkem bylo identifikováno 29 různých patogenních/pravděpodobně patogenních alel (10 CNV a 19 SNV) (obr. 1a, b). Introny 5 a 8 genu WWOX jsou velmi rozsáhlé a mají velikost 220, resp. 780 Kb. Pokrývají 90 % genomové sekvence genu WWOX a obsahují translokační zlomy pro mnohočetný myelom28 v souladu s tím, že velké intronické oblasti jsou často rekombinogenní a náchylné k chromozomálním zlomům. V souladu s tím jsou duplikace (jedna alela) a delece (pět alel) zahrnující exony 6 až 8 nejčastějšími patogenními CNV pozorovanými u pacientů s poruchami souvisejícími s WWOX (doplňkové tabulky 1 a 3). U všech pacientů z příbuzenských rodin (10/27; 37 %) byla zjištěna homozygotnost pro stejnou deleční alelu, což je běžný jev u autozomálně recesivních poruch s nízkou prevalencí. Vysoký podíl rodin s genotypem zahrnujícím jednu nebo dvě patogenní CNV (14/27; 52 %) zdůrazňuje potřebu kvantitativního přístupu ke screeningu lokusu WWOX u pacientů se závažnými poruchami centrálního nervového systému. U pacientů heterozygotních pro CNV postihující několik exonů je důležité pátrat po (1) možném složeném heterozygotním genotypu pro dvě malé CNV a nutnosti druhé kvantitativní analýzy pomocí MLPA nebo qPCR u obou rodičů a (2) SNV na druhé alele pomocí cíleného Sangerova sekvenování. Stejně tak při ES nebo cíleném panelovém sekvenování genů, které se provádí jako vyšetřování první linie, je nezbytné hledat CNV v tomto velkém genu náchylném k delecím a duplikacím, které zahrnují všechny jeho kódující sekvence nebo jejich část.

V této studii uvádíme osm nových patogenních missense variant (doplňková tabulka 2). Mezi výsledky vysokokapacitního sekvenování exomu a cíleného panelu genů jsou missense varianty WWOX četné. Jejich patogenitu je obtížné stanovit, protože WWOX má mnoho funkcí a proteinových partnerů. Řídili jsme se pokyny American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)31 pro interpretaci a anotaci missense variant v datech WWOX a klasifikovali je jako patogenní, pravděpodobně patogenní, varianty neznámého významu (VUS), pravděpodobně benigní nebo benigní. Abychom si usnadnili proces interpretace variant, použili jsme otevřeně dostupný online nástroj (http://www.medschool.umaryland.edu/Genetic_Variant_Interpretation_Tool1.html/) pro efektivní klasifikaci variant na základě kategorií důkazů uvedených v pokynech ACMG.31 Čtyři změny aa (p., p., p., p., p.) jsou spojeny in trans s nulovými variantami v genu, kde je ztráta funkce známým mechanismem onemocnění. Všechny missense varianty identifikované u jedinců s encefalopatií související s WWOX (11 aa změn ve 12 rodinách, doplňková tabulka 2) jsou podle kombinace webových softwarů předpovězeny jako způsobující onemocnění. Důležitější je, že žádná z nich není přítomna v homozygotním stavu v gnomAD.20 Všechny missense varianty jsou klasifikovány jako patogenní nebo pravděpodobně patogenní podle doporučení ACMG. Jeden pacient (P19) je nositelem tří různých patogenních missense variant: p.; (doplňková tabulka 1). Varianty p.(Lys200Glu) a p.(Thr358Ile) se nacházejí in cis; u obou aminokyselinových změn se předpokládá, že jsou pravděpodobně patogenní, ačkoli threonin na pozici 358 se nenachází ve známé funkční doméně. Není možné určit, zda jedna nebo obě tyto varianty jsou missense variantou způsobující onemocnění v P19. Ve většině zde uváděných a v lékařské literatuře publikovaných případů jsou sekvenční odchylky WWOX popsány na základní úrovni DNA. Všechny patogenní missense varianty kromě jedné (P3; str.) jsou interpretovány na základě studií in silico bez experimentálních důkazů (nebyla analyzována sekvence RNA nebo proteinu). U P3 analýza celkové RNA pomocí Sangerova sekvenování produktů reverzní transkripční PCR (RT-PCR) nezjistila v leukocytech žádnou sestřihovou anomálii. U ostatních pacientů nebyly studie RNA provedeny, protože v době molekulární diagnózy nebyly k dispozici vhodné vzorky krve. Exonické SNV mohly ovlivnit fyziologická akceptorová/donorová místa sestřihu, ale také exonický zesilovač sestřihu (ESE) a exonický zeslabovač sestřihu (ESS). Aktivace kryptických sestřihových míst pomocí SNV je navíc dobře pochopeným patologickým mechanismem u mnoha genetických poruch; dobrým příkladem je Hutchinson-Gilfordův progeriový syndrom.32 Missense varianty by také mohly mít vliv na stabilitu mRNA.33 Až 10 % známých missense variant souvisejících s onemocněním, ale pouze 3 % běžných SNP, mění sestřih pre-mRNA.33 Je pravděpodobné, že část předpokládaných missense variant identifikovaných u pacientů s encefalopatií související s WWOX vede ke ztrátě exprese v důsledku abnormálního sestřihu. To je o to pravděpodobnější u genu s patogenními alelami se ztrátou funkce. U patogenních missense variant v doméně SRD je vzhledem k absenci identifikovaných substrátů obtížné vyhodnotit jejich vliv na katalytickou aktivitu WWOX. Charakterizace knock-in zvířecích modelů, jako jsou zebřičky, by poskytla vodítka o patogenitě missense variant WWOX.

U jednoho pacienta, který nebyl zahrnut do této studie, bylo původně vysloveno podezření na molekulární diagnózu encefalopatie související s WWOX před bialelickým genotypem sestávajícím ze dvou SNV in trans: nonsense (ENST00000566780.5:p.Gln72*) a missense varianty (ENST00000402655:c.600T>A, p.Ser200Arg). Změna aa na pozici 200 se týká pouze proteinu WWOX, který není z databáze RefSeq a má 311 zbytků. Dosud byly všechny patogenní změny aa popsány podle kanonického proteinu WWOX (414 aa), který vzniká překladem 9-exonového transkriptu (ENST00000566780.5, izoforma 1). Není známo, zda je izoforma proteinu WWOX složená z 311 zbytků relevantní pro poruchy související s WWOX. Fenotyp u tohoto pacienta byl navíc ve srovnání se syndromem WOREE mírný. Z těchto důvodů jsme se rozhodli nepovažovat tento genotyp za příčinu encefalopatie u tohoto pacienta.

WWOX, rakovina a plicní onemocnění?

WWOX je tumor supresorový gen, který se podílí na modulaci drah souvisejících s rakovinou prostřednictvím protein-proteinových interakcí mezi doménami WW a různými onkogenními proteiny. Ztráta proteinu WWOX byla zjištěna u mnoha neoplazií.23 U myší Wwox-/- jsou pozorovány osteosarkomy a karcinomy plic22 a tumorigeneze je jedním z důsledků hypomorfního genotypu Wwox.34 Funkční ztráta kopie CNV (67048) v genu WWOX byla významně spojena se zvýšeným rizikem rakoviny u čínské populace.35,36,37 Nedávno bylo prokázáno, že ztráta exprese WWOX v myších plicích způsobuje neutrofilní zánět.38 Překvapivě nebylo nikdy zaznamenáno zvýšení počtu případů rakoviny ani u pacientů s bialelickými zárodečnými patogenními variantami WWOX, ani u jejich heterozygotních rodičů. Závažnost syndromu WOREE s vysokou frekvencí předčasných úmrtí v prvních letech života by mohla vysvětlovat absenci jakýchkoli případů rakoviny. U pacientů heterozygotních pro nulovou alelu WWOX to není přesvědčivé vysvětlení. Ablace Wwox není tumorigenní u všech knockoutovaných zvířecích modelů; tento domnělý tumor supresorový gen má spíše význam při progresi nádoru než při jeho iniciaci během onkogeneze. Tato studie potvrzuje, že zárodečné změny WWOX nejsou hybnou patogenní variantou důležitou pro iniciaci a/nebo progresi rakoviny.

WWOX a DSD

WWOX je vysoce exprimován v hormonálně regulovaných tkáních, jako je hypofýza, varlata a vaječníky, a předpokládá se, že hraje roli v biosyntéze gonadotropinů nebo pohlavních steroidů.1,39 Předpokládá se, že enzymatická doména SRD v WWOX hraje roli v metabolismu steroidů s dosud neidentifikovanými substráty. Tato pozorování a popis dvou různých modelů WWOX knockoutovaných myší s gonadálními abnormalitami34,39 jasně podporují roli WWOX ve vývoji gonád.

První zárodečná přestavba WWOX u člověka byla spojena s 46, XY DSD.2 Pacient měl bilaterální nediferencovanou gonadální tkáň a nezralá varlata. Byl heterozygotem pro deleci exonů 6 až 8 zděděnou po matce, která měla v osobní anamnéze pozdní menarché. Předpokládá se, že tato CNV má za následek in-frame deleci, což způsobuje zkrácení produktu, v němž z velké části chybí doména SRD. Nedávno byly pomocí ES identifikovány tři heterozygotní VUS v genu WWOX u pacientů s DSD (obr. 1) (ref. 40). Pokud je nám známo, DSD nebyl zaznamenán u heterozygotních rodičů pacientů se syndromem WOREE a domníváme se, že implikace heterozygotních SNV/CNV v molekulární etiologii DSD je sporná. Atrofie varlat, snížená plodnost, gonadální abnormality, dysfunkce Leydigových buněk a porucha vývoje mléčné žlázy jsou součástí fenotypů pozorovaných u několika zvířecích modelů ablace WWOX.28 Pokud je nám známo, u heterozygotních knockoutovaných zvířecích modelů nebyl DSD zaznamenán. Zůstává však možnost, že po pečlivém vyhodnocení vývoje pohlaví a funkce gonád u pacientů heterozygotních pro patogenní variantu WWOX by mohl být identifikován mírnější fenotyp.

Fenotyp SCAR12

V roce 2014 byly pomocí ES identifikovány homozygotní missense patogenní varianty WWOX u šesti pacientů ze dvou příbuzenských rodin s autozomálně recesivní spinocerebelární ataxií (SCAR12). V dalších rodinách zatím tato asociace nebyla potvrzena. Postižení pacienti se v dětském věku projevovali cerebelární ataxií, generalizovanou tonicko-klonickou epilepsií, mentálním postižením a výraznou spasticitou.3 Ve srovnání s pacienty se syndromem WOREE mají pacienti s fenotypem SCAR12 méně závažné vývojové opoždění: všichni byli schopni chodit (4/4; 100 %), 3 ze 4 byli schopni mluvit a nebylo zaznamenáno žádné předčasné úmrtí. Pokud byla provedena magnetická rezonance mozku, prokázala u postižených pacientů mírnou hypoplazii mozečku (2/2; 100 %), což v naší kohortě nebylo pozorováno. Ačkoli epilepsie byla u pacientů s SCAR12 konstantním rysem, záchvaty častěji reagovaly na antiepileptika (2/4; 50 %). Postižení očí bylo rovněž přítomno, u čtyř pacientů byl hlášen nystagmus. Tato forma autozomálně recesivní cerebelární ataxie související s WWOX se zdá být vzácným genetickým onemocněním. Za závažností fenotypu WOREE a předčasným úmrtím u části pacientů se mohou skrývat problémy s rovnováhou související s mozečkovou dysfunkcí. K potvrzení podílu WWOX na této neurologické poruše jsou zapotřebí další případy cerebelární ataxie.

Fenotyp WWEE

Brzy po popisu fenotypu SCAR12 se WWOX podílela na recesivní formě dětské epileptické encefalopatie u 17 pacientů z 9 rodin.4,5,6,7,8,9,30 Počet případů jsme více než zdvojnásobili s 20 postiženými pacienty z 18 dalších rodin. Fenotyp našich pacientů je v souladu s předchozími zprávami. V naší kohortě jsme pozorovali nižší míru příbuznosti v souladu s vyšším podílem složených heterozygotních genotypů popsaných v této studii. Tyto genotypy mohly být dříve při samostatném provádění array-CGH nebo vysokokapacitního sekvenování přehlédnuty. Zavedení predikce CNV z dat exomových sekvencí usnadňuje identifikaci pacientů s genotypy WWOX složenými jak ze SNV, tak z CNV.

V roce 2015 byl hlášen jeden plod s mozkovými anomáliemi a možnými intrauterinními záchvaty (ref. 7). V našem souboru byly příležitostně hlášeny snížené pohyby plodu (3/20), zatímco v předchozích zprávách byla nejčastějším znakem během těhotenství zvýšená nuchální translucence (4/17). Kontraktury rukou a nohou byly hlášeny u 5 pacientů v našem souboru a u 3 pacientů z literatury4,5,6 v prenatálním nebo novorozeneckém období. Snížené pohyby plodu, zvýšená nuchální translucence a anomálie rukou nebo nohou by mohly být prenatálními příznaky onemocnění, ale nejsou specifické ani časté klinické znaky.

Na rozdíl od literatury nebyla růstová retardace (6 %) a mikrocefalie (20 %) výraznými znaky u našich pacientů, kteří měli normální nízkou průměrnou výšku (-1,1 SD) a průměrnou OFC (-1,4 SD). Dysmorfismus byl zaznamenán u více než poloviny pacientů. Nejvýraznějšími rysy byly kulatý obličej s plnými tvářemi, krátký krk a hypotonický vzhled obličeje (obr. 2). U pacientů P15 a P16 v pozdějším věku byla hypotonie obličeje stále přítomna, ale obličej se stal více trojúhelníkovým. Dalšími zdravotními problémy byly skolióza nebo kyfóza s časným začátkem (65 %), které by mohly být vodítkem pro stanovení diagnózy, a také potíže s krmením vyžadující výživovou sondu u 70 % pacientů a respirační problémy (40 %), které se vyskytují u jiných dětských encefalopatií.

Všichni pacienti měli závažné opoždění vývoje. Žádný z nich nebyl schopen sedět, mluvit ani chodit. Neurologické vyšetření prokázalo u většiny pacientů axiální hypotonii a distální hypertonii. Příležitostně byly pozorovány dystonické pohyby. Jak se uvádí v literatuře, všichni pacienti měli časnou epilepsii (100 %) s každodenními záchvaty a ve většině případů (95 %) byla pozorována rezistence na léky. Nebyla zjištěna žádná větší náchylnost k febrilním záchvatům. Westův syndrom charakterizovaný křečemi a hypsarytmií zaznamenanou na EEG byl zaznamenán u 26 % pacientů. Byly pozorovány fokální, generalizované a kombinované záchvaty. Byly popsány tonické, klonické, tonicko-klonické a myoklonické záchvaty, stejně jako infantilní křeče a absence. Epilepsie tedy byla velmi závažná, s časným začátkem a s variabilními záchvatovými mainfestacemi. Jak již bylo popsáno dříve, poruchy zraku se zdají být součástí klinického spektra WOREE syndromu. Většina postižených pacientů neměla oční kontakt (75 %). Přibližně polovina z nich měla změněný fundus oculi (47 %) a/nebo elektrodiagnostické testy (45 %) naznačující atrofii optiku a/nebo dystrofii sítnice. Časné oftalmologické vyšetření tedy může poskytnout diagnostické vodítko u pacientů s časnými záchvaty a opožděným vývojem. Magnetická rezonance mozku (obr. 3) byla abnormální u 80 % pacientů, především prokazovala hypoplazii corpus callosum (75 %) a mozkovou atrofii (55 %). V našem souboru jsme potvrdili, že předčasná smrt je rysem WOREE syndromu, který se vyskytl u osmi pacientů (40 %) s průměrným věkem při úmrtí 40 měsíců. Závažnost epilepsie a neurologické postižení mohou souviset s předčasným úmrtím u postižených pacientů.

Magnetická rezonance mozku (MRI) u jedinců se syndromem epileptické encefalopatie související s WWOX (WOREE). a-j Hypoplastické corpus callosum v sagitální rovině. k-q Mozková atrofie a zvětšené subarachnoidální prostory v axiální rovině (P4, P6, P14) a koronální rovině (P3, P7, P17). r-t Symetrická hypersignální bílá hmota na axiální rovině T2. u-v Plagiocefalie a asymetrická laterální komora na axiální rovině T2. w P19 sagitální T1 kruhové léze (hyposignální) mediální části corpus callosum. m měsíc, P pacient, y rok věku.

Hlavní klinické příznaky u dříve publikovaných pacientů s WOREE jsou shrnuty v doplňkové tabulce 4. Z tohoto přehledu vyplývá, že WOREE je velmi závažná epileptická encefalopatie charakterizovaná špatnou spontánní pohyblivostí, absencí vývoje jazyka a osvojení chůze, časným nástupem záchvatů rezistentních na léky, oftalmologickým postižením a vysokou pravděpodobností předčasného úmrtí. Dysmorfní rysy (kulatý hypotonický obličej, plné tváře a krátký krk) a deformita páteře mohou být časnými přidruženými znaky, které mohou podpořit diagnózu.

Korelace fenotyp/genotyp

Korelace fenotyp/genotyp byly nedávno navrženy pro neurovývojové poruchy související s WWOX5,7 s klasifikací genotypů WWOX do tří skupin. Podle této předběžné klasifikace měli pacienti nesoucí dvě předpokládané nulové alely větší pravděpodobnost výskytu nejzávažnějšího fenotypu WOREE, zatímco hypomorfní genotypy se dvěma missense variantami by naopak vedly ke spinocerebelární ataxii (SCAR12). Fenotyp pacientů nesoucích nulovou alelu a patogenní missense variantu by byl střední.5 Naše rozsáhlá studie poskytuje přehodnocení těchto předběžných korelací.

Nejzávažnější klinický obraz se zdá být spojen s genotypy sestávajícími z časných předčasných stop kodonů odpovídajících úplnému vyřazení WWOX. Tyto genotypy se vyskytují u sedmi pacientů: homozygotní delece exonu 1 až 4 v P10, homozygotní stop kodony p.(Arg54*) a p.(Trp44*),4,30 homozygotní delece prvních šesti exonů.7 K předčasnému úmrtí před druhým rokem došlo v 5/7 případů a v jedné rodině byly prenatálně zjištěny mozkové anomálie. Navíc předčasné úmrtí nebylo nikdy popsáno u pacientů s missense patogenní variantou pouze genotypu (doplňkové tabulky 1 a 3). Přesná charakterizace missense variant a CNV na úrovni proteinů pomocí funkčních studií může poskytnout určité vodítko k tomu, jak by genotypy mohly vysvětlit různé klinické prezentace, zejména pokud jde o fenotypy SCAR12/WOREE.

Závěrem lze říci, že zárodečné patogenní varianty v genu WWOX jsou jednoznačně spojeny s těžkou epileptickou encefalopatií s časným nástupem nazývanou syndrom WOREE a že zde podáváme zprávu o největší kohortě jedinců s touto neurologickou poruchou. Implikace konstitučních variant WWOX u DSD a SCA stále vyžaduje replikační studie.